包含整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的經(jīng)過(guò)修飾的梭菌毒素的制作方法

包含整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的經(jīng)過(guò)修飾的梭菌毒素的制作方法專(zhuān)利名稱(chēng)：：包含整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的經(jīng)過(guò)修飾的梭菌毒素的制作方法包含整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的經(jīng)過(guò)修飾的梭國(guó)母■素本申請(qǐng)要求2009年12月16日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第61/286，954號(hào)的權(quán)益，所述申請(qǐng)的全文以引用的方式并入本文。梭菌毒素(諸如肉毒桿菌神經(jīng)毒素(Botulinumneurotoxin；BoNT)BoNT/A>BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNTA^PBoNT/G以及破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(Tetanusneurotoxin；TeNT))抑制神經(jīng)傳遞的能力已在多種治療和美容應(yīng)用中得到應(yīng)用，參見(jiàn)例如WilliamJ.Lipham,COSMETICANDCLINICALAPPLICATIONSOFBOTULINUMTOXIN(Slack,Inc.,2004)?？勺鳛樗幬锝M合物商購(gòu)得到的梭菌毒素包括BoNT/A制劑，如BOTOX(Allergan,Inc.，Irvine，CA)、DYSPORT'/RELOXlNR(BeaufourIpsen,PortonDown，England)、NEURONOX(Medy-Tox,Inc.，Ochang-myeon,SouthKorea)、BTX-A(Lanzhou、InstituteBiologicalProducts，China)和XEOMIN(MerzPharmaceuticals,GmbH.，F(xiàn)rankfurt,Germany)；以及BoNT/B制劑，如MY0BL0CTM/NEUR0BL0C(ElanPharmaceuticals,SanFrancisco,CA)。作為實(shí)例,BOTOX當(dāng)前已在一個(gè)或多個(gè)國(guó)家獲得批準(zhǔn)用于以下適應(yīng)癥遲緩不能、成人痙攣狀態(tài)、肛裂、背痛、眼瞼痙攣、磨牙癥、頸肌張力障礙、特發(fā)性震顫、眉間紋或過(guò)動(dòng)性面部皺紋、頭痛、半面痙攣、膀胱過(guò)動(dòng)癥、多汗癥、青少年大腦性癱瘓、多發(fā)性硬化癥、肌陣攣性病癥、鼻唇紋、痙攣性發(fā)音困難、斜視和VII神經(jīng)病癥。梭菌毒素治療通過(guò)干擾用于分泌神經(jīng)遞質(zhì)至突觸間隙中的胞外分泌過(guò)程來(lái)抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放。制藥工業(yè)非常希望將梭菌毒素療法的使用擴(kuò)展至其當(dāng)前肌肉松弛性應(yīng)用以夕卜，以治療基于感覺(jué)神經(jīng)的疾病，如各種慢性疼痛、神經(jīng)性炎癥和泌尿生殖器病癥，以及非基于神經(jīng)元的病癥，如胰腺炎。當(dāng)前用于擴(kuò)展基于梭菌毒素的療法的一種方法涉及修飾梭菌毒素，以使得經(jīng)過(guò)修飾的毒素對(duì)非梭菌毒素靶細(xì)胞具有改變的細(xì)胞靶向能力。此再靶向能力通過(guò)將梭菌毒素的天然存在的靶向結(jié)構(gòu)域置換為對(duì)存在于非梭菌毒素靶細(xì)胞中的非梭菌毒素受體顯示選擇性結(jié)合活性的靶向結(jié)構(gòu)域來(lái)達(dá)到。對(duì)靶向結(jié)構(gòu)域的所述修飾產(chǎn)生能夠選擇性結(jié)合存在于非梭菌毒素靶細(xì)胞上的非梭菌毒素受體(靶受體)的修飾毒素(再靶向)。對(duì)非梭菌毒素靶細(xì)胞具有靶向活性的再靶向梭菌毒素可結(jié)合存在于非梭菌毒素靶細(xì)胞上的受體，移位至細(xì)胞質(zhì)中，且對(duì)非梭菌毒素靶細(xì)胞的SNARE復(fù)合物發(fā)揮其蛋白水解作用。