分子發(fā)光熒光磷光及化學(xué)發(fā)光

1關(guān)于分子發(fā)光熒光磷光及化學(xué)發(fā)光23.光分析方法光分析法原子吸收法紅外法原子發(fā)射法核磁法熒光磷光化學(xué)發(fā)光紫外可見法分子光譜原子光譜第2頁,共105頁，2024年2月25日，星期天3第六章分子發(fā)光—熒光、磷光及化學(xué)發(fā)光ChapterSixFluorescencePhosphorescenceandChemiluminescence第3頁,共105頁，2024年2月25日，星期天4分子發(fā)光—熒光、磷光及化學(xué)發(fā)光

FluorescencePhosphorescenceandchemiluminescence6.1分子發(fā)光的基本原理6.2分子熒光和磷光的影響因素6.3熒光（磷光）分光光度計(jì)6.４熒光分析法的應(yīng)用6.５化學(xué)發(fā)光分析法第4頁,共105頁，2024年2月25日，星期天5第一次記錄熒光現(xiàn)象的是16世紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes，1575年他提到在含有一種稱為“LignumNephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛的天藍(lán)色。直到1852年，Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光光度計(jì)觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍微長些，才判斷這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦石“螢石”推演而提出“熒光”這一術(shù)語。1867年，Goppelsroder進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁—桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁的測定。19世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠肉眼進(jìn)行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一臺熒光計(jì)。6.1分子發(fā)光的基本原理第5頁,共105頁，2024年2月25日，星期天

分子光譜的產(chǎn)生1．分子的能級Ｓ2Ｓ1Ｓ0υ0υ1υ2υ,0υ,1υ,21J023J0231J0231J0231分子紫外吸收光譜分子可見吸收光譜分子紅外吸收光譜分子光譜：連續(xù)光譜帶光譜遠(yuǎn)紅外光譜中紅外光譜紫外-可見光譜第6頁,共105頁，2024年2月25日，星期天分子的活化與去活化S0S1T1S2紫外可見吸收光譜外轉(zhuǎn)移紫外可見共振熒光光譜內(nèi)轉(zhuǎn)移熒光系間竄躍磷光反系間竄躍遲滯熒光振動弛豫２.無輻射躍遷的類型振動弛豫:Vr10-12sec外轉(zhuǎn)移:無輻射躍遷回到基態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)移:S2~S1能級之間有重疊系間竄躍:

S2~T1能級之間有重疊反系間竄躍:由外部獲取能量后T1~

S2１.輻射躍遷的類型共振熒光：10-12sec熒光：10-8sec磷光：10~10-4sec遲滯熒光:102~10-4sec第7頁,共105頁，2024年2月25日，星期天8２.單重態(tài)與三重態(tài)受激有機(jī)分子的電子激發(fā)態(tài)可以歸納為兩種狀態(tài)：基態(tài)激發(fā)態(tài)單重態(tài)激發(fā)態(tài)三重態(tài)激發(fā)態(tài)平均壽命

10-8sec激發(fā)態(tài)平均壽命10-4~1secS0S0S0S1T1第8頁,共105頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共105頁，2024年2月25日，星期天分子的活化與去活化S0S1T1S2紫外可見吸收光譜外轉(zhuǎn)移紫外可見共振熒光光譜內(nèi)轉(zhuǎn)移熒光系間竄躍磷光反系間竄躍遲滯熒光振動弛豫２.無輻射躍遷的類型振動弛豫:Vr10-12sec外轉(zhuǎn)移:無輻射躍遷回到基態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)移:S2~S1能級之間有重疊系間竄躍:

S2~T1能級之間有重疊反系間竄躍:由外部獲取能量后T1~

S2１.輻射躍遷的類型共振熒光：10-12sec熒光：10-8sec磷光：1~10-4sec遲滯熒光:102~10-4sec第10頁,共105頁，2024年2月25日，星期天11３．振動弛豫

當(dāng)分子吸收光輻射后可能從基態(tài)的最低振動能層躍遷到激發(fā)態(tài)的較高的振動能層上去．然而，在液相或壓力足夠高的氣相中分子間碰撞的幾率很大，激發(fā)態(tài)分子可能將過剩的振動能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，而自身從高振動能層失活到該電子能級的最低振動能層上，這一過程稱為振動弛豫．發(fā)生振動弛豫的時(shí)間為10-12s數(shù)量級．第11頁,共105頁，2024年2月25日，星期天12４．內(nèi)轉(zhuǎn)換

