進(jìn)境針葉樹原木、木制品和木質(zhì)包裝材料中松材線蟲的檢疫操作規(guī)程

進(jìn)境針葉樹原木、木制品和木質(zhì)包裝材料中松材線蟲的檢疫操作規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)適用于對松材線蟲疫區(qū)國家和地區(qū)輸華貨物的所有針葉樹原木，木制品和木松材線蟲是松樹等針葉樹上的一種寄生線蟲，隸lenchida),滑刃科(Aphelenchoididae),傘滑刃亞科(Bursaphelenchinae),傘滑刃線蟲屬(Bursaphelen-在松樹木材中，由于長喙殼屬Ceratocystisspp.,色二孢屬Diplodia線蟲的天牛稱之為媒介天牛。擴(kuò)散性3齡幼蟲(Lπ)dispersallarvaeLr在秋末冬初，罹病松樹木質(zhì)部內(nèi)松材線蟲蛻變?yōu)閿U(kuò)散性3齡幼蟲(L?),和普通3齡幼蟲(L)相比，Lg角質(zhì)膜顯著增厚，體腔內(nèi)含物濃稠，腸內(nèi)積聚類胎小滴，特別耐饑餓、耐干燥和耐低溫等不良環(huán)境。持久性4齡幼蟲(Ly)dauerlarvaeLy在媒介天牛幼蟲越冬和化蛹期間(冬季至春季),Lm不斷向天牛蛹室集中，并且在媒介天牛羽化時(shí)大量的L1蛻變?yōu)槌志眯?齡幼蟲(Lm)。Lm形態(tài)變化很大，除角質(zhì)膜增厚外無口針，食道退化，頭圓丘形，尾端明顯指狀，腸內(nèi)積聚類脂，貯存糖原。Ly特別抗干燥，體表覆蓋保護(hù)性膠粘物適于媒介天牛的傳播。下列符號適用于本標(biāo)準(zhǔn)。N——測計(jì)的樣本數(shù)目L——蟲體體長(pm或mm)a——體長(L)/蟲體最大體寬b——體長(L)/唇至食道腺基部的長度C——體長(L)/尾長(肛門至尾尖)V——頭頂至陰門的長度/體長(L)×100%S——口針長度(pm)S,—交合刺長度(pm)松材線蟲在松樹體內(nèi)的分布與媒介天牛的活動有關(guān)，當(dāng)松材線蟲危害松樹并導(dǎo)致松樹死亡后，為適應(yīng)不良的環(huán)境，病樹木質(zhì)部內(nèi)松材線蟲蛻變?yōu)閿U(kuò)散性3齡幼蟲(Lπ),當(dāng)媒介天?；己?，Lr則向蛹室聚集，并在媒介天牛羽化時(shí)大量的Lm蛻變?yōu)槌志眯?齡幼蟲(Lg),一且天牛羽化，Lm便進(jìn)入到天牛的氣管系統(tǒng)內(nèi)，隨羽化后的媒介天牛飛出。天牛攜帶L,飛出病樹后，通過天牛在健康松樹上補(bǔ)充營養(yǎng)時(shí)或在瀕死和已經(jīng)死亡的松樹上產(chǎn)卵時(shí)所造成的傷口，松材線蟲侵入松樹體內(nèi)，完成其侵染循環(huán)。松材線蟲的侵染循環(huán)和形態(tài)學(xué)特征是該檢疫操作規(guī)程的依據(jù)。5儀器、用具及藥品光學(xué)顯微鏡、解剖鏡、恒溫箱、40目網(wǎng)篩、500日(或400目)網(wǎng)第、紗布、淺盤、漏斗、酒精燈、斧頭、鋸酒精、福爾馬林(40%)、冰乙酸、甘油、三乙醇胺、蒸餾水、指甲油(無色)、乳酚油、封片蠟等。