對(duì)非梭菌毒素靶細(xì)胞具有靶向活性的再靶向梭菌毒素的非限制性實(shí)例描述于以下文獻(xiàn)中例如KeithA.Foster等，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions,美國(guó)專(zhuān)利5，989，545(I"9年11月23日)；CliffordC.Shone等，RecombinantToxinFragments,美國(guó)專(zhuān)利6,461,617(2002年10月8日)；ConradP.Quinn等，MethodsandCompoundsfortheTreatmentofMucusHypersecretion,美國(guó)專(zhuān)利6，632，440(2003年10月14曰)；LanceE.Steward等，MethodsAndCompositionsForTheTreatmentOfPancreatitis,美國(guó)專(zhuān)利6，843，998(2005年I月18日)；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain，美國(guó)專(zhuān)利公布2002/0037833(2002年3月28日)；KeithA.Foster等，InhibitionofSecretionfromNon-neuralCells，美國(guó)專(zhuān)利公布2003/0180289(2003年9月25日)；J.OliverDolly等，ActivatableRecombinantNeurotoxins,W02001/014570(2001年3月I日)；KeithA.Foster等，Re-targetedToxinConjugates,國(guó)際專(zhuān)利公布WO2005/023309(2005年3月17日)；和LanceE.Steward等，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/376，696(2006年3月15日)。與梭菌毒素相關(guān)的再靶向治療作用的能力已極大擴(kuò)展了能夠使用梭菌毒素療法的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的數(shù)量。作為非限制性實(shí)例，再靶向感覺(jué)神經(jīng)元的修飾梭菌毒素適用于治療各種慢性疼痛，如痛覺(jué)過(guò)敏和異常性疼痛、神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛,參見(jiàn)例如Foster，同上，(1999)JPDonovan,同上，(2OO2)JPStephanDonovan,MethodForTreatingNeurogenicInflammationPainwithBotulinumToxinandSubstancePComponents,美國(guó)專(zhuān)利7，022，329(2006年4月4日)。作為另一非限制性實(shí)例，再靶向胰腺細(xì)胞的修飾梭菌毒素適用于治療胰腺炎，參見(jiàn)例如Steward，同上，(2005)。、開(kāi)發(fā)再靶向梭菌毒素期間揭示的一個(gè)意外發(fā)現(xiàn)涉及靶向部分的安置或呈現(xiàn)形式。如下文所進(jìn)一步論述，將天然存在的梭菌毒素組織化成三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，其按線性氨基至羧基單一多肽順序包含酶促結(jié)構(gòu)域(氨基區(qū)位置)、移位結(jié)構(gòu)域(中部區(qū)位置)和結(jié)合結(jié)構(gòu)域(羧基區(qū)位置)(圖2)。此天然存在的順序可稱(chēng)為靶向部分的羧基呈現(xiàn)形式，因?yàn)榻Y(jié)合細(xì)胞表面受體所必需的結(jié)構(gòu)域位于梭菌毒素的羧基區(qū)位置。然而，已證實(shí)可通過(guò)重排三個(gè)主要結(jié)構(gòu)域的線性氨基至羧基單一多肽順序并將靶向部分定位于梭菌毒素的氨基區(qū)位置(稱(chēng)為氨基呈現(xiàn)形式)以及中部區(qū)位置(稱(chēng)為中心呈現(xiàn)形式)對(duì)梭菌毒素進(jìn)行修飾(圖2)。雖然已證明梭菌毒素結(jié)構(gòu)域的此重排和靶向部分的定位是成功的，但對(duì)于適當(dāng)受體結(jié)合需要游離氨基端的一類(lèi)靶向部分來(lái)說(shuō)仍然存在問(wèn)題。與適當(dāng)受體結(jié)合需要游離氨基端的靶向部分相關(guān)的問(wèn)題起源于天然存在抑或經(jīng)過(guò)修飾的梭菌毒素實(shí)際上加工成雙鏈形式以便獲得完全活性。天然存在的梭菌毒素各自翻譯成約150kDa的單鏈多肽，其隨后通過(guò)天然存在的蛋白酶在二硫環(huán)內(nèi)進(jìn)行蛋白水解切斷而裂解(圖I)。此裂解發(fā)生于形成二硫橋鍵的兩個(gè)半胱氨酸殘基之間產(chǎn)生的離散雙鏈環(huán)區(qū)內(nèi)。此翻譯后加工產(chǎn)生包含約50kDa輕鏈(LC)、包含酶促結(jié)構(gòu)域和約IOOkDa重鏈(HC)、包含移位和細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙鏈分子，所述LC和HC由單個(gè)二硫鍵和非共價(jià)相互作用保持在一起(圖I)。重組產(chǎn)生的梭菌毒素通常將天然存在的雙鏈環(huán)蛋白酶裂解位點(diǎn)取代為外源蛋白酶裂解位點(diǎn)(圖2)。參見(jiàn)例如Dolly,J.0.等，ActivatableClostridialToxins，美國(guó)專(zhuān)利No.7，419，676(2008年9月2日)，其以引用的方式并入本文。