內(nèi)轉(zhuǎn)換指的是相同多重度等能態(tài)間的一種無輻射躍遷過程．當(dāng)兩個(gè)電子能級的振動能層間有重疊時(shí)，則可能發(fā)生電子由高能層以無輻射躍遷方式躍遷到低能層的電子的激發(fā)態(tài)．內(nèi)轉(zhuǎn)換過程在10-13~10-11s時(shí)間內(nèi)發(fā)生，它通常要比由高激發(fā)態(tài)直接發(fā)射光子的速度快得多．第12頁,共105頁，2024年2月25日，星期天13５．外轉(zhuǎn)換

激發(fā)分子通過與溶劑或其他溶質(zhì)間的相互作用和能量轉(zhuǎn)換而使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失的過程稱外轉(zhuǎn)換．這一現(xiàn)象稱為“熄滅”或“猝滅”．自較低的激發(fā)單重態(tài)及較低的三重態(tài)的非輻射躍遷可包含外轉(zhuǎn)換，也可包含內(nèi)轉(zhuǎn)換．第13頁,共105頁，2024年2月25日，星期天14６．系間跨躍系間跨越指的是不同多重度狀態(tài)間的一種無輻射躍遷過程．它涉及受激電子自旋狀態(tài)的改變．如S1到T1，使原來兩個(gè)自旋配對的電子不再配對．這種躍遷是禁阻的，但如果兩個(gè)電子能態(tài)的振動能層有較大的重疊時(shí)，如圖中激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動能層與激發(fā)三重態(tài)T1的較高振動能層重疊，則可能通過自旋－軌道耦合等作用使S1態(tài)轉(zhuǎn)入T1態(tài)的某一振動能層．第14頁,共105頁，2024年2月25日，星期天15７．熒光、磷光發(fā)射從單重態(tài)到三重態(tài)的分子系間跨越躍遷發(fā)生后，接著發(fā)生快速的振動弛豫而到達(dá)三重態(tài)的最低振動能層上，當(dāng)沒有其他過程同它競爭時(shí)，在10-4~10s左右時(shí)間內(nèi)躍遷回基態(tài)而發(fā)生磷光．由此可見，熒光與磷光的根本區(qū)別是：熒光是由第一電子激發(fā)單重態(tài)最低振動能層至基態(tài)各振動能層的躍遷產(chǎn)生的，而磷光是由第一電子激發(fā)三重態(tài)的最低振動能層至基態(tài)各振動能層間躍遷產(chǎn)生的．第15頁,共105頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共105頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共105頁，2024年2月25日，星期天181.分子熒光與磷光的產(chǎn)生（1）單重態(tài)與三重態(tài)（2）分子的活化與去活化（3）分子發(fā)光的類型按激發(fā)的模式分類：按分子激發(fā)態(tài)的類型分類：光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光/生物發(fā)光熱致發(fā)光場致發(fā)光摩擦發(fā)光

分子發(fā)光分子發(fā)光熒光磷光瞬時(shí)熒光遲滯熒光按光子能量分類：斯托克斯熒光(Stokes)：λex<λem反斯托克斯熒光(Antistokes)：λex>λem共振熒光(Resonance)：λex=λem

熒光

第18頁,共105頁，2024年2月25日，星期天192.分子熒光(磷光)光譜(1)熒光(磷光)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜熒光(磷光)均為光致發(fā)光，在光輻射的作用下，熒光物質(zhì)發(fā)射出不同波長的熒光。a.激發(fā)光譜固定

em=620nm(Max)

ex=290nm(Max)固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長熒光激發(fā)光譜與紫外-可見吸收光譜類似第19頁,共105頁，2024年2月25日，星期天

ex=290nm(MAX)固定

em=620nm(Max)固定

ex=290nm(Max)

em=620nm(MAX)b.發(fā)射光譜(熒光光譜)固定激發(fā)波長掃描發(fā)射波長c.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關(guān)系S04321S14321發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)：分子的激發(fā)光譜可能含有幾個(gè)激發(fā)帶，但發(fā)射光譜只含一個(gè)發(fā)射帶；即使分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)，由于經(jīng)過極快的內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫降到S1電子態(tài)的最低振動、轉(zhuǎn)動能級，然后以輻射形式釋放能量回到基態(tài)。1→

41→

31→21→11→11→

21→

31→

4第20頁,共105頁，2024年2月25日，星期天d.磷光光譜與發(fā)射光譜相同條件下的磷光光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜第21頁,共105頁，2024年2月25日，星期天22第22頁,共105頁，2024年2月25日，星期天23第23頁,共105頁，2024年2月25日，星期天24（2）三維熒光光譜IF

∝f(λex

、λem)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長、掃描激發(fā)波長第24頁,共105頁，2024年2月25日，星期天25IF

