急性毒性試驗

關(guān)于急性毒性試驗

急性毒性試驗(單次給藥毒性試驗)主要觀察對實驗動物一次給藥后所產(chǎn)生的毒性癥狀及其程度，出現(xiàn)和消失的時間，死亡的發(fā)生率并計算出其最大給藥量，最小致死量、半數(shù)致死量(LD50)等。由于中藥毒性常較小，單次給藥往往不能表現(xiàn)明顯的毒性作用，我國藥政部門把一日內(nèi)多次給藥觀察受試藥物毒性的實驗也稱作急性毒性實驗。急性毒性試驗的目的是推測新藥對人的急性毒性的強弱。同時，它可以為長期毒性試驗、生殖毒性試驗、致突變試驗等試驗設(shè)計提供劑量選擇依據(jù)和有關(guān)毒性信息，還可以推測受試藥物毒性發(fā)生的速度和持續(xù)時間，與半數(shù)有效量(ED50)比較判斷新藥的安全系數(shù)。因此，急性毒性試驗對了解新藥的毒性是非常必要的。鑒于種種因素造成急性毒性試驗結(jié)果(癥狀和致死量)在不同實驗室內(nèi)有較大的差異，且耗費大量動物而所取得的動物毒性的信息量相對較少，因此，各國目前都在修訂急性毒性試驗的技術(shù)要求，希望能利用盡可能少的動物數(shù)量而取得有價值的信息，同樣達(dá)到急性毒性試驗的目的。第2頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

第一節(jié)急性毒性試驗方法的有關(guān)問題

一、動物

(一)動物種動物種(或系)的差異是動物急性毒性差異的主要原因，藥酶則是毒性種差的重要原因之一。為推測新藥對人的急性毒性，某些發(fā)達(dá)國家動物急性毒性試驗要求包含非嚙齒類動物(除家兔外)在內(nèi)的兩種動物，我國對此未作出明確規(guī)定。由于中藥已在臨床長期使用，一般認(rèn)為，如尤特殊情況，使用一種動物已基本上達(dá)到急性毒性試驗的目的。目前雖常用的實驗動物是小鼠或大鼠。但在某些特殊情況下，例如受試物中已知含有強烈胃腸刺激物，就還應(yīng)再采用非嚙齒類大動物進行實驗，否則，即使毒性較大(如巴豆)也并不能引起大、小鼠嘔吐反應(yīng)。第3頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

(二)動物的年齡、性別、體重急性毒性受動物的健康狀態(tài)、年齡、性別、遺傳因素、體重、藥物的吸收、分布、代謝、排泄和內(nèi)分泌激素等的影響。未成年的動物藥酶活性一般較低，對于經(jīng)代謝后減毒的藥物表現(xiàn)毒性較強。而且，年幼動物藥物代謝功能和敏感度較易發(fā)生變化，性別間的特性也尚未確立，因此，口服毒性通常使用年輕的性成熟的動物，—般小鼠6—8周齡，兩種性別，體重18-22g(同次試驗體重相差不超過2g)，大鼠6—8周齡，兩種性別，體重120～150g(同次試驗體重相差不超過10g)。

(三)動物數(shù)量視不同試驗而異。最小致死量或半數(shù)致死量，小動物(大鼠、小鼠)試驗組在三組以上，每組—般至少10只動物(雌雄各半)。一些國家對動物數(shù)和組數(shù)不作規(guī)定，因此，有只用3只一組經(jīng)多組試驗測得近似致死量或LD50者。大動物(犬、猴)并不—定要求得到LD50，可用少量動物采用劑量遞增的方法觀察中毒癥狀，求近似致死量即可。最大給約量試驗—般要求用小鼠或大鼠20只即可。第4頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二、試驗準(zhǔn)備實驗應(yīng)在符合GLP的實驗室內(nèi)進行，實驗樣品質(zhì)量和穩(wěn)定性應(yīng)符合要求，與藥效學(xué)及臨床試驗一致。

(一)樣品液的配制中藥材町用濃縮煎劑或浸膏，中藥制劑可用不含輔料的提取物加水或用o．5％羧基纖維素鈉，0．5％吐溫—80，5％阿拉伯膠等混懸劑、增溶劑配成混懸液等，盡可能配成水溶液，水不溶性成分可用植物汕配成油溶、乳濁液。也有用乙醇、聚乙醇等溶劑配成樣品液者，但溶劑本身的急性毒性能干擾試驗結(jié)果，因此，急性毒性試驗報告中應(yīng)對樣品液的配制方法加以詳細(xì)說明，必要時設(shè)溶劑對照組。

(二)樣品液的濃度及給藥容量為了求得最低致死且或半數(shù)致死量，需要設(shè)不同劑量組，使部分組反應(yīng)率在50％以上，部分組反應(yīng)率在50％以下。不同劑量的設(shè)定有兩種方式，—是濃度一定不同給藥容量，另—種是容量一定不同給藥濃度，兩者各有所長。濃度一定適用于某些已經(jīng)固定濃度的制劑，其有利之處是避免了滲透、粘度、溶質(zhì)顆粒的分散狀態(tài)等理化性狀不—致對毒性試驗結(jié)果的影響，因此，濃度一定也可得到較好的結(jié)果，但由于動物的投藥用量是有限的，范圍較窄，按體重給藥容量難以達(dá)到試驗要求。因此，通常采用同容量不同濃度的給藥方法，注射給藥藥液濃度應(yīng)勺體液濃度等滲(至少不應(yīng)低滲)，口服液不必作特殊考慮，對毒性低的中藥制劑而言，應(yīng)以能保持一定流動性的最大濃度作為口服樣品液。第5頁,共52頁，2024年2月25日，星期天三、給藥方法

(一)動物禁食動物購入后應(yīng)在實驗室觀察1星期，口服給藥前，為減少吸收差異和大容量給藥造成胃急性擴張，小鼠和大鼠至少應(yīng)停食4-6h，要求一夜停食(不停水)，投藥后再停食3-4h。

