人工合成多聚核苷酸體外翻譯技術(shù)

關(guān)于人工合成多聚核苷酸體外翻譯技術(shù)第2頁,共90頁，2024年2月25日，星期天參與翻譯的RNA分子有tRNA、rRNA和mRNA。tRNA的功能是轉(zhuǎn)運氨基酸，rRNA與多種蛋白質(zhì)組成核糖體作為翻譯進(jìn)行的場所，mRNA作為翻譯的模板。經(jīng)過三種RNA以及多種蛋白質(zhì)的相互作用，使來自DNA的遺傳信息正確地傳遞到蛋白質(zhì)。第3頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)遺傳密碼一、遺傳密碼遺傳密碼（geneticcode）是聯(lián)系核酸的堿基序列和蛋白質(zhì)的氨基酸序列的途徑。mRNA上由三個堿基代表一種氨基酸，稱為密碼子（codon）。生物體內(nèi)存在多個密碼子代表一種氨基酸的情況。第4頁,共90頁，2024年2月25日，星期天1954年，物理學(xué)家GeorgeGamov根據(jù)在DNA中存在四種核苷酸，在蛋白質(zhì)中存在二十種氨基酸的對應(yīng)關(guān)系，提出三個核苷酸為一個氨基酸編碼是最理想的。因為在有四種核苷酸的條件下，64（43=64）是能滿足為20種氨基酸編碼的最小數(shù)，這也符合生物體在億萬年進(jìn)化過程中形成的和遵循的經(jīng)濟原則。第5頁,共90頁，2024年2月25日，星期天密碼子的破譯是分子生物學(xué)發(fā)展史上的一件大事。主要運用了兩項技術(shù)，一項是1961年由Nirenberg等報道的人工合成多聚核苷酸體外翻譯技術(shù)；另一項是1964年Nirenberg和Leder發(fā)明的核糖體結(jié)合技術(shù)。這兩項技術(shù)的出現(xiàn)，為密碼子的破譯奠定了基礎(chǔ)。第6頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

破譯密碼的實驗研究先后由三個實驗室逐步發(fā)展了四種破譯方法，于1965年完成。

1)在體外無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系中加入人工合成的polyＵ開創(chuàng)了破譯遺傳密碼的先河。1961年，美國NIH的Nirenberg和Mathaei第一次確認(rèn)了UUU是Phe的密碼子。隨后他們又確定了AAA是Lys的密碼子，CCC是Pro的密碼子。第7頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2)混合共聚物(mixedcopolymers)實驗對密碼子中堿基組成的測定

1963年，Speyer和Ochoa等發(fā)展了用兩個堿基的共聚物破譯密碼的方法。例如以A和C原料，合成polyAC。但這個方法不能確定堿基的排列方式，而只能顯示密碼子中堿基組成及組成比例。另外，通過反復(fù)改變共聚物成份比例的方法亦十分麻煩和費時。

第8頁,共90頁，2024年2月25日，星期天3)aa-tRNA與確定的三核苷酸序列(密碼子)結(jié)合（核糖體結(jié)合技術(shù)）

Nirenberg和Leder于1964年建立了破譯密碼子的新方法，即tRNA與確定密碼子結(jié)合實驗。即是在缺乏蛋白質(zhì)合成所需的因子的條件下，特異氨基酸-tRNA(aa-tRNA)也能與核糖體-mRNA復(fù)合物結(jié)合。最重要的是這種結(jié)合并不一定需要長的mRNA分子。但有一些三核苷酸序列與核糖體結(jié)合并不象UUU或GUU等那樣有效。第9頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共90頁，2024年2月25日，星期天4)用重復(fù)共聚物(repeatingcopolymers)破譯密碼