∝f(λex

、λem)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長、掃描發(fā)射波長第25頁,共105頁，2024年2月25日，星期天26蒽的三維等高線光譜圖第26頁,共105頁，2024年2月25日，星期天27蒽的三維等熒光強(qiáng)度光譜第27頁,共105頁，2024年2月25日，星期天VB1和VB2的三維熒光光譜第28頁,共105頁，2024年2月25日，星期天RLSDSTSATSADS散射片三維共振光散射光譜（3）三維共振光散射光譜ADSATSTSRLSDS散射片三維共振光散射等高線光譜圖共振光散射瑞利散射固定

ex=270nm拉曼光二級共振光散射三級共振光散射熒光光譜有用區(qū)間第29頁,共105頁，2024年2月25日，星期天3.分子熒光(磷光)強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系（1）熒光強(qiáng)度(磷光)與濃度的關(guān)系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)為：熒光強(qiáng)度（IF）與相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)成正比：按照級數(shù)展開式：第30頁,共105頁，2024年2月25日，星期天對于稀溶液，當(dāng)

bc<0.05（磷光

bc<0.01）時(shí)：IF----熒光強(qiáng)度

F-----熒光量子產(chǎn)率k--與儀器靈敏度有關(guān)的參數(shù)I0--入射光強(qiáng)度IP----磷光強(qiáng)度

P-----磷光量子產(chǎn)率b--吸收光程

--摩爾吸光系數(shù)C--熒光物質(zhì)濃度（2）熒光(磷光)的平均壽命

分子在激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間或者說處于激發(fā)態(tài)的分子數(shù)目衰減到原來的1/e所經(jīng)歷的時(shí)間。對于處于S1(T1)電子態(tài)的熒光體來說，其平均壽命()可以右式表示：kF

熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)ki

非輻射躍遷速率常數(shù)

第31頁,共105頁，2024年2月25日，星期天（3）熒光(磷光)的量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率的定義：kF、kp主要取決與熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)；

st系間竄躍效率。

ki主要取決化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。大多數(shù)的熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率在0.1~1之間；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，

F=0.55；

熒光素

F=1化合物

F0.10.290.460.600.52第32頁,共105頁，2024年2月25日，星期天（1）躍遷的類型２．熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)對于有機(jī)熒光物質(zhì):提供π軌道，有不飽和官能團(tuán)π*

→π

π*→nn→π*εmax＜

100平均壽命10-5~10-7secπ→π*

εmax≥104平均壽命10-7~10-9seckS→T小π*→π

是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。強(qiáng)熒光的有機(jī)化合物具備下特征:ａ．具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)（孤立雙鍵不呈現(xiàn)顯著熒光）ｂ．具有剛性的平面結(jié)構(gòu)ｃ．具有最低的單重電子激發(fā)態(tài)S1，躍遷為π*

→π型ｄ．取代基團(tuán)為給電子取代基6.２分子熒光與磷光強(qiáng)度的影響因素１．熒光的量子產(chǎn)率第33頁,共105頁，2024年2月25日，星期天（2）共軛效應(yīng)

產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生?；衔锉捷凛於∈∥焓ˇ薳xmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640

F0.10.290.460.600.52熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，有利于熒光發(fā)射。（3）剛性平面結(jié)構(gòu)芴聯(lián)苯

F=1

F=0.2第34頁,共105頁，2024年2月25日，星期天不產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光

F=0.92萘VA

F(萘)=5

F(VA)

熒光黃酚酞偶氮菲偶氮苯第35頁,共105頁，2024年2月25日，星期天ａ．給電子取代基加強(qiáng)熒光（4）取代基效應(yīng)—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產(chǎn)生

p→π共軛化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相對熒光強(qiáng)度10

18

20

20

20ｂ．得電子取代基減弱熒光、加強(qiáng)磷光二苯甲酮：弱熒光、強(qiáng)磷光S1→T1的系間竄躍產(chǎn)率接近1—C=0，—COOH，—NO2不產(chǎn)生p→π共軛硝基苯：不產(chǎn)生熒光、弱磷光第36頁,共105頁，2024年2月25日，星期天ｃ．取代基的位置空間位阻對熒光發(fā)射的影響

F=0.75

F=0.03反式二苯乙烯強(qiáng)熒光物質(zhì)立體異構(gòu)體對熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質(zhì)OH-H+電離效應(yīng)對熒光發(fā)射的影響pH=1,有熒光pH=13,無熒光第37頁,共105頁，2024年2月25日，星期天空間位阻對熒光發(fā)射的影響ｃ．取代基的位置反式二苯乙烯強(qiáng)熒光物質(zhì)