(二)給藥途徑中藥新藥除臨床給藥途徑外，—、二類新藥還希望其他給藥途徑，水溶性藥物應(yīng)同時采用靜脈給藥途徑，其他如油劑，混懸劑之類可采用皮下給藥途徑。腹腔汁射在人體極少用，中藥粗制劑成分復(fù)雜，動物毒性試驗中也盡可能少用，以避免腹腔刺激性的干擾。各給藥途徑的容量一般為小鼠0．4—0．5ml／20g(體重)，大鼠lml／l00g(體重)。小鼠口服最大容量不超過0．8ml／20g(體重)，其他途徑不超過0．5ml／20g(體重)。大鼠口服最大容量不超過2ml／l00g(體重)，其他途徑不超過lml／l00g(體重)。第6頁,共52頁，2024年2月25日，星期天四、急毒試驗觀察指標(biāo)和致死量的計算

(一)觀察指標(biāo)不能把求得致死劑量看作是急性毒性實驗的唯一要求。發(fā)現(xiàn)毒性癥狀及毒性反應(yīng)的靶器官同樣是急毒實驗非常重要的目的。給藥前后應(yīng)觀察體重、進食、進水的狀況，密切觀察異常毒性癥狀，特別是給藥后的一、二日。以后1日至少觀察1次，觀察7日觀察癥狀包括①行動：不安定、多動、發(fā)聲；②神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：舉尾、振顫、痙攣、運動失調(diào)、姿態(tài)異常；③自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：眼球突出、流涎、流汨、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸；④死亡。應(yīng)每日記錄體重、毒性反應(yīng)和死亡情況，瀕死動物應(yīng)單獨飼養(yǎng)，死后及時解削進行肉眼觀察和病理組織學(xué)觀察。試驗結(jié)束存活動物也進行解剖，如有病變進行組織學(xué)觀察。(二}致死劑量計算可用Bliss點斜法、簡化機率法、改進寇氏序貫法等計算最小致死量或半數(shù)致死量。Bliss法嚴(yán)謹(jǐn)精確，缺點是計算非常繁復(fù)。但近代有計算機軟件，汁算方法可推薦Bliss法。各種方法原則基本相同，如：①劑量劉數(shù)值應(yīng)為等差，即劑量應(yīng)按等比級數(shù)排列；②各組動物數(shù)應(yīng)相等；③死亡率應(yīng)在50％上下基本對稱分布等。但各種方法還各有特殊設(shè)計要求，如有的要求Dm和Dn必須為100％和0％死亡率等，可參考有關(guān)專著，此處不贅述。如受試物毒性低，測不出LD50，可求得最大給藥量。第7頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)急性毒性試驗方法一、LD50的測定最小致死量是使動物剛好致死的藥物劑量，但由于藥物的性質(zhì)，給藥方法和個體差異，每只動物的最小致死量確很大的差異，實驗和統(tǒng)訓(xùn)學(xué)原理表明一群動物最小致死量的平均值相當(dāng)于半數(shù)致死量。半數(shù)致死量測定方法很多，但實驗沒計大同小異，所不同者為算方法的不同，其試驗方法如下：預(yù)試驗：目的是找出0％及100％估計致死量。更確田地說是找到—個0死亡的最大劑量和100％死亡的最小劑量的估值以決定實驗中采用的最大劑量(Dm)和最小劑量(Dn)，，這在測定中非常重要，是實驗成敗的關(guān)鍵?？捎么苹蛐坌詣游铮O(shè)四組以上，每組3-4只，先用1；10的劑量比給藥(如5mg／kg、50mg／kg、500mg／kg、5000mg／kg固定劑量)。觀察7日，記錄死亡動物數(shù)。然后在死亡數(shù)4／4和0／4兩組之間按1；2(如50mg/kg、100mg/kg、200mg／kg、400mg／kg)以下的劑量比進行重復(fù)試驗，以此測得近似的0和100％死亡率。第8頁,共52頁，2024年2月25日，星期天正式試驗：在預(yù)試驗Dn和Dm劑量范圍內(nèi)按等比設(shè)三個以上劑量組，其組間劑量的比值，一般在1；0．6至1：0．9范圍內(nèi)。購入動物試驗前應(yīng)馴化1星期，隨機或按體重分組，每組10只以上，雌雄各半，分別編號，給藥前應(yīng)禁食(不禁水)過夜。各給藥組和溶劑對照組按體重給藥后，試驗當(dāng)日應(yīng)多次觀察，第二日至最后—日應(yīng)每日有二人以上同時觀察1次并及時詳細(xì)汜錄毒性反應(yīng)癥狀，癥狀出現(xiàn)和消失的時間，死亡時間，第七日全部動物測量體重處死并剖檢，肉眼觀察病變情況。有毒性反應(yīng)、體重減輕或臟器有病變的動物應(yīng)在剖檢后立即進行主要臟器的病理組織學(xué)觀察。

LD50和最小致死量及其可信限的汁算可采用Bliss法，改進寇氏法、點斜法、簡化概率單位法或其他的計算方法。汁算結(jié)果對比表明，不同的汁算方法，結(jié)果間一般無明顯差異，而不同實驗室對同一樣品試驗結(jié)果卻常見有顯著差異。岡此，采用較簡單的計算方法完全可以滿足LD50計算的準(zhǔn)確性。第9頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二、最大給藥量試驗如同受試藥物的濃度或體積限制，無法測出半數(shù)致死量(LD50)時，作最大給藥量試驗。試驗選用擬推薦臨床試驗的給藥途徑，以動物能耐受的最大濃度(溶液仍有較好的流動性)，最大體積的給藥量1次或1日內(nèi)2～3次給予動物。以小鼠口服為例：動物數(shù)不得少于20只，雌雄各半，容量—次不超過0．4ml/10g(體重)，多次給藥間隔時間不低于4h，觀察7日，汜錄毒性反應(yīng)和體重變化。如仍未見毒性反應(yīng)或體重正常增加，則可認(rèn)為該藥物小鼠最大給藥量未見毒性反應(yīng)，或LD50大于最大給藥量。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算，該劑量不可能大于LD14。如用10只動物未見毒性反應(yīng)或死亡則該劑量不可能大于LD26。