盡管再靶向梭菌毒素的總體分子量因靶向部分的大小而不同，但活化過(guò)程和其對(duì)外源裂解位點(diǎn)的依賴(lài)性基本上與重組產(chǎn)生的梭菌毒素相同。參見(jiàn)例如Steward，L.E.等，ActivatableClostridialToxins，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.12/192，900(2008年8月15日)；Steward,L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/776，075(2007年7月11曰)；Steward,L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityforClostridialToxinTargetCells，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/776，052(2007年7月11日)，每一文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。一般來(lái)說(shuō)，使用外源蛋白酶將單鏈多肽轉(zhuǎn)化成其雙鏈形成的活化過(guò)程可用于加工具有組織化成氨基呈現(xiàn)形式、中心呈現(xiàn)形式或羧基呈現(xiàn)形式排列的靶向部分的再靶向梭菌毒素。這是因?yàn)閷?duì)于大部分靶向部分來(lái)說(shuō)，所述部分的氨基端不參與受體結(jié)合。因而，多種蛋白酶裂解位點(diǎn)可用于產(chǎn)生梭菌毒素或再靶向梭菌毒素的活性雙鏈形式。然而，受體結(jié)合需要游離氨基端的靶向部分為此一般情況的例外，因?yàn)樵诖饲闆r下，所述部分的氨基端對(duì)于適當(dāng)受體結(jié)合來(lái)說(shuō)必不可少。因此，不能使用可切斷鍵不位于蛋白酶裂解位點(diǎn)的羧基端的蛋白酶裂解位點(diǎn)，因?yàn)樗鑫稽c(diǎn)在靶向部分的氨基端留下裂解位點(diǎn)的殘余部分。因此，即使所述再靶向毒素將被加工成雙鏈形式，所述毒素也將會(huì)因?yàn)榘邢虿糠植荒芙Y(jié)合其同源受體而無(wú)活性，因?yàn)榱呀馕稽c(diǎn)殘余部分會(huì)遮蔽靶向部分中對(duì)于受體結(jié)合功能來(lái)說(shuō)必不可少的氨基端氨基酸。舉例來(lái)說(shuō)，再靶向梭菌毒素按氨基至羧基線性順序包含酶促結(jié)構(gòu)域、人鼻病毒3C蛋白酶裂解位點(diǎn)、結(jié)合結(jié)構(gòu)域和移位結(jié)構(gòu)域(中心呈現(xiàn)形式排列)。人鼻病毒3C蛋白酶裂解位點(diǎn)包含共有序列P5-P4-L-F-QI-G-P-P3'-P4，-P5,(SEQIDNO:I)，其中P5優(yōu)選是D或￡;4為63、￥、1^、1^、3或1';且？3’、？4’和P5’可為任何氨基酸。Q-G可切斷鍵裂解后，裂、解位點(diǎn)的GP殘余部分變成含于結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的靶向部分的氨基端。一般來(lái)說(shuō)，此殘余部分不干擾靶向部分與其同源受體的結(jié)合。一個(gè)例外為適當(dāng)受體結(jié)合需要游離氨基端的靶向部分。在此情況下，人鼻病毒3C蛋白酶裂解位點(diǎn)的GP殘余部分會(huì)遮蔽靶向部分中適當(dāng)結(jié)合所必需的游離氨基端，由此使經(jīng)過(guò)修飾的梭菌毒素因不能結(jié)合其受體和內(nèi)化至細(xì)胞中而無(wú)活性。迄今為止，僅發(fā)現(xiàn)兩種蛋白酶，因子X(jué)a和腸激酶，適用于活化具有適當(dāng)受體結(jié)合需要游離氨基端的靶向部分的再靶向梭菌毒素。因子X(jué)a裂解位AP5-I(E/D)GRI-P1,-P2,-P3,-P4,-P5,(SEQIDNO:2)(其中P5、PpP2,、P3,、P4,和P5,可為任何氨基酸)為在P1精氨酸的羧基側(cè)裂解的位點(diǎn)特異性蛋白酶裂解位點(diǎn)。類(lèi)似地，腸激酶裂解位點(diǎn)DDDDKI-Pr-P2I-Py-P4I-P5,(SEQIDNO:3)(其中P1,、P2,、P3,、P4,和P5,可為任何氨基酸)為在P1賴(lài)氨酸的羧基側(cè)裂解的位點(diǎn)特異性蛋白酶裂解位點(diǎn)。任一位點(diǎn)處的蛋白水解產(chǎn)生氨基端完整的靶向部分，因?yàn)槠洳涣粝铝呀馕稽c(diǎn)殘余部分。盡管其它蛋白酶可在其裂解位點(diǎn)的羧基端裂解，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、V8蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、CNBr、Arg-C、Glu-C、Lys-C和Tyr_C，但所述位點(diǎn)本身為非特異性的。因此，所述蛋白酶不適用，因?yàn)槠鋵⒘呀庠侔邢蚨舅氐钠渌鼌^(qū)，由此使毒素失活。然而，存在與因子X(jué)a和腸激酶相關(guān)的若干問(wèn)題。關(guān)于因子X(jué)a，此蛋白酶僅可以從血源性來(lái)源純化的產(chǎn)品形式獲得，當(dāng)前并不存在重組產(chǎn)生的因子X(jué)a可購(gòu)得。