F=0.75

F=0.03立體異構(gòu)體對熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質(zhì)電離效應(yīng)對熒光發(fā)射的影響OH-H+OH-H+pH=1,有熒光pH=13,無熒光無熒光有熒光第38頁,共105頁，2024年2月25日，星期天含有重原子的溶劑，由于重原子效應(yīng)熒光減弱、磷光增強(qiáng)。（5）重原子取代基效應(yīng)—Cl，—Br，—IS1→T1的系間竄躍由于重原子的存在增強(qiáng)化合物萘1-甲基萘1-氟萘1-氯萘1-溴萘1-碘萘λFmax(nm)315318316319320~λPmax(nm)470476473483484488

P/

F0.0930.0530.0685.26.4>1000τF

(s)2.62.51.40.230.0140.0023（6）溶劑效應(yīng)藍(lán)移:△

En→π*

＜△

En→π*

紅移:

△

Eπ→π*

＞△

Eπ→π*

在極性溶劑中：無溶劑化作用有溶劑化作用第39頁,共105頁，2024年2月25日，星期天３．金屬螯合物的熒光（1）螯合物中配位體的發(fā)光（2）螯合物中金屬離子的發(fā)光8-羥基喹啉弱熒光8-羥基喹啉-Zn螯合物黃綠色強(qiáng)熒光2,2`-二羥基偶氮苯無熒光2,2`-二羥基偶氮苯-Al螯合物強(qiáng)熒光T1系間竄躍S0S1d*、f*d*→

df*→

f熒光分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移第40頁,共105頁，2024年2月25日，星期天４．熒光的熄滅（1）碰撞熄滅熒光熄滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象。熒光熄滅劑：這些溶劑分子或其它溶質(zhì)分子稱為熒光熄滅劑。相對速率

1K1[M*]K2[M*][Q]與分子的直徑、粘度、溫度等因素有關(guān)。（2）能量轉(zhuǎn)移熄滅再吸收過程：共振能量轉(zhuǎn)移：分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移：hv激發(fā)發(fā)射熄滅第41頁,共105頁，2024年2月25日，星期天（3）氧的熄滅作用氧分子是熒光、磷光的熄滅劑（4）自熄滅與自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度大于1g/L時(shí)，常發(fā)生熒光的自熄滅(濃度熄滅)自吸收：沒有除氧，溶液中難以觀察到磷光由于

F<1，使熒光強(qiáng)度減弱或消失.形成二聚體：由于二聚體不發(fā)熒光，或發(fā)射熒光的能量有改變，造成自熄滅現(xiàn)象。第42頁,共105頁，2024年2月25日，星期天6.３熒光(磷光)分光光度計(jì)１．主要組成及部件的功能熒光分光光度計(jì)工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器比較熒光分光光度計(jì)與紫外－可見分光光度計(jì)的異同點(diǎn)。第43頁,共105頁，2024年2月25日，星期天２．光源（1）光源的要求：發(fā)射強(qiáng)度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強(qiáng)度隨波長的變化小有足夠長的使用壽命（2）氙燈光源常用氣體放電燈類型：

氙燈光源高壓汞光源波長范圍：200~1000nm工作壓力：5~20atm啟動電壓：20~40KV使用壽命：1000~2000h最廣泛應(yīng)用的連續(xù)光源：

發(fā)射波長范圍寬發(fā)射光強(qiáng)度大第44頁,共105頁，2024年2月25日，星期天（3）高壓汞燈光源應(yīng)用廣泛的線光源：253.7296.5302.2312.6313.2365.0365.5366.3404.7435.8546.1557.0579.0(nm)光源樣品池激發(fā)濾光片檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射濾光片第45頁,共105頁，2024年2月25日，星期天461激發(fā)光源熒光測量中所用激發(fā)光源一般比吸收測量中的光源強(qiáng)度大，通常采用汞弧燈、氫燈或氙燈．

2濾光器和單色器在熒光計(jì)中使用濾光片．大多數(shù)熒光分光光度計(jì)都采用光柵單色器．一般帶有兩個(gè)單色器，一是激發(fā)單色器，其作用是獲得單色性好的激發(fā)光，以激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光；一是發(fā)射單色器，其作用在于分出某一波長的熒光，以減少干擾．第46頁,共105頁，2024年2月25日，星期天47

3檢測器熒光的強(qiáng)度很弱，因此要求檢測器有較高的靈敏度．一般用光電管或光電倍增管作光電元件。

4試樣液池?zé)晒鉁y量用的液池通常用石英制成，形狀以正方形或長方形為宜，也有用圓形的。第47頁,共105頁，2024年2月25日，星期天48熒光強(qiáng)度與透過光強(qiáng)度相比小得多，因此在測量熒光時(shí)必須嚴(yán)格消除透過光的影響。在測量熒光的儀器中，是在與入射光和透過光相垂直的方向上來測量熒光。利用這類儀器可方便地獲得熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜。熒光激發(fā)光譜主要用于選擇激發(fā)光波長。第48頁,共105頁，2024年2月25日，星期天３．單色器平面衍射光柵線色散率聚光本領(lǐng)分辨率４.檢測器光電倍增管放大倍數(shù)：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109５.樣品池：液池、熒光池ａ.

樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池一樣ｂ.吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池兩面透光

熒光分光光度計(jì)的樣品池四面透光波長范圍ｃ.使用注意事項(xiàng)容易破碎沾污問題閃躍特性比較：熒光分光光度計(jì)的樣品池與紫外－可見分光光度計(jì)的吸收池有什么區(qū)別。第49頁,共105頁，2024年2月25日，星期天50熒光定性和定量分析1．熒光分析法的特點(diǎn)（1）靈敏度高與紫外-可見分光光度法比較，熒光是從入射光的直角方向檢測，即在黑背景下檢測熒光的發(fā)射。（2）選擇性強(qiáng)熒光法既能依據(jù)特征發(fā)射，又能依據(jù)特征吸收來鑒定物質(zhì)。（3）試樣量少和方法簡便。第50頁,共105頁，2024年2月25日，星期天51（4）提供比較多的物理參數(shù)．

熒光分析法的缺點(diǎn)是它的應(yīng)用范圍還不夠廣泛．另一方面，由于熒光分析的靈敏度高，測定時(shí)對環(huán)境因素敏感，干擾因素也較多．目前熒光分析大多用于定量測定．第51頁,共105頁，2024年2月25日，星期天52應(yīng)用熒光光譜法主要應(yīng)用于元素的熒光測定。以形成熒光配合物進(jìn)行熒光分析的元素目前已達(dá)60余種，其中鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂以及某些稀土元素常用熒光法進(jìn)行測定．可采用熒光猝滅法測定的元素有氟、硫、氰離子、鐵、銀、鈷、鎳等。第52頁,共105頁，2024年2月25日，星期天玻璃濾光片的透射率干涉濾光片的透射率截止涉濾光片的透射率第53頁,共105頁，2024年2月25日，星期天360nm2.25mm玻璃的透射性質(zhì)第54頁,共105頁，2024年2月25日，星期天石英的透射性質(zhì)200nm2.5mm第55頁,共105頁，2024年2月25日，星期天６.磷光分光光度計(jì)（1）光學(xué)系統(tǒng)與熒光分光光度計(jì)的區(qū)別：切光器光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器切光器（斬波器）共振熒光：10-12sec熒光：10-8sec磷光：10~10-4sec遲滯熒光：100~10-4sec（2）樣品池與熒光分光光度計(jì)的區(qū)別通常情況下，樣品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，來測定低溫磷光。磷光鏡遮斷激發(fā)光

--測磷光磷光鏡不遮斷激發(fā)光

--磷光+熒光第56頁,共105頁，2024年2月25日，星期天紫外-可見分光光度計(jì)主要組成及部件的功能光源碘鎢燈氘燈單色器測量池參比池樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理和儀器控制光源樣品池單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制第57頁,共105頁，2024年2月25日，星期天

熒光(磷光)分光光度計(jì)

主要組成及部件的功能熒光分光光度計(jì)工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器比較熒光分光光度計(jì)與紫外－可見分光光度計(jì)的異同點(diǎn)。第58頁,共105頁，2024年2月25日，星期天紫外-可見分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光分光光度計(jì):光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器磷光分光光度計(jì)：切光器第59頁,共105頁，2024年2月25日，星期天磷光分光光度計(jì)：切光器光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器切光器（斬波器）磷光鏡遮斷激發(fā)光：測磷光磷光鏡不遮斷激發(fā)光：磷光+熒光第60頁,共105頁，2024年2月25日，星期天可拆卸圓形測量池兩面透光圓形測量池兩面透光1cm長方形測量池兩面透光氣體測量池兩面透光微量測量池兩面透光流動測量池兩面透光紫外-可見分光光度計(jì)測量池(吸收池)第61頁,共105頁，2024年2月25日，星期天紫外-可見分光光度計(jì)