第10頁,共52頁，2024年2月25日，星期天三、近似致死量試驗國外近年來有采用少量動物進行近似致死量測定的方法。其中有的類似LD50的預(yù)試驗或霍恩氏法。每組用3—4只動物，設(shè)多組，詳細(xì)觀察并汜錄動物毒性反應(yīng)井進行血液學(xué)，血液生化以及病理組織學(xué)觀察。有的采用劑量遞增法即—只動物一個劑量以幾何級數(shù)遞增，根據(jù)前個劑量的反應(yīng)，決定下—個劑量?；虿捎脛┝坷鄯e法，同一批動物間隔一定時間、劑量由小到大給藥，觀察毒性反應(yīng)，同時結(jié)合血藥濃度的測定，確定動物的急性毒性反應(yīng)、靶器官、中毒或致死劑量、毒性反應(yīng)時的血藥濃度。劑量遞增法類似于LD50測定的階梯法(或稱序貫法、上下法)，適用小動物而且毒性反應(yīng)出現(xiàn)快的試驗，10—20只動物即可測定。劑量累積法則適用大動物，利用大約6只合格動物即可進行急性毒性試驗的全面觀察。另外，國外還有采用固定劑量給藥觀察近似致死劑量，以決定藥物毒性大小者。第11頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

四、急毒試驗結(jié)果評價

(一)可靠性評價為保證急毒結(jié)果，實驗條件應(yīng)符合GLP的要求，供試品質(zhì)量穩(wěn)定，動物合格，實驗方案，實驗原始記錄，標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，總結(jié)報告應(yīng)符合要求。總結(jié)報告中應(yīng)包括摘要、供試品、試驗動物，試驗環(huán)境、給藥方法、觀察方法、毒性反應(yīng)癥狀、體重變化、病理組織學(xué)變化、雄性反應(yīng)和死亡出現(xiàn)的時間、LD50和LD5及其可信限的計算方法、結(jié)果討論等。根據(jù)試驗結(jié)果對急性毒性進行全面評價。

第12頁,共52頁，2024年2月25日，星期天(二)安全性評價

(1)根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果判斷供試藥物毒性的強弱、類型。國內(nèi)尚無統(tǒng)—規(guī)定。

(2)急性毒性試驗結(jié)果對臨床研究有指導(dǎo)意義，可以為臨床研究時探索安全有效劑量避免出現(xiàn)急性不良反應(yīng)提供依據(jù)。但是，鑒于人體與各種動物對各類化合物的吸收、分布、代謝、排泄以及各類型毒性反應(yīng)的差異，尚無規(guī)律可循，現(xiàn)有化學(xué)藥品統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，在進行臨床研究時，仍應(yīng)根據(jù)實驗結(jié)果參考文獻資料報道進行由低到高的安全治療劑量的探索。

(3)急性毒性試驗結(jié)果對推測長期毒性試驗劑量具重要意義，、不同種動物之間的差異，急性毒性結(jié)果無論用體重劑量還是體表面積劑量計算常見有差異而尚無規(guī)律。如果急性毒性試驗與長期毒性試驗采用同種動物，則急性毒性試驗的劑量對長毒有更大的參考價伉。即使如此，還應(yīng)考慮該藥的蓄積作用。不同種動物間雖然也可以進行劑量推測但僅可作為參考．仍需要長期毒性試驗前進行必要的預(yù)試驗。第13頁,共52頁，2024年2月25日，星期天三、動物規(guī)格和數(shù)量長期毒性實驗一般由雌雄各半、健康無病、檢疫合格的動物組成。各組平均體重相似，體重變異不超過20％。對照組動物數(shù)，可以與給藥組相同，也可按公式計算：對照組動物數(shù)：給藥組動物數(shù)x劑量組數(shù)的平方根。試驗周期3個月之內(nèi)的，嚙齒類宜用6—8周齡的大鼠，每組數(shù)量不少于20只；非嚙齒類可用6—10月齡的犬，每組數(shù)量6只；試驗周期3個月以上的，嚙齒類宜用5、6周齡的大鼠，每組數(shù)量應(yīng)增至30-40只。非嚙齒類可用4-6月齡的犬，每組數(shù)量6只。確定每組動物數(shù)的原則，主要考慮藥物毒性致實驗動物死亡數(shù)，實驗中處死動物的批次和實驗結(jié)束時及停藥后觀察恢復(fù)狀況所需能用于統(tǒng)計分析的動物數(shù)。第14頁,共52頁，2024年2月25日，星期天四、飼養(yǎng)條件

(1)通風(fēng)良好：動物飼養(yǎng)室的換氣次數(shù)和氣流速度能控制在10～15次／h和13—18cm／s較好，目的是利于動物的散熱及排除臭氣、粉塵和微生物，又不明顯影響室內(nèi)的溫、濕度和動物的耗能。

(2)光照規(guī)律：因生物節(jié)律對動物的反應(yīng)性有明顯的影響，光照會影響動物的生物節(jié)律從而影響不同批次之間的毒性對比。大鼠、小鼠應(yīng)為12h明，12h暗；倉鼠應(yīng)是14h明，l0h暗。

(3)環(huán)境清潔：微生物或寄生蟲感染等，均叫能影響毒性試驗的結(jié)果。有條件者應(yīng)盡可能選用清潔級、SPF級試驗設(shè)施。

(4)溫、濕度適中且穩(wěn)定：常溫動物在15—33C下，體溫波動在1.5C以內(nèi)。濕度是種潛熱，宜控制在30％—70％。溫度、濕度的突然變化，體溫雖然變化不大，但并不意味著動物的生理狀況未受影響，同樣可以導(dǎo)致動物對外環(huán)境變化的抵抗力降低，影響毒性實驗結(jié)果。