Jones，和Khorana等人應(yīng)用有機化學(xué)和酶學(xué)技術(shù)，制備了已知的核苷酸重復(fù)序列。蛋白質(zhì)在核糖體上的合成可以在這些有規(guī)律的共聚物的任一點開始，并把特異的氨基酸參入肽鏈。例如，重復(fù)序列CUCUCUCUCU......是多肽Leu-Ser-Leu-Ser......或者是多肽Ser-Leu-Ser......的信使分子。第11頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共90頁，2024年2月25日，星期天除甲硫氨酸和色氨酸外，其他的氨基酸均有兩種以上的密碼子。多種密碼子編碼一種氨基酸的現(xiàn)象稱為簡并（degeneracy），代表同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonyms）。氨基酸的密碼子數(shù)目和它在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的頻率并沒有明顯的正相關(guān)性。第13頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一種氨基酸的幾個密碼子的差異通常在第三個堿基，說明了密碼子的第三個堿基具有一定的靈活性。在所有的生物體內(nèi)，密碼子字典幾乎是通用的，這已被體內(nèi)和體外的翻譯實驗所證實。第15頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共90頁，2024年2月25日，星期天線粒體的遺傳密碼子存在較多的例外情況，其中最常見的一種變化是UGA由終止密碼子變?yōu)樯彼岬拿艽a子，這可能是進(jìn)化上最早期的變化。第18頁,共90頁，2024年2月25日，星期天二、密碼子和反密碼子的相互作用密碼子決定氨基酸是通過mRNA與tRNA相互作用實現(xiàn)的，這種作用實質(zhì)上是堿基間的配對。密碼子與反密碼子（anticodon）間的正確識別是遺傳信息正確傳遞的保證。第19頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一般來說，生物體內(nèi)tRNA的種類要少于編碼氨基酸的密碼子。密碼子的前兩位堿基在和反密碼子配對時遵循Watson-Crick原則，而第三位堿基則有一定的靈活性，這就是擺動假說（wobblehypothesis）。第20頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共90頁，2024年2月25日，星期天在不同生物體內(nèi)，存在多種方式使少數(shù)的tRNA識別61種編碼氨基酸的密碼子，不同的生物所采用的途徑也不同。tRNA分子中含有較多的修飾堿基。位于反密碼子中的或其他位置的修飾堿基均會對密碼子和反密碼子的作用產(chǎn)生影響。第22頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第二套密碼系統(tǒng)的概念和特征1988年，ChristiandeDuve在Hou和Schimmel等人的研究基礎(chǔ)上，提出了第二套密碼系統(tǒng)的概念或?qū)W說。該學(xué)說認(rèn)為:tRNA氨基酸接受柄有一輔密碼區(qū)(paracodonregion)，可以被氨基酰tRNA合成酶(aaRS)識別，并決定tRNA的負(fù)載特異性。他認(rèn)為第二套密碼系統(tǒng)蘊含于aaRS結(jié)構(gòu)中。第24頁,共90頁，2024年2月25日，星期天與經(jīng)典密碼系統(tǒng)不同。輔密碼子密碼系統(tǒng)或第二套密碼系統(tǒng)是非簡并性的(non-degenerate)?？赡苤挥?0種aaRS，每種aaRS能夠識別特異于某種氨基酸的所有tRNA，這種識別與該種特異tRNA的不同特征有關(guān)。第二套密碼系統(tǒng)比經(jīng)典的密碼系統(tǒng)對氨基酸更具有決定性，這與輔密碼子和相應(yīng)的氨基酸間的立體化學(xué)相互反應(yīng)有關(guān)。

第25頁,共90頁，2024年2月25日，星期天ChristiandeDuve認(rèn)為，第二套密碼系統(tǒng)僅僅是輔密碼子與aaRS-aa-AMP或aa-aaRS復(fù)合物的一個簡單反應(yīng)，而tRNA則起著刪除錯誤氨基酰的作用。aaRS上的某些區(qū)域含有一些殘基可與輔密碼子的核苷酸反應(yīng)，但無法把所有氨基酸側(cè)鏈與tRNA的核苷酸匹配起來。因此，一些科學(xué)家提出第二套密碼系統(tǒng)存在于tRNA分子本身，而不應(yīng)存在于aaRS結(jié)構(gòu)中。第26頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第二套密碼系統(tǒng)比經(jīng)典的密碼系統(tǒng)更原始。一些作者猜測tRNA起源于攜帶氨苷酰的寡核苷酸，其原始形式能與氨基酸直接反應(yīng)。破譯第二密碼系統(tǒng)的意義不僅僅限于tRNA分子本身生物學(xué)功能的認(rèn)識，更重要的是將對生物化學(xué)，生物起源，分子生物學(xué)及遺傳學(xué)產(chǎn)生重大影響。