測量池(吸收池)熒光分光光度計(jì)樣品池I0ItI0ItIF,p第62頁,共105頁，2024年2月25日，星期天6.４熒光分析法的應(yīng)用１.工作曲線法熒光分析的靈敏度比紫外－可見分光光度法高103～104熒光熄滅工作曲線法FxFCsCx直接熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線法FCsFxCx２.熒光分析法的靈敏度Ａ∝εＩＦ∝Ｋ，φＦ，Ｉ０，ε第63頁,共105頁，2024年2月25日，星期天在紫外光照射下會發(fā)生熒光的無機(jī)化合物很少，主要依賴于有機(jī)試劑形成的螯合物。３.熒光分析的應(yīng)用（1）無機(jī)化合物＊直接熒光測定法其中，較常測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd與某些稀土元素；測定的靈敏度有些可以達(dá)到10-10mg/L某些元素雖然不與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會與發(fā)熒光的配合物爭奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光熄滅，由熒光熄滅的強(qiáng)度此該元素的含量。較常測定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W＊熒光熄滅測定法自從1867年Goppelsroder進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁—桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁的測定以來，采用有機(jī)試劑可以測定70多種元素。第64頁,共105頁，2024年2月25日，星期天＊催化熒光測定法較常測定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb某些元素雖然與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是反應(yīng)速度慢，在某些微量元素的催化下，反應(yīng)速度會加快，在特定的時(shí)間內(nèi)可用來測定微量元素。＊低溫?zé)晒鉁y定法常測定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN某些微量元素存在，會催化發(fā)熒光的配合物產(chǎn)生熒光熄滅，在特定的時(shí)間內(nèi)可用來測定微量元素。溶液溫度的降低，顯著增強(qiáng)溶液的熒光強(qiáng)度。液氮－1960C較常測定的元素有：Ce、Sm、Tb等稀土元素

Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn＊固體熒光測定法固體熒光法在熒光分析中也經(jīng)常用到第65頁,共105頁，2024年2月25日，星期天芳香族化合物存在共軛的不飽和體系，是有機(jī)化合物熒光測定的主要類型。（２）有機(jī)化合物待測物試劑λexmaxλemmax測定范圍ppm丙三醇苯胺紫外藍(lán)色0.1~2糠醛蒽酮4655051.5~15氨基酸氧化酶3154250.01~50維生素A無水乙醇3454900~20蛋白質(zhì)曙紅丫紫外5400.06~6腎上腺素乙二胺4205250.001~0.02

青霉素α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮雜蒽4205000.0625~0.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.001~0.033胍基丁胺鄰苯二醛3654700.05~5四氧嘧啶苯二胺36548510-4（3）生命與生物物質(zhì)第66頁,共105頁，2024年2月25日，星期天676.５化學(xué)發(fā)光分析法

化學(xué)發(fā)光是由化學(xué)反應(yīng)激發(fā)物質(zhì)所產(chǎn)生的光輻射?；诨瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)而建立起來的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法，這種分析方法具有靈敏度高、測定線性范圍寬、儀器設(shè)備簡單、分析速度快且易實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)。尤其是方法的靈敏度為一般的儀器分析方法所無法比擬。第67頁,共105頁，2024年2月25日，星期天68１．化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件

化學(xué)發(fā)光與磷光、熒光的根本區(qū)別在于分子受激發(fā)時(shí)所需能量的來源不同。化學(xué)發(fā)光是在一些特殊的化學(xué)反應(yīng)體系中，有關(guān)分子吸收反應(yīng)所釋放的化學(xué)能而處于電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生的一種電磁輻射。第68頁,共105頁，2024年2月25日，星期天69任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都包括兩個(gè)步驟，即化學(xué)激發(fā)和發(fā)光，如下式所示：

A+BC*+D（激發(fā)）

C*C+hv

（發(fā)光）間接的化學(xué)發(fā)光則按如下反應(yīng)發(fā)生：

A+B+CAB+C*（激發(fā)）

C*C+hv

（發(fā)光）這種由于加入發(fā)光能量接受體C所導(dǎo)致的化學(xué)發(fā)光稱為敏化化學(xué)發(fā)光或活化化學(xué)發(fā)光．第69頁,共105頁，2024年2月25日，星期天70化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可以在氣相、液相或固相進(jìn)行，分別稱為氣相化學(xué)發(fā)光、液相化學(xué)發(fā)光或固相化學(xué)發(fā)光。若化學(xué)發(fā)光在兩個(gè)不同相間進(jìn)行（如氣體通過固體表面或液-固界面上進(jìn)行的發(fā)光反應(yīng)）就稱為異相化學(xué)發(fā)光。其中，液相化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用范圍最廣。第70頁,共105頁，2024年2月25日，星期天71化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都包括化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個(gè)步驟，則有