因此，因子X(jué)a因?qū)ρ葱栽噭┑慕】殿檻]和使用所述產(chǎn)品的高成本而不適于制造藥物。類(lèi)似地，腸激酶具有使得制造藥物困難和成本高的若干缺點(diǎn)。首先，腸激酶缺乏現(xiàn)行藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(currentGoodManufacturePractices；cGMP)批準(zhǔn)且試圖獲得所述批準(zhǔn)為耗時(shí)且耗費(fèi)大的過(guò)程。第二，眾所周知此蛋白酶難以重組產(chǎn)生，因?yàn)槟c激酶為含有四個(gè)二硫鍵的26.3kDa大分子。因此，難以使用更加成本有效的基于細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)樗鱿到y(tǒng)缺乏產(chǎn)生二硫鍵的能力。然而，使用基于真核生物的表達(dá)系統(tǒng)也具有若干缺點(diǎn)。一個(gè)缺點(diǎn)為絕大部分重組產(chǎn)生的腸激酶隔離于包涵體中，致使難以純化足量的此蛋白酶。取決于所使用的真核細(xì)胞，另一缺點(diǎn)為在制造過(guò)程中可能需要額外純化步驟以得到GMP批準(zhǔn)。另一缺點(diǎn)為因子X(jué)a和腸激酶均裂解底物中預(yù)定靶位點(diǎn)以外的位置，尤其當(dāng)在高濃度下使用時(shí)。因此，所述問(wèn)題對(duì)使用因子X(jué)a或腸激酶用于商業(yè)生產(chǎn)包含具有游離氨基端的靶向部分的雙鏈再靶向梭菌毒素造成明顯障礙，因?yàn)槠錇槌杀靖?、低效且費(fèi)力的過(guò)程，顯著增加制造作為生物藥物的所述再靶向梭菌毒素的總體成本。本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)不依賴(lài)于因子X(jué)a或腸激酶來(lái)將毒素加工成其雙鏈形式的包含具有游離氨基端的靶向部分的修飾梭菌毒素。此舉通過(guò)將新的蛋白酶裂解位點(diǎn)與靶向部分整合以使得裂解后產(chǎn)生受體結(jié)合所必需的適當(dāng)氨基端來(lái)完成。因此，本發(fā)明的方面提供包含整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的修飾梭菌毒素。設(shè)想可通過(guò)并入蛋白酶裂解位點(diǎn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)修飾包含適當(dāng)受體結(jié)合需要游離氨基端的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何梭菌毒素。所述梭菌毒素描述于以下文獻(xiàn)中例如Steward，L.E.等，MultivalentClostridialToxins,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.12/210,770(2008年9月15日)；Steward,L.E.等，ActivatableClostridialToxins,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)、No.12/192,900(2008年8月15日)；Steward，L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/776，075(2007年7月11日)；Steward,L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityforClostridialToxinTargetCells,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/776，052(2007年7月11日)；Foster，K.A.等，F(xiàn)usionProteins,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/792，210(2007年5月31日)；Foster,K.A.等,Non-CytotoxicProteinConjugates,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/791,979(2007年5月31日)；Steward,L.E.等，ActivatableClostridialToxins,美國(guó)專(zhuān)利公布No.2008/0032931(2008年2月7日)；Foster,K.A.等，Non-CytotoxicProteinConjugates,美國(guó)專(zhuān)利公布No.2008/0187960(2008年8月7日)；Steward，L.E.等，DegradableClostridialToxins,美國(guó)專(zhuān)利公布No.2008/0213830(2008年9月4日)；Steward，L.E.等，ModifiedClostridialToxinsWithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForClostridialToxinTargetCells,美國(guó)專(zhuān)利公布No.2008/0241881(2008年10月2日)；和Dolly,J.0.