6現(xiàn)場檢疫6.1查驗(yàn)單證檢查報(bào)檢時(shí)隨附的單證并確認(rèn)進(jìn)境原木、木制品和木質(zhì)包裝材料的產(chǎn)地、品種，數(shù)量；驗(yàn)證來自美國、日本和韓國貨物的無木包裝聲明或熱處理證書是否與進(jìn)境貨物相符；根據(jù)貨主或代理人提供的報(bào)檢單證，對來自松材線蟲疫區(qū)國家和地區(qū)的針葉木，木片等木制品實(shí)施松材線蟲檢疫。3對于來自于松材線蟲疫區(qū)國家的進(jìn)口針葉樹原木，按每批總數(shù)比例的0.5%～5.0%隨機(jī)抽查，但抽查的原木數(shù)不得少于20根。重點(diǎn)檢查有無天牛危害癥狀。對于來自于松材線蟲疫區(qū)國家的造紙用針葉樹木片，分艙別，分層次按棋盤式選10點(diǎn)～50點(diǎn)扦取原始樣品并制成復(fù)合樣品。對于來自于松材線蟲疫區(qū)國家的木制品和木質(zhì)包裝材料須全面檢查其外表后，確定針葉木存在的位置，數(shù)量。用記號筆標(biāo)記存在藍(lán)變、具天牛蟲孔、新伐木(具明顯該材種氣味或新鮮韌皮部)、含水量大或具樹皮的可疑罹病木，并將其帶同實(shí)驗(yàn)室檢查。未發(fā)現(xiàn)上述可疑雅病木的，按每批總數(shù)比例的0.5%~5.0%隨機(jī)拍樣，但不得少于2件。6.3現(xiàn)場樣品采集用手鋸、斧頭或其他工具，采集標(biāo)記部位的樣品，每采樣點(diǎn)在采集時(shí)應(yīng)至少采集到樣品橫截面中心部位。將采集的每個(gè)小樣均分為兩份，均分后的小樣混合裝在2個(gè)密封袋中，進(jìn)行編號、記錄，作為該批貨物的混合待檢測樣品和留存樣品。若有必要，也可將針葉樹的可疑病木材直接帶回實(shí)驗(yàn)室后再進(jìn)行上述樣品的采集。采集的樣品臨時(shí)存放在5℃~25℃環(huán)境中，如采集的樣品較干燥(含水量14%以下),可在待檢測樣品的密封袋中放置一小塊潮濕的紗布或吸水紙，以保證樣品送檢過程中松材線蟲的存活率。待檢測的樣品應(yīng)在12h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行線蟲的分離，檢測。6.4貨物的后期監(jiān)管現(xiàn)場采集樣品后的貨物，在未獲得最終檢測結(jié)果前，須接受嚴(yán)格的檢疫監(jiān)管。貨物卸運(yùn)地必須相對隔離和易于接受監(jiān)管，其周邊必須無松材線蟲寄主樹林，以防止病變木材的散失和昆蟲的逃逸。7實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)7.1線蟲分離線蟲分離的具體方法參見附錄A。若發(fā)現(xiàn)媒介天牛成蟲，既要保護(hù)天牛的完整性以利天牛的種類鑒定，又要檢查是否攜帶松材線蟲，可以采取局部分離線蟲的方法，即將天牛的觸角端部或胸部腿節(jié)取下，搗碎后用漏斗法或淺盤法分離線蟲，也可直接浸泡于加水的表面皿或小培養(yǎng)皿中，2h后在解剖鏡下直接觀察是否有線蟲。7.2制片觀察根據(jù)上述分離方法，如分離到線蟲，將線蟲置于解剖鏡下，挑取或吸取線蟲至含1滴水的載玻片上，使線蟲沉底并位于水滴中央，于酒精燈火焰上過5g~6s致使線蟲恰好被殺死為止，加蓋蓋玻片后，待將制好的玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察。