ψCL=ψCE·ψEN(1)式中ψCL為化學(xué)發(fā)光效率；ψCE為生成激發(fā)態(tài)分子效率；ψEN為激發(fā)態(tài)發(fā)光效率，ψCL、ψCE分別定義為：第71頁,共105頁，2024年2月25日，星期天72則化學(xué)發(fā)光的效率為：第72頁,共105頁，2024年2月25日，星期天73一個(gè)化學(xué)反應(yīng)要成為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)必須滿足下面幾個(gè)要求：（１）化學(xué)反應(yīng)要提供足夠的能量生成激發(fā)態(tài)，也就是要有足夠的激發(fā)能

E＊．激發(fā)能的主要來源是反應(yīng)焓

Hr．大多數(shù)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)實(shí)例中，觀察到的光子能量均比

Hr大．在

Hr＜

Ｅ＊的條件下，將要由反應(yīng)的活化焓

H*提供這種附加的能量．因此，必須有：

Hr＋

H*≥

Ｅ＊

第73頁,共105頁，2024年2月25日，星期天74滿足上式只是滿足產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的必要條件而不是充分條件，有機(jī)發(fā)色基激發(fā)態(tài)的能量

E＊通常在150~400kJ·mol-1（對應(yīng)于570~280nm）范圍。（２）至少要有一種物質(zhì)能夠接受化學(xué)反應(yīng)的能量生成激發(fā)態(tài)。（３）在反應(yīng)條件下激發(fā)態(tài)分子能夠以光輻射的形式釋放能量回到基態(tài)。第74頁,共105頁，2024年2月25日，星期天75２．化學(xué)發(fā)光分析的基本原理化學(xué)發(fā)光分為快發(fā)光和慢發(fā)光．化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)過程可用發(fā)光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系曲線來描述。圖中t1為化學(xué)發(fā)光峰值出現(xiàn)的時(shí)間，t2為化學(xué)發(fā)光峰值衰減了90%時(shí)的時(shí)間。對于快發(fā)光，t1≤1s，化學(xué)發(fā)光衰減時(shí)間即t2－t1≤5s；對于慢發(fā)光來說t2－t1>5s。還有一種慢發(fā)光，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一段時(shí)間基本保持不變，然后再較快的上升或下降。第75頁,共105頁，2024年2月25日，星期天76化學(xué)發(fā)光的動力學(xué)曲線第76頁,共105頁，2024年2月25日，星期天77設(shè)某分析物與過量試劑作用而發(fā)光，則此時(shí)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與分析物濃度有如下關(guān)系式中，ICL(t)為在時(shí)刻t的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，以每秒產(chǎn)生的光量子數(shù)表示，

ＣＬ為化學(xué)發(fā)光效率，-dc/dt為分析物參加反應(yīng)的速度，即每秒?yún)⒓臃磻?yīng)的分子數(shù)。(2)第77頁,共105頁，2024年2月25日，星期天78為了提高測量的靈敏度，也可采用測量峰面積，即在一定時(shí)間間隔內(nèi)對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行積分，得到發(fā)光強(qiáng)度的積分值：(3)第78頁,共105頁，2024年2月25日，星期天79此時(shí)，t1和t2若為反應(yīng)過程中的某一段時(shí)間間隔，則積分值只是部分化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的積分值。如果t1取零，t2取反應(yīng)結(jié)束所需時(shí)間，得到的就是整個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生的總發(fā)光強(qiáng)度。它相當(dāng)于化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線下的整個(gè)峰面積，它與分析物濃度存在線性關(guān)系。這種分析方法實(shí)質(zhì)上是一種平衡法，特別適于慢的化學(xué)發(fā)光。第79頁,共105頁，2024年2月25日，星期天80當(dāng)然，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)對指定的測定最好是專屬的（如酶法化學(xué)發(fā)光），這樣就勿需實(shí)行光學(xué)分辨或化學(xué)方法排除干擾．許多化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度與分析物質(zhì)的濃度在幾個(gè)數(shù)量級之內(nèi)呈良好的線性關(guān)系．第80頁,共105頁，2024年2月25日，星期天81３．化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型（1）直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光直接化學(xué)發(fā)光是被測物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。表示如下：

A+B

C*+DC*

C+hv式中A或B是被測物，通過反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*。當(dāng)C*躍回激態(tài)時(shí)，輻射出光子。第81頁,共105頁，2024年2月25日，星期天82間接化學(xué)發(fā)光是被測物A或B通過化學(xué)反應(yīng)后生成初始激發(fā)態(tài)C*，C*不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F處于激發(fā)態(tài)，當(dāng)F*躍回基態(tài)時(shí)，產(chǎn)生發(fā)光．如下式表示：

A+B

C*+D

C*+F

F*+E

F*

F+hv式中C*為能量給予體，而F為能量接受體。例如，用羅丹明B－沒食子酸的乙醇溶液測定大氣中的O3，其化學(xué)發(fā)光反應(yīng)就屬這一類型。第82頁,共105頁，2024年2月25日，星期天83沒食子酸+O3