(5)室內(nèi)噪聲最好在50dB以下：雌雄分養(yǎng)，不宜擁擠，必要時(如摻飼給藥或需精確測定飲食量時)單籠飼養(yǎng)，但要注意單養(yǎng)和群養(yǎng)的動物劉藥物的反應(yīng)是有差異的。各劑量組和對照組的飼養(yǎng)條件應(yīng)等同。室內(nèi)飼養(yǎng)另種動物，或其他飼養(yǎng)條件的突然改變，均可引起實驗動物應(yīng)激反應(yīng)，從而影響毒性實驗結(jié)果。

(6)食物應(yīng)清潔，無霉變：食物中的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物等營養(yǎng)成分要符合各種動物的生理需求目恒定，因有時營養(yǎng)成分對藥物的毒性也有很大的影響。飲水要潔凈，防止病源微生物、重金屬或其他有毒物質(zhì)的污染。第15頁,共52頁，2024年2月25日，星期天長期毒性實驗第16頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

本書的長期毒性實驗與國際現(xiàn)行的反復(fù)給藥的毒性實驗概念是基本一致的，包含了過去“亞急性毒性實驗”、“亞慢性毒性實驗”、“慢性毒性實驗”及“終身毒性實驗”等稱謂。長期毒性實驗的主要目的有：—是觀察藥物在選定時間內(nèi)反復(fù)給予動物的情況下，動物出現(xiàn)損害的靶組織或器官及劑量—效應(yīng)關(guān)系和可逆性等；二是了解實驗動物對藥物能耐受的劑量范圍和對人來說可能無毒的安全劑量。組成長期毒性實驗的三個主要部分是實驗動物、受試藥物和觀察指標(biāo)。長期毒性試驗贊時、費力，故必須根據(jù)新藥類別、受試物性質(zhì)和用途、療程長短、急性毒性試驗和長期毒性預(yù)試驗結(jié)果等周密考慮，精心設(shè)計，以避免難以彌補的缺失。長期毒性試驗設(shè)計一般需要重點考慮以下幾個方面。第17頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

第一節(jié)實驗動物一、動物種類

(1)我國對中藥三、四類新藥，處方中各味藥材均符合法定標(biāo)準(zhǔn)，無毒性藥材，無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學(xué)處理(水、乙醇粗提者除外)，難以測出LD50，而給藥量大于20g(生藥)／kg(體重)，臨床用藥期為1星期以內(nèi)者可免做長期毒性實驗。

(2)符合上述條件，用藥1星期以上者及需反復(fù)應(yīng)用的藥物，規(guī)定可只選用大鼠進行長期毒性實驗。

(3)對一、二類新藥以及含有毒藥材、非法定標(biāo)準(zhǔn)藥材，或有十八反、十九畏等配伍禁忌的三、四類中藥新藥，我國及各國藥政部門普遍規(guī)定，長期毒性實驗應(yīng)用嚙齒類和非嚙齒類二種動物進行。嚙齒類中，大鼠公認(rèn)為首選動物，其次是小鼠、地鼠或豚鼠等；非嚙齒類中，常用的是犬，也可根據(jù)需要選用猴、貓、兔或小型豬等。第18頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二、動物品系實驗應(yīng)選用封閉群動物，如嚙齒類的Wistar或SpragueDewley品系大鼠，非嚙齒類的Beagle犬。既易得、易養(yǎng)、易于操作，又接近實際用藥人群的基因組成情況。除非有特殊目的，一般不用近親繁殖的動物。也有認(rèn)為雜交第一代鼠兼有對藥物反應(yīng)波動少和接近人群基因組成情況的優(yōu)點而提倡選用的，尚未被普遍接受。由于不同國家、不同實驗室的動物經(jīng)過長期傳代，其品系基因已發(fā)生了很大的變化，因此長期毒性實驗動物必須來源清楚，并有繁殖生產(chǎn)合格證號。第19頁,共52頁，2024年2月25日，星期天三、動物規(guī)格和數(shù)量長期毒性實驗一般由雌雄各半、健康無病、檢疫合格的動物組成。各組平均體重相似，體重變異不超過20％。對照組動物數(shù)，可以與給藥組相同，也可按公式計算：對照組動物數(shù)：給藥組動物數(shù)x劑量組數(shù)的平方根。試驗周期3個月之內(nèi)的，嚙齒類宜用6—8周齡的大鼠，每組數(shù)量不少于20只；非嚙齒類可用6—10月齡的犬，每組數(shù)量6只；試驗周期3個月以上的，嚙齒類宜用5、6周齡的大鼠，每組數(shù)量應(yīng)增至30-40只。非嚙齒類可用4-6月齡的犬，每組數(shù)量6只。確定每組動物數(shù)的原則，主要考慮藥物毒性致實驗動物死亡數(shù)，實驗中處死動物的批次和實驗結(jié)束時及停藥后觀察恢復(fù)狀況所需能用于統(tǒng)計分析的動物數(shù)。第20頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

四、飼養(yǎng)條件

(1)通風(fēng)良好：動物飼養(yǎng)室的換氣次數(shù)和氣流速度能控制在10～15次／h和13—18cm／s較好，目的是利于動物的散熱及排除臭氣、粉塵和微生物，又不明顯影響室內(nèi)的溫、濕度和動物的耗能。

(2)光照規(guī)律：因生物節(jié)律對動物的反應(yīng)性有明顯的影響，光照會影響動物的生物節(jié)律從而影響不同批次之間的毒性對比。大鼠、小鼠應(yīng)為12h明，12h暗；倉鼠應(yīng)是14h明，l0h暗。

(3)環(huán)境清潔：微生物或寄生蟲感染等，均叫能影響毒性試驗的結(jié)果。有條件者應(yīng)盡可能選用清潔級、SPF級試驗設(shè)施。

(4)溫、濕度適中且穩(wěn)定：常溫動物在15—33C下，體溫波動在1.5C以內(nèi)。濕度是種潛熱，宜控制在30％—70％。溫度、濕度的突然變化，體溫雖然變化不大，但并不意味著動物的生理狀況未受影響，同樣可以導(dǎo)致動物對外環(huán)境變化的抵抗力降低，影響毒性實驗結(jié)果。