第27頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)tRNA的功能所有的tRNA都有相同的二級（三葉草型）和三級結(jié)構(gòu)（倒L型）。這種結(jié)構(gòu)上的一致性是其功能所必需的。因為不同的tRNA分子都具有相同的功能特征。tRNA在翻譯中轉(zhuǎn)運氨基酸的作用，將氨基酸經(jīng)過密碼子與反密碼子的相互識別定位在肽鏈中。從這一點上看，tRNA是起具體翻譯作用的分子。第28頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一、氨酰tRNA合成酶氨酰tRNA合成酶催化氨基酸與tRNA之間的反應(yīng)。攜帶同一種氨基酸的tRNA可有多種，稱為同工tRNA（iso-acceptingtRNA）?？蓪RNA分為20個同工tRNA組。一組同工tRNA在特定的合成酶催化下與相應(yīng)的氨基酸結(jié)合。第35頁,共90頁，2024年2月25日，星期天氨酰tRNA合成酶有三個結(jié)合位點，分別是氨基酸結(jié)合位點、ATP結(jié)合位點和tRNA結(jié)合位點。它催化的反應(yīng)可分為兩步：第一步氨基酸和ATP形成腺苷酸化氨基酰，釋放焦磷酸；第二步活化型的氨基酸被轉(zhuǎn)移至tRNA，釋放AMP。氨酰tRNA合成酶所催化的反應(yīng)有特異性，即能選擇相應(yīng)的tRNA和氨基酸。一種合成酶只能識別一種氨基酸和該氨基酸的幾種同工tRNA。第36頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共90頁，2024年2月25日，星期天tRNA沿著L型的一面與合成酶結(jié)合。所有的tRNA均是以兩個端點與合成酶結(jié)合，大部分的序列不被合成酶識別。第一類和第二類合成酶與tRNA的相互作用有所區(qū)別。經(jīng)晶體結(jié)構(gòu)分析，兩類酶與tRNA接觸的方位正好相反，所形成的復(fù)合物互成鏡像結(jié)構(gòu)。第46頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第47頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第48頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第49頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)核糖體的結(jié)構(gòu)核糖體（ribosome），又稱核糖核蛋白顆粒（ribonucleoproteinparticle），是細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的場所，在蛋白質(zhì)合成中起著中心作用。核糖體提供了蛋白質(zhì)合成過程中所需的各種生物活性。第51頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一、核糖體的組成原核生物、真核生物和細(xì)胞器的核糖體組成差別很大，但其三維結(jié)構(gòu)非常相似。不論何種來源的核糖體，均由大小兩個亞基組成。兩個亞基均由RNA和一定數(shù)量的蛋白質(zhì)組成，其共同特征是RNA的含量比蛋白質(zhì)高。第52頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第53頁,共90頁，2024年2月25日，星期天核糖體RNA（rRNA）的純化相對比較容易，可以用苯酚抽提核糖體以去除蛋白質(zhì)而獲得。rRNA的大小可以通過超速離心來確定。核糖體蛋白則是非常復(fù)雜的混合物，其純化和分子量的大小只能用更為精細(xì)的辦法來確定。1970年，E.Kaldschmidt和H.G.Wittman用雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）的辦法對組成兩個亞基的蛋白進(jìn)行了近乎完全的解析。

第54頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第56頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第57頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第58頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第59頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第60頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第61頁,共90頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌70S核糖體由30S小亞基和50S大亞基兩部分組成。30S小亞基由一個16SrRNA和21種核糖體蛋白組成，而50S大亞基則含有兩個rRNA（5S和23S）和34種核糖體蛋白。真核生物細(xì)胞質(zhì)核糖體更為復(fù)雜，沉降系數(shù)為80S，由40S小亞基和60S大亞基組成。40S小亞基由18SrRNA和33種蛋白組成，而60S大亞基則含有三個rRNA分子（5S，5.8S和28S）和50種核糖體蛋白。第62頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第63頁,共90頁，2024年2月25日，星期天組成核糖體的RNA和蛋白質(zhì)一般只有一個拷貝。RNA和蛋白質(zhì)相互作用，形成一個復(fù)雜而有序的結(jié)合體。核糖體的數(shù)目與生物合成蛋白質(zhì)的活性密切相關(guān)。第64頁,共90頁，2024年2月25日，星期天二、核糖體的結(jié)構(gòu)核糖體的直徑只有可見光波長的十分之一。因此，單個的核糖體不能反射可見光，我們也就不能在光學(xué)顯微鏡下看到核糖體。