A*+O2

A*+羅丹明B羅丹明B*+B羅丹明B*羅丹明B+hv沒食子酸被O3氧化時(shí)吸收反應(yīng)所產(chǎn)生的化學(xué)能，形成受激中間體A*，而A*又迅速將能量轉(zhuǎn)給羅丹明B，并使羅丹明B分子激發(fā)，處于激發(fā)態(tài)的羅丹明B分子回到基態(tài)時(shí)，發(fā)射光子，該光輻射的最大發(fā)射波長為584nm。第83頁,共105頁，2024年2月25日，星期天84氣相化學(xué)發(fā)光主要有O3、NO、S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測空氣中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等。NO與O3的氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)有較高的化學(xué)發(fā)光效率，其反應(yīng)機(jī)理為

NO+O3

NO2*+O2

NO2*

NO2+hv（2）氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光第84頁,共105頁，2024年2月25日，星期天85這個(gè)反應(yīng)的發(fā)射光譜范圍為666~875nm，靈敏度可達(dá)1ng/ml。也可同時(shí)測定大氣中NO2的含量，將NO2還原為NO，測定二者的總量，再減去NO的量。液相化學(xué)發(fā)光的幾種體系：魯米諾、光澤精、過氧化草酸酯第85頁,共105頁，2024年2月25日，星期天86（3）異相化學(xué)發(fā)光和生物化學(xué)發(fā)光異相化學(xué)發(fā)光如在含有羅丹明B和沒食子酸的硅膠上，O3與沒食子酸反應(yīng)生成高能中間體A*，然后將能量轉(zhuǎn)移給羅丹明B接受體而發(fā)光。該反應(yīng)用于氣球探測器或氣相衛(wèi)星上，以便測定大氣或同溫層的O3含量。第86頁,共105頁，2024年2月25日，星期天87生物化學(xué)發(fā)光

熒火蟲素與三磷酸腺苷（ATP）反應(yīng)，在螢火蟲素酶（E）與Mg2+存在時(shí)生成螢火蟲素與一磷酸腺苷（AMP）的復(fù)合物和焦磷酸鎂，然后復(fù)合物與氧發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，φCL接近于1。該體系可測定2×10-17mol·L-1的ATP，這相當(dāng)于一個(gè)細(xì)菌的ATP含量，靈敏度很高，選擇性很好。第87頁,共105頁，2024年2月25日，星期天88４．魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的機(jī)理在常用的化學(xué)發(fā)光分析的發(fā)光物質(zhì)中，魯米諾的應(yīng)用最廣泛。深入的研究已經(jīng)給出魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理的初步模式。它產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的ψCE為0.01~0.05。第88頁,共105頁，2024年2月25日，星期天魯米諾氧化發(fā)光原理hv(λmax=425nm）3-氨基苯二甲酰環(huán)肼第89頁,共105頁，2024年2月25日，星期天90魯米諾（3-氨基苯二甲酰環(huán)肼）在堿性溶液中可被一些氧化劑氧化，產(chǎn)生最大發(fā)射波長為425nm的化學(xué)發(fā)光。發(fā)光過程有兩種方式，即單電子氧化和雙電子氧化，單電子氧化得到中間體魯米諾游離基；雙電子氧化得到中間體疊氮醌，而最后發(fā)光體是3-氨基鄰苯二甲酸根陰離子。在堿性溶液中，I2與魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)屬于雙電子氧化過程，該化學(xué)發(fā)光體系可檢測碘的濃度低達(dá)5

10-10mol·L-1。第90頁,共105頁，2024年2月25日，星期天91金屬離子催化魯米諾-H2O2體系的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)大都屬于單電子氧化過程。例如：

Mn++HO2-→Mn+·HO2-Mn+·HO2-+魯米諾＋H2O→M(n+1)++魯米諾游離基＋3OH-

魯米諾游離基+HO2-→化學(xué)發(fā)光上述歷程中Mn+（如Co2+）參與了反應(yīng)，價(jià)態(tài)升高，本身是還原劑。第91頁,共105頁，2024年2月25日，星期天92４．液相化學(xué)發(fā)光的測量儀器大多數(shù)化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光測量儀器稱為光度計(jì)，因?yàn)檫@類儀器只有光電檢測，沒有單色器提供光色散。也有人稱這類儀器為發(fā)光光度計(jì)。商品名稱則更為多種多樣。液相化學(xué)發(fā)光的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是儀器比較簡單，一般僅有進(jìn)樣系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)組成。第92頁,共105頁，