(5)室內(nèi)噪聲最好在50dB以下：雌雄分養(yǎng)，不宜擁擠，必要時(如摻飼給藥或需精確測定飲食量時)單籠飼養(yǎng)，但要注意單養(yǎng)和群養(yǎng)的動物劉藥物的反應(yīng)是有差異的。各劑量組和對照組的飼養(yǎng)條件應(yīng)等同。室內(nèi)飼養(yǎng)另種動物，或其他飼養(yǎng)條件的突然改變，均可引起實驗動物應(yīng)激反應(yīng)，從而影響毒性實驗結(jié)果。

(6)食物應(yīng)清潔，無霉變：食物中的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物等營養(yǎng)成分要符合各種動物的生理需求目恒定，因有時營養(yǎng)成分對藥物的毒性也有很大的影響。飲水要潔凈，防止病源微生物、重金屬或其他有毒物質(zhì)的污染。第21頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)受試藥物一、藥物形式應(yīng)與臨床試驗用制劑完全—致(除可以不含賦形劑外)。三類以下的中藥新藥復(fù)方制劑，體積較大，以不含賦形劑如中藥浸膏作受試物為宜。固體制劑灌胃給藥，不溶于水的可制成餛懸液?；鞈乙阂鶆颍腆w物先磨成80目以上的細(xì)粉，再加1％左右的羧甲基纖維素鈉或10％左右阿拉伯膠助懸，冰箱放置，臨用前搖勻，短期內(nèi)用完，以免受試物活性下降。第22頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二、給藥途徑和方法給藥途徑應(yīng)盡量與臨床一致?？诜幬锟晒辔富驌斤暯o藥。灌胃給藥有血藥高峰期：摻飼給藥血藥濃度波動較小，維持時間較長。靜脈注射或肌內(nèi)注射給藥可以肌內(nèi)注射或皮下注射。腹腔注射時大部分藥物依然是首先入肝，因此不能完全代替臨床注射給藥途徑。皮下注射，大鼠每l00g體重不超過1ml，小鼠為0．1—0．3ml／l0g(體重)。肌內(nèi)注射，大鼠每腿不超過0．5ml，小鼠每腿不超過0．3ml。注射給藥應(yīng)嚴(yán)格消毒，并需經(jīng)常變換注射點以減少對局部的刺激，還應(yīng)考慮藥液的酸堿度和滲透壓。灌胃容積，大鼠一般每100g體重1—2ml，小鼠為0．1-0.3ml／l0g(體重)。犬等大動物常采用口服或摻飼給藥。從營養(yǎng)考慮摻飼藥量不宜超過攝食量的5％。摻飼給藥(摻入飼料或飲水中給藥)應(yīng)有保證攝入規(guī)定藥量的措施，還應(yīng)有均勻混合、穩(wěn)定性及質(zhì)量檢杳等措施。對中藥復(fù)方制劑很難做到這點，必須摻飼，給藥時，采用現(xiàn)喂現(xiàn)摻的方法較好。長期毒性實驗的給藥量應(yīng)根據(jù)動物體重的變化不斷調(diào)整，一般每期稱量體重并調(diào)整藥量1次。各劑量組應(yīng)采用等容量不同濃度給藥。第23頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

三、給藥分組

(1)應(yīng)設(shè)3個或9個以上的劑量組。高劑量組應(yīng)有少數(shù)動物出現(xiàn)嚴(yán)重毒性反應(yīng)或死亡(不超過20％)，低劑量組應(yīng)相當(dāng)或略高于藥效學(xué)試驗的有效劑而不出現(xiàn)毒性反應(yīng)，中劑量組在高低劑量組之可以等比關(guān)系排列。中藥—般毒性較低，體積較大。在即使最大限度提高劑量(技術(shù)上能投給的最高劑量)仍不能使動物中毒死亡的情況下，高劑量組應(yīng)相當(dāng)于臨床用量50倍以上，雖低不能低于臨床劑量的30倍(按千克體重計算)，且必須高于藥效學(xué)實驗的高劑量組。

(2)如采用臨床試驗用制劑，對照組應(yīng)給等容量的賦形劑，應(yīng)注意有時賦形劑或溶劑的種類和用量會影響藥物的實驗結(jié)果。如采用不含賦形劑制劑，對照組可給等容量的水等溶劑。如賦形劑或溶劑可能產(chǎn)生毒性時，還需另設(shè)空白對照組。第24頁,共52頁，2024年2月25日，星期天四、給藥周期不應(yīng)少于臨床療程的1倍。≤新藥審批辦法·中藥藥理毒理研究的技術(shù)要求≥中規(guī)定：中藥三、四類新藥，處方中各味藥材均符合法定標(biāo)準(zhǔn)，無毒性藥材，無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學(xué)處理(水、乙醇粗提除外)，難以測出LD50而給藥量大于20g生藥／kg(體重)，臨床用藥期為1早期以內(nèi)者町免做長期毒性實驗。1星期以上者及需反復(fù)應(yīng)用的藥物，可選用大鼠進行長期毒性實驗。對一、二類新藥以及含有毒藥材、非法定標(biāo)準(zhǔn)藥材或有十八反、十九畏等配伍禁忌的三、四類中藥新藥，長期毒性實驗應(yīng)用嚙齒類和非嚙齒類兩種動物進行。給藥周期：嚙齒類一般不超過6個月，非嚙齒類不超過9個月。第25頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)觀察指標(biāo)一、檢測次數(shù)試驗周期在3個月以內(nèi)的，末次給藥后24h，每組活殺部分動物(1／2—2／3)，檢測各項指標(biāo)，余下動物停藥繼續(xù)觀察2—4星期之后，同樣活殺全面檢測，以了解可能出現(xiàn)的遲緩性毒忭和毒性反應(yīng)的可逆程度。試驗周期在3個月以上的，可增加在實驗中期活殺少量動物(如高劑量組和對照組)檢測各項指標(biāo)。第26頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二、檢查項目

(一)一般檢查

(1)長期毒性試驗的癥狀發(fā)生得快慢不—。因此，在給藥開始l星期內(nèi)須嚴(yán)密觀察，以后每日至少觀察一次行為活動、外觀體征、糞便性狀等。非嚙齒類動物還可以觀察劉刺激的反應(yīng)等更高一層的行為變化。