20世紀(jì)70年代，JamesLake（1976）利用負(fù)染色電鏡技術(shù)（negativestainingtechniques）不僅觀察到了核糖體兩個亞基的形狀，還得到了在完整的核糖體內(nèi)它們是如何配合在一起的信息。第65頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第66頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第67頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第68頁,共90頁，2024年2月25日，星期天30S核糖體亞基結(jié)構(gòu)包括頭（head）、基部（base）、平臺（platform）以及縫隙（cleft）等；50S核糖體亞基的結(jié)構(gòu)包括中央突（centralprotuberance）、莖（stalk）、嵴（ridge）以及谷（valley）等。核糖體30S小亞基的平臺伸入到50S大亞基的谷中而嵌和在一起。游離狀態(tài)和蛋白質(zhì)合成過程中的核糖體結(jié)構(gòu)有區(qū)別，說明核糖體的結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)合成過程中有一定的靈活性。第69頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第70頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第71頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第72頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第73頁,共90頁，2024年2月25日，星期天JoachimFrank等（1995）利用一種更高分辨率的技術(shù)－冷凍電子顯微鏡技術(shù)對大腸桿菌70S核糖體進(jìn)行了更為細(xì)致的描述。他們利用計算機將4300張圖象組合起來，形成了核糖體的三維立體圖。他們還觀察到了核糖體的幾個新特征，包括30S亞基上的一個距（spur）、30S亞基頸部的一個通道（channel）以及起始于兩個亞基交界峽谷（interfacecanyon）的分叉隧道（tunnel）。

第74頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第75頁,共90頁，2024年2月25日，星期天mRNA經(jīng)由30S亞基頸部的通道形成一個U型的轉(zhuǎn)彎，在轉(zhuǎn)彎處與兩個亞基之間A位點和P位點上的tRNA發(fā)生相互作用，最后mRNA通過30S亞基的平臺和頭之間的縫隙離開核糖體。分叉隧道的作用可能是為新生的多肽鏈提供了可選擇的離開核糖體的通路。第76頁,共90頁，2024年2月25日，星期天最近，核糖體晶體衍射結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的研究取得了迅速的進(jìn)展。不僅表現(xiàn)在兩個亞基和整體核糖體的晶體衍射分辨率有了很大的提高，還克服了很多晶體衍射圖象的難點問題。兩個亞基在原子分辨率水平上的晶體衍射圖以及整體核糖體在5.0?分辨率的分子模型都已經(jīng)發(fā)表。第77頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第78頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第79頁,共90頁，2024年2月25日，星期天大部分的核糖體蛋白，特別是那些大亞基核糖體蛋白，都有手指狀的突起伸到rRNA核心內(nèi)以穩(wěn)定rRNA的結(jié)構(gòu)。核糖體蛋白對亞基的rRNA核心起著修飾的作用。核糖體的功能中心是富含RNA的，亞基相互作用的主要位點也是由RNA組成，而核糖體蛋白只在一些小的和更外周的位點形成中發(fā)揮作用。第80頁,共90頁，2024年2月25日，星期天解碼位點和肽酰轉(zhuǎn)移酶中心都沒有蛋白成分?，F(xiàn)在已經(jīng)確定，距離肽酰轉(zhuǎn)移酶中心最近的核糖體蛋白沒有催化作用，它們的功能主要是維持活性位點的構(gòu)象。盡管核糖體的解碼和肽酰轉(zhuǎn)移酶中心以RNA為主，核糖體蛋白也發(fā)揮著非常重要的作用。沒有了蛋白成分，核糖體既不能裝配也不會發(fā)揮其功能。第81頁,共90頁，2024年2月25日，星期天現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在翻譯的各階段均有rRNA的參與，rRNA的正確結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)發(fā)揮催化功能所必需的。在翻譯起始過程中，rRNA的3’端直接與mRNA作用；16SrRNA在A和P位直接與反密碼子作用；23SrRNA與肽酰-tRNA的CCA端直接作用；大小亞基的結(jié)合可能涉及到