8松材線蟲的形態(tài)特征8.1傘滑刃線蟲屬(Bursaphelenchus)的主要形態(tài)特征和測計(jì)值蟲體細(xì)長(a值大于30),體長0.4mm～1.5mm。唇高，繼握?？卺樣袌A而小的基部球。排泄孔常位于中食道球后。雌蟲陰門有角質(zhì)膜陰唇或陰唇突；后陰子官囊長。尾有時(shí)園，尾端圓錐形或銳指狀，末端有或無尾尖突。交合刺成對、窄，常有拉長的頂尖(apex)和顯著的喙(rostrum),雄蟲尾弓形，短指狀，端生交合傘。生殖乳突數(shù)目可變。無引帶。8.2松材線蟲的主要鑒定特征雕雄成蟲均呈蠕蟲狀，長1mm左右；口針基部微厚；中食道球幾乎充滿體腔，食道腺細(xì)長，約為蟲體食道處體寬的3倍～4倍長，背部覆蓋；排泄孔位于食道和腸的交接處，有時(shí)位于神經(jīng)環(huán)水平處；半月8.3松材線蟲的形態(tài)測計(jì)值松材線蟲的形態(tài)測計(jì)值見表1。燃蟲bcV推中山b9結(jié)果判定9.1結(jié)果初判斷以雌、維成蟲的形態(tài)特征為依據(jù)，符合上述形態(tài)特征可鑒定為松材線蟲。目前，傘滑刃線蟲屬中有效種近50個(gè)，大多數(shù)種與昆蟲尤其是甲蟲和穿鉆性害蟲有關(guān)，常在針葉樹木內(nèi)出現(xiàn)，它們都是食真菌性的。同時(shí)，松材線蟲和其他同屬相近的種主要由墨天牛屬的媒介天牛傳播，故此線蟲的鑒定中易出現(xiàn)錯(cuò)誤。其中松材線蟲與擬松材線蟲(B.macrematus)形態(tài)最為相似，它們均出現(xiàn)在針葉樹木材內(nèi)，并且有交合刺遠(yuǎn)端膨大和陰門蓋，兩者的主要區(qū)別是雌蟲尾部特征，松材線蟲雌蟲尾端寬圓，無尾尖突，或有尾尖突，但尾尖突長度不超過2μm(一般為1pm左右);而擬松材線蟲尾端指狀，有尾尖突，長度在3.5μm以上(常超過5pm)。在口岸的檢疫中，有時(shí)只發(fā)現(xiàn)線蟲的幼蟲，可進(jìn)行保溫保濕培養(yǎng)或單異活體培養(yǎng)，獲得成蟲后再對線蟲作進(jìn)一步的鑒定(參見附錄B)。9.2結(jié)果復(fù)核對第1次藏獲松材線蟲的結(jié)果，需經(jīng)過專家復(fù)核。提供復(fù)核的材料為具松材線蟲雌成蟲，雄成蟲的線蟲分離液、臨時(shí)玻片、照相或影像材料等。10檢疫處理一旦發(fā)現(xiàn)截獲松材線蟲，須對進(jìn)境的針葉樹原木、木片、木制品和本質(zhì)包裝材料采取退貨，銷毀或檢驗(yàn)檢疫部門許可的檢疫處理措施。11樣品的保存保存樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存2個(gè)月。如發(fā)現(xiàn)松材線蟲，該樣品至少需保存6個(gè)月，以備復(fù)驗(yàn)、談判和仲藏。保存期滿后，含松材線蟲的樣品，必須經(jīng)滅活處理，處理方法為銷毀或熱處理(木材的中心溫度達(dá)到56℃時(shí)，處理30min以上)。(資料性附錄)松材線蟲分離方法A.1漏斗分離法其裝置是將漏斗(直徑10em~15cm)架在木架或鐵架上，下面接10cm長的橡皮管一段，橡皮管末端安裝一個(gè)止水夾。具體操作步驟如下：將劈好的細(xì)木片用雙重紗布包好，放在盛滿清水的漏斗中(由于線蟲的趨水性和自身的質(zhì)量，線蟲離開植物組織，在水中游動，最后沉降到漏斗末端的橡皮管中)。