(2)體重，反映動物的生長和一般健康狀況，也是反映毒性的敏感指標(biāo)，同時給約量的調(diào)也需根據(jù)體重的變化，因此至少每星期稱量記錄1次。

(3)攝食量的測定應(yīng)與體重變化同時測定。攝食量(g)／體重增加(g)是說明體重變化原因的重要指標(biāo)。

(4)攝水量的測定有時是必要的。對可能影響飲水量、尿量的受試藥物，或摻入飲水紿藥時，應(yīng)測定攝水量。

(5)死亡，是中毒最明顯的表現(xiàn)，但須注意與自然死亡或意外死亡的區(qū)別．應(yīng)及時進行剖檢和記錄。對瀕死動物應(yīng)立即處死，剖檢和進行血液學(xué)、血液生化及病理組織學(xué)檢查。第27頁,共52頁，2024年2月25日，星期天(二)實驗室檢查

1．血液學(xué)血常規(guī)(纖細(xì)胞和網(wǎng)織纖細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白含量、白細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞分類、血小板計數(shù))、出凝血時間等。反應(yīng)骨髓造血功能，外周各類血細(xì)胞的受損或活動情況，凝血機制的影響程度等。

2．尿液尿量、尿常規(guī)(尿蛋白、尿糖、尿血紅蛋白等)檢查，反應(yīng)腎臟功能、心臟和內(nèi)分泌功能。

3血液生化血液生化檢測反應(yīng)動物體內(nèi)各系統(tǒng)、各組織器官的功能狀態(tài)或受損情況。若能預(yù)測毒性作用的靶器官，可以有目的地選擇指標(biāo)，否則原則上應(yīng)盡可能多地進行檢測。嚙齒類受到血液量的限制，非吶齒類雖不受采血量限制，但實際上不可能無限制地選擇檢測項目，因此，—般首先選擇下列指標(biāo)以初步廠解受試藥物對機體的毒性概況，為較深入地研究受試藥物的毒性指明方向。

第28頁,共52頁，2024年2月25日，星期天(1)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶：主要反應(yīng)肝臟受損情況，其次為由心臟病變引起的肝臟淤膽或郁血。

(2)總膽紅素：反應(yīng)肝臟解毒功能和膽道排泄?fàn)顩r或溶血等。

(3)堿性磷酸酶(ALP)：增高反應(yīng)骨骼受到影響或肝臟排泄受阻或甲狀旁腺功能亢進。

(4)尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)：增高反應(yīng)腎臟功能受損或蛋白質(zhì)分解增強或脫水。

(5)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶：主要心臟受損情況。

(6)總蛋白(TP)：用以求出球蛋白含量。

(7)白蛋白：常見其濃度降低，反應(yīng)肝臟合成功能或胃腸消化吸收受影響后的攝入不足或腎臟受損丟失過多。其濃度增高見于脫水及血液濃縮。

(8)球蛋白：常見是其濃度增高，反應(yīng)受到感染或機體免疫功能亢進。其濃度降低較少見，原因可能是丟失增多或體液免疫受損。

(9)血糖(GLU)：增高或降低均上要與內(nèi)分泌系統(tǒng)改變有關(guān)。

(10)總膽固醇(T—CHO)：增高見于代謝減退，脂類動員增加等。第29頁,共52頁，2024年2月25日，星期天(三)病理組織學(xué)檢查病理組織學(xué)檢查目的足了解受試藥物毒性引起的質(zhì)性改變，是診斷毒性反應(yīng)的重要指標(biāo)。對給藥期間死亡動物、瀕臨死亡和計劃活殺動物都應(yīng)進行病理組織學(xué)檢杳。正確肉眼觀察記錄的同時要保留相應(yīng)的影像、照片等資料。常用方法和注意事項如下。

(1)處死動物時，要考慮到組織器官免受損傷，也要考慮到動物免受痛苦和應(yīng)激反應(yīng)。常用的麻醉后頸動脈或腹主動脈放血的方法比較合理。

(2)進行剖檢時，應(yīng)觀察皮膚、口鼻、眼耳等外觀，再剝離皮膚觀察皮下組織，最后剪開腹腔、胸腔及顱腔觀察內(nèi)腔組織器官及注射部位，包括組織器官的正常位置、形狀大小、顏色硬度及剖切面。取出的組織應(yīng)放在頂先排定組織器官名稱扦盛有生理鹽水的容器中．以防漏取及干燥。

(3)取材原則上應(yīng)盡量廣泛。考慮到中藥的特點，可根據(jù)急毒實驗發(fā)現(xiàn)有病變的器官組織和中藥藥性可能出現(xiàn)中毒的靶器官、靶組織具體確定。應(yīng)包括心、肝、脾、肺、腎等重要的實質(zhì)性器官組織。剖取的實質(zhì)性臟器應(yīng)稱重。

(4)病理切片原則亦應(yīng)盡量廣泛。在同一張片上盡量含有同一器官組織的不同層面。實際操作中可先對高劑量組動物及尸解發(fā)現(xiàn)異常器官進行重點切片檢查，在高劑量組發(fā)現(xiàn)有異常病變時再進行詳細(xì)檢查。第30頁,共52頁，2024年2月25日，星期天皮膚黏膜用藥的毒性試驗第31頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

皮膚黏膜用藥即局部用藥，包括皮膚用藥、直腸或陰道給藥、滴眼藥、滴鼻藥、滴耳劑、吸入劑及口腔咽喉用藥等。主要考察它們的局部毒性作用和局部用藥后引起的全身毒性作用。如果是局部用藥治療全身疾患的，還應(yīng)參照全身用藥的規(guī)定做長期毒性試驗。三、四類外用藥治療局部疾患且方中不含毒性藥材或有毒成分的，—般可不做長期毒性試驗，但需做局部刺激試驗、過敏試驗，必要時需做光敏試驗。有關(guān)皮膚黏膜用藥的毒性試驗分述如下。第32頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

