解密固定相參數(shù)

2/2解密固定相參數(shù)

2023-06-1609:24本文通過介紹網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，給讀者提供一種色譜柱選擇的新思路。對于色譜柱固定相各參數(shù)，本文給出了詳細解釋說明，提供了具體應(yīng)用策略，給廣大讀者提供了借鑒意義。藥品質(zhì)量研究階段，有關(guān)物質(zhì)方法開發(fā)是一項極具挑戰(zhàn)性的工作。但由于色譜柱選擇不當(dāng)，導(dǎo)致方法開發(fā)過程低效費時。如何高效的找到自己所需的色譜柱？2017年，筆者有幸聆聽了肖柏明老師的講座，隨后便開始關(guān)注色譜柱的選擇。本文筆者結(jié)合自己的應(yīng)用，簡單介紹一下如何利用固定相參數(shù)選擇色譜柱。當(dāng)然，條條大道通羅馬，有些情況我們改其他參數(shù)也能獲得成功。但本文僅討論如何根據(jù)固定相參數(shù)選擇色譜柱，獲得我們想要的結(jié)果。在討論固定相參數(shù)之前，筆者先簡單的介紹幾個日常工作中常用的色譜網(wǎng)站。http://www.hplccolumns/app/USPNF/columnsHPLCColumn網(wǎng)站筆者使用頻率較高，可以根據(jù)不同參數(shù)，選擇不同的色譜柱。此網(wǎng)站與U.S.PharmacopeialConvention網(wǎng)站中PQRIDatabase數(shù)據(jù)庫基本一致，測試方法是Snyder/Dolan法。目前，兩組數(shù)據(jù)庫內(nèi)均有700多款色譜柱，市面常見色譜柱都能查到。ACD/Labs網(wǎng)站色譜柱參數(shù)測試方法應(yīng)該是Euerby法，而U.S.PharmacopeialConvention中USPDatabase數(shù)據(jù)庫是采用的美國藥典方法。這兩個數(shù)據(jù)庫的色譜柱少一些，但鑒于測試模型不同，在篩選色譜柱時可以相互參考。本文的介紹僅以HPLCColumn數(shù)據(jù)庫為例，討論如何應(yīng)用這些參數(shù)來篩選色譜柱。表1是HPLCColumn數(shù)據(jù)庫參數(shù)列表的部分節(jié)選，筆者僅討論Fs、H、S*、A、B、C(pH2.8)、C(pH7.0)及EBretentionfactor等參數(shù)，其他基本信息就不再討論。表1HPLCColumn數(shù)據(jù)庫參數(shù)列表（節(jié)選）