12h~24h后打開彈贊夾，用表面皿或小培養(yǎng)皿接取約5mL水樣直接鏡檢；或用離心管接取約5mL的水樣，靜置20min左右或1500r/min離心3min,傾去離心管內(nèi)上層清液后，即獲得濃度較高的線蟲水懸浮液后，再進(jìn)行鏡檢。A.2淺盤分離法淺盤分離法裝置由兩只不銹鋼淺盤，線蟲濾紙或?qū)挿l(wèi)生紙組成。一只淺盤口徑小，可套放于另一只淺盤內(nèi)，并且其底部用粗篩網(wǎng)(10目)取代，被稱為篩盤；另一只是正常淺盤。將線蟲濾紙(無專用線蟲分離濾紙的可用擦鏡紙或雙層衛(wèi)生紙代萃)平放在篩盤賠網(wǎng)上，用水淋濕，接著將劈好的細(xì)木片撒在其上；從兩只淺盤的夾縫中注水，以淹沒供分離的材料為止；在15℃~28℃下放置1d~3d后，將淺盤中的水連續(xù)通過500目的篩網(wǎng)，然后將500目標(biāo)準(zhǔn)篩上的含線蟲的殘留物沖洗到小培養(yǎng)皿中，供鏡檢。A.3其他分離方法用斧頭將木材劈成薄的木片(厚度在0.5cm以下),浸泡于大盆或塑料桶中，于室溫下浸泡1d~3d后移去木片，將盆或桶中的水連續(xù)通過40目和500目的篩網(wǎng)，然后將500目標(biāo)準(zhǔn)篩上的含線蟲的殘留物沖洗到小培養(yǎng)皿中，供鏡檢。該方法簡單方便，可分離的樣品數(shù)量大，得到的線蟲量多。使用以上方法分離松材線蟲時(shí)，室內(nèi)溫度應(yīng)要保持在15℃~28℃之間；當(dāng)室溫過高或過低時(shí)(影響線蟲的分離效果),須在恒溫設(shè)施中進(jìn)行松材線蟲的分離。(資料性附錄)松材線蟲成蟲的培養(yǎng)當(dāng)分離得到的線蟲數(shù)量較少或僅分離到形態(tài)和松材線蟲形態(tài)相似的線蟲幼蟲時(shí)，可通過培養(yǎng)獲得大量成蟲，以便進(jìn)一步鑒定。B.1病木保溫保濕培養(yǎng)將樣品鋸成小段，置于燒杯中，加少量清水，使木段下端浸在水中，木段上端用濕紗布覆蓋，在25℃保溫保濕培養(yǎng)放3d～4d,倒取杯中水液，可獲得較多雌雄成蟲?；?qū)悠愤m量噴濕，散于塑料袋里扎緊，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中3d~4d取出重新分離，可獲得較多雌雄成蟲。B.2單異活體培養(yǎng)通常用灰葡萄孢(Botrytiscinerea)或多毛孢(Pestalotiasp.)培養(yǎng)松材線蟲。制取馬鈴薯一葡萄糖一瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板，挑取PDA斜面上的一小塊灰葡萄孢，移在PDA平板上，放入25℃~28℃恒溫箱培養(yǎng)，經(jīng)4d～5d菌絲可鋪滿平板。將線蟲集中在指形管中，加入線蟲消毒液后加塞振蕩1min。經(jīng)過幾分鐘消毒處理后，線蟲也沉降到指形管的底部，用移液管吸去上層藥液，最后用滅菌水洗滌2次～3次。在長滿灰葡萄孢的PDA平板上接種表面消毒了的線蟲懸浮液0.5mL,在25℃~28℃恒溫箱中培養(yǎng)平板，一般經(jīng)過一周便可產(chǎn)生大量線蟲，常用于松材線蟲消毒的消毒液及處理時(shí)間見表B.1,也可將待消毒