第—節(jié)皮膚黏膜用藥急性毒性試驗皮膚黏膜用藥急性毒性試驗?zāi)康氖牵^察動物皮膚(完整皮膚和破損皮膚)或黏膜短時期(一般為單次，或中藥制劑毒性較低，24h內(nèi)數(shù)次)接觸受試物，因吸收作用而使機體產(chǎn)生毒性反應(yīng)。一、動物常用動物為成年健康的白色家兔、白色豚鼠、白色大鼠或白色小型豬，雌雄各半。嬰兒用藥用年輕的動物，如白色家兔(1．5kg左右)、白色豚鼠(o.2kg左右)。第33頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二、試驗方法

(一)皮膚準(zhǔn)備動物給藥前24h背部脊柱兩側(cè)去毛(剪、剃，或適宜脫毛劑)，去毛面積約為體表面積的10％(家兔約150cm2，豚鼠約40cm2，小型豬約300cm2)。去毛后24h檢杳去毛皮膚是否因去毛而受傷，受傷的皮膚不能作完好皮膚的毒性試驗。破損皮膚的制作采用不同方法將去毛消毒皮膚劃破(消毒手術(shù)刀作井字劃破或砂紙磨擦打毛)，以滲血為度。

(二)黏膜給藥盡量模擬臨床的用藥途徑。保證受試物與黏膜接觸4h以上。需設(shè)賦形劑對照組。如賦形劑有毒性，應(yīng)再設(shè)空白對照組。第34頁,共52頁，2024年2月25日，星期天(三)受試藥原則上盡量與臨床用制劑一致，并保證受試物與皮膚接觸良好。

1．劑量設(shè)置

(1)如果受試物毒性較大．預(yù)試驗時提高劑量可使大部分動物死亡，應(yīng)按全身給藥的原則，沒置幾個劑量組(完整皮膚組和破損皮膚組備數(shù)個劑量組)。具體方法可參見本篇“急性毒性試驗”。動物宜采用大鼠或豚鼠。

(2)如果受試物毒性較小，可只一個劑量組。每組家兔或豬4只，如用豚鼠需10只。并增加其他給藥途徑的最大給藥量試驗。第35頁,共52頁，2024年2月25日，星期天2．給藥方法受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚；如是固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑(如羊毛脂、凡上林、橄欖油等)混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好。藥物涂抹后應(yīng)以適當(dāng)?shù)姆ü潭?，如用無刺激性紗布、膠布或有孔尼龍繃帶固定；豚鼠或大鼠可用剪去指套的乳膠手套包住整個背部和腹部；如受試物是液體，應(yīng)先覆以聚乙烯薄膜，防止液體揮發(fā)。同時要注意防止試驗動物舔食受試物。黏膜用藥，如直腸或陰道或滴鼻或吸入用藥時，可將動物固定；口腔用藥時，可將藥物涂抹在下唇與齦之間(不能排除動物舔食受試物)；或提高受試物的黏稠度；或分次數(shù)用藥，目的是要保證受試物與黏膜接觸4h以上。有些毒性很小的外用制劑，也可用全身給藥途徑(如皮下注射等)反應(yīng)其毒性。受試物劑量應(yīng)以同面積不同濃度為宜。如采用其他方法，應(yīng)說明理由。第36頁,共52頁，2024年2月25日，星期天3．給藥周期皮膚黏膜用藥的急性毒性試驗時，受試物與皮膚或黏膜接觸不超過24h。根據(jù)中藥特點，可適當(dāng)提高濃度或增加24h內(nèi)用藥次數(shù)。給約24h后，用溫水或無刺激溶劑除去殘留受試物。

三、觀察記錄與檢查除去受試物后每日觀察至第七日，記錄動物的體重、皮膚毛發(fā)、眼和黏膜的變化，中毒表現(xiàn)的觀察項與全身給藥的急性毒性實驗相同。若有死亡動物，應(yīng)及時進行尸檢，有肉眼可見的病變應(yīng)進行病理組織學(xué)檢查。第37頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)皮膚黏膜用藥長期毒性試驗皮膚黏膜用藥急性毒性試驗?zāi)康氖?，觀察動物皮膚(完整皮膚和破損皮膚)或黏膜反復(fù)多次接觸受試物，因吸收作用而使機體產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。一、動物常用動物為成年健康的白色家兔(2kg左右)、白色豚鼠(0．3kg左右)、白色大鼠(0．2kg左右)或白色小型豬(7kg左右)，雌雄各半。嬰兒用藥應(yīng)用更年輕的動物，如白色家兔(1．1kg左右)、白色豚鼠(0．2kg左右)。第38頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二、實驗方法

(一)皮膚準(zhǔn)備皮膚長期毒性試驗和皮膚急性毒性試驗的皮膚準(zhǔn)備相同。

(二)受試藥物原則上盡量與臨床用制劑—致，并保證受試物與皮膚接觸良好。

1．劑量設(shè)置皮膚黏膜用藥的長期毒性試驗，一般設(shè)高、低兩個劑量組和一個對照組。高劑量組應(yīng)是使動物產(chǎn)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)或有少數(shù)動物死亡的劑量，低劑量組應(yīng)相當(dāng)或略高于藥效學(xué)有效劑量。具體方法可參見本篇“長期毒性試驗”。如急毒試驗濃度超過臨床用量20倍(經(jīng)劑量轉(zhuǎn)換)而未出現(xiàn)毒性反應(yīng)或死亡，叫只設(shè)一個相當(dāng)臨床用量20倍以上的劑量組和一個對照組。每組家兔6只或小型豬4只，如用豚鼠需10只。第39頁,共52頁，2024年2月25日，星期天2給藥方法受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚上；固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑(如羊毛脂、凡士林、橄欖油等)混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好，藥物涂抹后應(yīng)以適當(dāng)?shù)牧Ψü潭?，如用無刺激性紗布、膠布或有孔尼龍繃帶固定；豚鼠或大鼠可用剪去指套的乳膠手套包住整個背部和腹部；如受試物是液體，應(yīng)先覆以聚乙烯薄膜，防液體揮發(fā)。同時要注意防試驗動物舔食受試物。黏膜用藥，如直腸或陰道或滴鼻或吸入用藥時，可將動物固定后進行；口腔用藥，可將藥物涂抹在下唇與齒齦之間(不能排除動物舔食受試物)；或提高受試物的黏稠度；或增加用藥次數(shù)。目的足要保證受試物與黏膜接觸4h以上。受試物劑量應(yīng)以同面積不同濃度為宜。如采用其他方法，應(yīng)說明理由。毒性很小的中藥外用制劑，也可用全身給藥途徑(如皮下注射等)反應(yīng)具毒性。第40頁,共52頁，2024年2月25日，星期天3．給藥周期皮膚黏膜用藥長期毒性試驗時，給藥時間不少于臨床用藥療程的兩倍，具體用藥周期可參照全身用藥的長期毒性試驗。每周給七次，每日1次，每次6h黏膜用藥至少4h)。