Fs-此參數(shù)用來衡量兩款色譜柱的相似度。Snyder/Dolan法中，如果Fs≤3，可認為兩款色譜柱相互替代。利用這個參數(shù)，可以幫助我們查找相似的色譜柱。比如藥典方法規(guī)定的色譜柱，如果暫時沒有，可利用此參數(shù)查找替代品。如果方法開發(fā)中，某色譜柱無法滿足分離要求，此時需要查找與所用色譜柱Fs值差異較大的色譜柱，這樣才能提供不同的分離效果。H/EBretentionfactorH-疏水性作用力，EBretentionfactor-乙苯保留因子。H值是所有鍵合相疏水作用力的綜合，包括一些封端基團的疏水性。EBretentionfactor用于衡量中性物質(zhì)保留強弱。EBretentionfactor一般與H項對應(yīng)，H數(shù)值大，EBretentionfactor一般也大，如表1中的ZorbaxBonusRP與ECNucleosil100-5Protect1色譜柱。但也有不一致的情況，如表1中的ZorbaxBonusRP與HypersilPrismC18RP色譜柱。造成這種現(xiàn)象的原因可能來自兩方面：一方面是由于封端基團所致。這些基團雖然提供了H值，鑒于其接近硅膠球，未與乙苯接觸，故未提供保留作用。第二個方面可能是由于乙苯的結(jié)構(gòu)所致。對于鍵合相較密的固定相，乙苯難以進入，故對其保留有影響。根據(jù)筆者的工作經(jīng)驗，采用EBretentionfactor這個數(shù)值判斷保留的強弱要比H值相對準確一些。有關(guān)物質(zhì)方法開發(fā)中，時常遇到有關(guān)物質(zhì)保留太強，需要高濃度有機相洗脫。此時可根據(jù)EBretentionfactor選擇數(shù)值低一些的色譜柱，減弱其保留。如表1所示，HypersilPrismC18RP色譜柱的EBretentionfactor為4.8，ECNucleosil100-5Protect1色譜柱的EBretentionfactor為2.7，兩者相差約兩倍。同比例有機相情況下，ECNucleosil100-5Protect1對中性物質(zhì)的保留要弱一些。雖然兩款柱子EBretentionfactor相差約兩倍，但這并不表示有機相比例可降低2倍。根據(jù)洗脫的3倍原則，有機相比例改變10%，保留因子改變約3倍。而HypersilPrismC18RP與ECNucleosil100-5Protect1兩款色譜柱保留因子僅改變約2倍，因此即便更換這兩款色譜柱，其有機相比例變化也不會超過10%。這一點，在應(yīng)用此參數(shù)時需要注意。S*-空間位阻，較大的S值意味固定相鍵合的比較緊密，這會導(dǎo)致體積較大的溶質(zhì)分子不容易進入鍵合相，保留較弱。筆者在實際工作中主要運用此參數(shù)進行非對映異構(gòu)體的分離。比如苯環(huán)上不同位置的基團影響溶質(zhì)分子體積的大小，這時候就可以利用S值選擇色譜柱對此類異構(gòu)體分離。筆者曾遇到苯環(huán)上位置異構(gòu)的兩個雜質(zhì)，在多數(shù)色譜柱上均基本重合，無法有效分離。筆者利用S值選擇的色譜柱，卻基本實現(xiàn)了基線分離。至于S值較大對異構(gòu)體分離有利還是較小有利，目前筆者幾個試驗結(jié)果證明S值較大對異構(gòu)體分離有利。但此參數(shù)的規(guī)律性并不強，后期還需繼續(xù)研究總結(jié)。A-氫鍵酸性，此參數(shù)代表固定相與堿性物質(zhì)形成氫鍵能力。氫鍵酸性是由于固定相硅醇基引起，因此封端的色譜柱氫鍵酸性要比不封端的色譜柱氫鍵酸性要小一些。B-氫鍵堿性，此參數(shù)代表固定相與酸性物質(zhì)形成氫鍵的能力。形成機理并沒有較明確的解釋，目前主要有兩種看法：一是固定相殘存的金屬離子所致，二是固定相嵌入的極性基團所致。方法開發(fā)中，通過引入?yún)?shù)A或者參數(shù)B可改變選擇性。表1中所示3款色譜柱均為極性嵌入的色譜柱，其B值均較大，因此容易與酸性物質(zhì)形成氫鍵作用力。對于酸性化合物，此3款色譜柱均能提供與常規(guī)C18柱完全不同的分離效果。C(pH2.8)/C(pH7.0)-在pH2.8/7.0條件下的離子交換能力，離子交換能力的大小受流動相pH值及固定相類型影響。C＞0表示固定相表面帶負電荷，C＜0表示固定相表面帶正電荷。C值越大表示固定相與堿性物質(zhì)的作用力越強，但同時也會降低離子化酸性物質(zhì)的保留時間。實際工作中，筆者很少利用此參數(shù)增強或減弱物質(zhì)保留，而是利用其改善堿性物質(zhì)的拖尾。方法開發(fā)中，鑒于硅膠本身偏酸性，因此一般首選偏酸性的流動相體系。酸性條件下，很多堿性化合物會出現(xiàn)拖尾，比如季銨鹽類藥物。此時若想改善峰形，便可利用C(pH2.8)這個參數(shù)。C(pH2.8)值較大時，色譜峰容易拖尾；而C(pH2.8)值較小時，色譜峰形較好，但其保留也會相應(yīng)減弱。同樣，在中性條件下，因硅醇基的存在導(dǎo)致的拖尾，可利用C(pH7.0)進行修正。C(pH7.0)數(shù)值為負時，填料表面攜帶正電荷，這樣可能會掩蓋硅醇基位點，避免堿性物質(zhì)與其發(fā)生離子交換，減少拖尾。以上便是筆者對HPLCColumn網(wǎng)站各色譜柱參數(shù)的功能介紹，鑒于筆者能力所限，難免有不當(dāng)之處，敬請各位讀者批評指正。另外，利用這些參數(shù)還可以幫助我們合理配置實驗室的色譜柱，避免功能類似的色譜柱，增加選擇性互補的色譜柱，讓廣大色譜工作者在方法開發(fā)時更加得心應(yīng)手。

參考文獻：

《現(xiàn)代液相色譜技術(shù)導(dǎo)論》

《Thehydrophobic-subtractionmodelofreversed-phasecolumnselectivity》

《ColumnSelectionforHPLCMethodDevelopment》

《ASimpleandInteractiveColumnClassificationforReversed-PhaseLiquidChromatography》

《EvaluationofRetentionandSelectivity