等,ActivatableClostridialToxins，美國(guó)專(zhuān)利No.7,419,676(2008年9月2日)，每一文獻(xiàn)的全文以引用的方式并入本文。本發(fā)明的其它方面提供編碼包含整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的修飾梭菌毒素的多核苷酸分子。編碼本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的修飾梭菌毒素的多核苷酸分子可進(jìn)一步包含表達(dá)載體。本發(fā)明的其它方面提供包含本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的修飾梭菌毒素的雙鏈形式的組合物。包含本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的修飾梭菌毒素的雙鏈形式的組合物可為藥物組合物。所述藥物組合物除本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的修飾梭菌毒素外，還可包含藥用載體、藥用組分或兩者。附圖簡(jiǎn)述圖I示出天然存在的梭菌毒素的結(jié)構(gòu)域組織。單鏈形式描繪包含酶促結(jié)構(gòu)域、移位結(jié)構(gòu)域和H。結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基至羧基線性組織。位于移位和酶促結(jié)構(gòu)域之間的雙鏈環(huán)區(qū)由雙重SS括號(hào)描繪。此區(qū)包含內(nèi)源性雙鏈環(huán)蛋白酶裂解位點(diǎn)，其在被天然存在的蛋白酶(如內(nèi)源性梭菌毒素蛋白酶或環(huán)境中產(chǎn)生的天然存在的蛋白酶)蛋白水解裂解后使毒素的單鏈形式轉(zhuǎn)化為雙鏈形式。圖2示出以結(jié)合結(jié)構(gòu)域的羧基呈現(xiàn)形式、結(jié)合結(jié)構(gòu)域的中心呈現(xiàn)形式和結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基呈現(xiàn)形式排列的梭菌毒素的結(jié)構(gòu)域組織。位于移位和酶促結(jié)構(gòu)域之間的雙鏈環(huán)區(qū)由雙重SS括號(hào)描繪。此區(qū)包含內(nèi)源性蛋白酶裂解位點(diǎn)，其在由其同源蛋白酶裂解后使毒素的單鏈形式轉(zhuǎn)化為雙鏈形式。圖3示出中樞和周邊神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)釋放和梭菌毒素中毒的當(dāng)前范例的示意圖。圖3A示出中樞和周邊神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)制的示意圖。釋放過(guò)程可描述為包括兩個(gè)步驟1)囊泡對(duì)接，其中含有神經(jīng)遞質(zhì)分子的囊泡上的囊泡結(jié)合型SNARE蛋白與位于質(zhì)膜上的膜結(jié)合型SNARE蛋白締合；和2)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，其中囊泡與質(zhì)膜融合且神經(jīng)遞質(zhì)分子分泌至胞外。圖3B示出中樞和周邊神經(jīng)元中破傷風(fēng)毒素和肉毒桿菌毒素的中毒機(jī)制的示意圖。此中毒過(guò)程可描述為包括四個(gè)步驟1)受體結(jié)合，其中梭菌毒素結(jié)合于梭菌毒、素受體系統(tǒng)且啟動(dòng)中毒過(guò)程；2)復(fù)合物內(nèi)化，其中毒素結(jié)合后，含有毒素/受體系統(tǒng)復(fù)合物的囊泡內(nèi)吞至細(xì)胞中；3)輕鏈移位，其中認(rèn)為發(fā)生多個(gè)事件，包括例如囊泡的內(nèi)部pH值改變、形成包含梭菌毒素重鏈的Hn結(jié)構(gòu)域的通道孔、梭菌毒素輕鏈與重鏈分離和活性輕鏈釋放；和4)酶促標(biāo)靶修飾，其中梭菌毒素的活性輕鏈蛋白水解裂解其標(biāo)靶SNARE底物，如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白(Syntaxin)，由此阻止囊泡對(duì)接和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。由肉毒芽抱梭菌(Clostridiumbotulinum)、破傷風(fēng)芽抱梭菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)產(chǎn)生的梭菌毒素在人和其它哺乳動(dòng)物的治療性和美容性治療中使用最廣泛。肉毒芽孢梭菌的菌株產(chǎn)生七種抗原性不同的肉毒桿菌毒素(BoNT)類(lèi)型，其已通過(guò)研究人類(lèi)(BoNT/A、/B、/E和/F)、動(dòng)物(BoNT/Cl和/D)中的肉毒桿菌中毒爆發(fā)得到鑒別或從土壤分離(BoNT/G)。