三、觀察記錄與檢查皮膚黏膜用藥的長期毒性試驗，觀察項包括血液學(xué)，血液生化和病理學(xué)檢查均同全身給藥的長期毒性試驗，只是受試物涂抹的局部皮膚應(yīng)列為檢查劉象。第41頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)皮膚刺激試驗試驗?zāi)康淖阌^察動物皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的刺激反應(yīng)情況。分為1次給藥的皮膚刺激實驗和多次給藥的皮膚刺激試驗。一、動物選成年健康的白色家兔(2kg左右)，其次是白色豚鼠(0．3kg左右)。嬰兒用藥應(yīng)用更年輕的動物，如白色家免1．5kg左右，白色豚鼠0．2kg左右。二、受試物應(yīng)盡量與臨床用制劑—致。粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑時，也應(yīng)參考臨床使用方法，合理配制。第42頁,共52頁，2024年2月25日，星期天三、試驗方法至少用3只家兔或5只豚鼠。給藥前24h，動物背部去毛。分完整皮膚給藥區(qū)、破損皮膚給藥區(qū)、完整皮膚對照區(qū)、破損皮膚對照區(qū)4個區(qū)，每區(qū)均為體表面積的3％—5％，各區(qū)之間留有適當(dāng)距離。破損皮膚制造方法、給藥和固定方法等同皮膚毒性試驗。給藥區(qū)涂抹受試物(固體)或1ml(液體)，對照區(qū)涂以等量賦形劑，二層紗布覆蓋，適當(dāng)方法固定。一次給藥的皮膚刺激實驗，24h后以溫水或無刺激性溶劑洗去殘留受試物和賦形劑，觀察1h，24h、48h、72h涂抹部位的紅斑和水腫等反應(yīng)。原發(fā)反應(yīng)在1—2日內(nèi)達(dá)到最劇，消退較快，多次給藥的皮膚刺激實驗，每日涂抹1次，連續(xù)1星期或以上。其他同1次給藥的皮膚刺激實驗。第43頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

第四節(jié)皮膚過敏性試驗皮膚過敏性試驗的目的足觀察在重復(fù)接觸受試物后，受試物作為致敏原引起的變態(tài)反應(yīng)在皮膚上的表現(xiàn)。皮膚過敏性試驗可以分成兩大類，一類是使用佐劑(或稱免疫增強)的方法，一類是不用佐劑的方法。一、動物原則上選擇敏感性高的動物。一般用白色豚鼠，250—300g(或1—3個月齡)，雌雄齊半。每組10只，或由是否會影響結(jié)果評價決定。二、陽性對照對—苯二胺，1—氯—2，4—二硝基苯、二鉻化鉀、璜胺新霉素、磺化鎳等。第44頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

三、受試物受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚；如是固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑(如羊毛脂、凡士林、橄欖等)混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好。確定劑量應(yīng)考慮受試物的溶解性等性質(zhì)，局部、全身的耐受性等。必要時應(yīng)能陳述所用劑量的理由。四、試驗方法給受試物(致敏或激發(fā))前24h，動物頸背部兩側(cè)脫毛，—側(cè)用于致敏涂敷，另—側(cè)用激發(fā)涂敷。脈鼠去毛范圍約3cm~3cm(或2cmx4cm)。試驗組動物背部側(cè)脫毛處涂敷受式物，陰性對照組動物背部．脫毛處涂敷賦形劑，陽性對照組動物背部一側(cè)脫毛處涂敷1％DNCB(或其他陽性對照藥)，均持續(xù)6h動物分籠飼養(yǎng)。14日后，在動物背部另一側(cè)，試驗組涂敷受試物，陰性對照組涂敷賦形劑，陽性對照組涂敷o．1％DNCB(或其他陽性對照藥)。6h后，去掉涂敷物，即刻觀察皮膚過敏反應(yīng)情況，之后于24h、48h、72h再次觀察。以上是代表性步驟。測試皮膚過敏反應(yīng)的還有其他方法，據(jù)報道認(rèn)為福氏完全佐劑法的敏感忭略高。簡述如下：第45頁,共52頁，2024年2月25日，星期天(一)不用佐劑的方法

l，Buehler試驗法包敷封閉式涂敷受試物致敏，2星期后包敷封閉式涂敷受試物激發(fā)。

2，Dmize試驗法皮內(nèi)注射受試物致敏，2星期后皮內(nèi)注射受試物激發(fā)。

3．敞開式敷皮試驗法(openeplcutmeotest)按臨床擬用方法，反復(fù)涂敷受試物致敏。2星期后涂敷受試物激發(fā)。

(二)使用佐劑的方法

1佐刑貼敷試驗法①頸背部脫毛區(qū)四角各皮內(nèi)注射蒸餾水和福氏完全佐劑(1；1)乳化劑(油包水，W／O)0．1ml。②在注射部位用注射針呈井字擦傷皮膚，③24h，將受試物(0．1mI或0.lg)涂敷破損皮膚上。①步驟②—③每日重復(fù)1次，連續(xù)3次。⑤致敏第一日起計算，1星期后，皮內(nèi)注削部位涂