BoNT彼此具有約35%氨基酸一致性且共享相同的功能性結(jié)構(gòu)域組織和總體結(jié)構(gòu)架構(gòu)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已認(rèn)識(shí)到，在梭菌毒素的各類(lèi)型內(nèi)，可存在氨基酸序列以及編碼這些蛋白質(zhì)的核酸稍有不同的亞型。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)前存在四種BoNT/A亞型BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3和BoNT/A4，其中特定亞型當(dāng)與另一BoNT/A亞型相比較時(shí)顯示約89%氨基酸一致性。雖然所有七種BoNT血清型都具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)性質(zhì)，但各自還顯示異源的細(xì)菌學(xué)特征。相比之下，破傷風(fēng)毒素(TeNT)由破傷風(fēng)芽孢梭菌的均一族群產(chǎn)生。兩個(gè)其它梭菌物種巴氏梭菌和丁酸梭菌產(chǎn)生毒素BaNT和BuNT，其分另類(lèi)似于BoNT/F和BoNT/E。各成熟雙鏈分子包含三個(gè)功能上不同的結(jié)構(gòu)域1)位于LC中的酶促結(jié)構(gòu)域，其包括含有特異性靶向神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)構(gòu)核心組分的鋅依賴(lài)性?xún)?nèi)肽酶活性的金屬蛋白酶區(qū)；2)含于HC的氨基端部分(Hn)中的移位結(jié)構(gòu)域，其促進(jìn)LC從細(xì)胞內(nèi)囊泡釋放至靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；3)存在于HC的羧基端部分(H。)中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其確定毒素對(duì)位于靶細(xì)胞表面上的受體復(fù)合物的結(jié)合活性和結(jié)合特異性。H。結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)大小大致相等的不同結(jié)構(gòu)特征，其指定功能且稱(chēng)為HeN和H。。子結(jié)構(gòu)域。表I給出示例性梭菌毒素中存在的各結(jié)構(gòu)域的大致邊界區(qū)。權(quán)利要求1.一種單鏈修飾梭菌毒素，其包含a)能夠執(zhí)行梭菌毒素中毒過(guò)程的酶促靶向修飾步驟的梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域；b)能夠執(zhí)行梭菌毒素中毒過(guò)程的移位步驟的梭菌毒素移位結(jié)構(gòu)域；和c)包含蛋白酶裂解位點(diǎn)中包括可切斷鍵的P1位點(diǎn)的P部分和結(jié)合結(jié)構(gòu)域的整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述蛋白酶裂解位點(diǎn)的所述P部分的所述P1位點(diǎn)毗鄰所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基端，由此產(chǎn)生整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)；其中所述整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的裂解使所述單鏈修飾梭菌毒素轉(zhuǎn)化成雙鏈形式，并且產(chǎn)生具有能夠結(jié)合其同源受體的氨基端的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。2.如權(quán)利要求I所述的經(jīng)過(guò)修飾的梭菌毒素，其中所述經(jīng)過(guò)修飾的梭菌毒素包含以下線性氨基至羧基單一多肽順序1)所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素移位結(jié)構(gòu)域和所述整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，2)所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域、所述整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素移位結(jié)構(gòu)域，3)所述整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素移位結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域，4)所述整合型蛋白酶裂解位點(diǎn)-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、所述梭菌毒素酶促結(jié)構(gòu)域和所述梭菌毒素移位結(jié)構(gòu)域，或5)所述梭菌毒素移位結(jié)