曾從江論文基因組文庫構(gòu)建及其在保護(hù)遺傳學(xué)上的應(yīng)用前景

基因組文庫構(gòu)建及其在保護(hù)遺傳學(xué)中的應(yīng)用前景學(xué)生姓名曾從江院系名稱生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)名稱生物科學(xué)班級(jí)2007級(jí)3班學(xué)號(hào)2007090346指導(dǎo)教師王瓊完成時(shí)間2011年5月20日二○一一年五月基因組文庫構(gòu)建及其在保護(hù)遺傳學(xué)中的應(yīng)用前景學(xué)生：曾從江指導(dǎo)教師：王瓊摘要：基因組文庫是進(jìn)行分子克隆和基因組結(jié)構(gòu)與功能研究的根底。本文綜述了隨著不同克隆載體的相繼出現(xiàn),基因組文庫也經(jīng)歷了一系列的開展過程。其中細(xì)菌人工染色體(BAC)具有克隆容量大,遺傳特性穩(wěn)定,轉(zhuǎn)化效率高,嵌合體少和易于操作等優(yōu)點(diǎn),在基因組文庫構(gòu)建和基因的快速克隆等方面已得到廣泛應(yīng)用。作為保護(hù)遺傳學(xué)中物種保護(hù)策略的重要局部,建立瀕危野生動(dòng)植物的基因組文庫,是保存其種質(zhì)資源的最為有效的實(shí)際手段和方法,并能為進(jìn)一步開展與生殖、疾病和重要經(jīng)濟(jì)性狀等方面有關(guān)的功能基因的研究,提供可靠的材料保證。關(guān)鍵詞：基因組文庫構(gòu)建保護(hù)遺傳學(xué)頻危野生動(dòng)植物保存GenomicLibraryConstructionandPerspectivesonApplicationsinConservationGeneticsStudent:ZengCongjiangTutor:WangQiongAbstract:Theconstructionofagenomiclibraryisessentialtoresearchongenomestructureandfunction.Thispaperpresentstheemergenceofvariousvectorsystemsinrecentyears,genomiclibraryhasalsoexperiencedaseriesofdevelopmentprocess.Amongthesevectorsystems,thebacterialartificialchromosome(BAC)ispresentlythemostwidelyusedduetoitsalargecapacitycloning,geneticcharacteristicsofstability,highertransformationefficiency,lowerchimerismlevel,easyoperation,etc.Theconstructionofagenomiclibraryofendangeredwildlife,whichhasbeenplayingamoreandmoreimportantroleinspeciesconservationstrategy,isthemosteffectivemeanstosavethegenomeresourceandtoprovidematerialsupportforadvancedresearchinconservationgenetics.Keywords:Genomiclibrary;Conservationgenetics;Endangered;Wildlife;Save目錄1.前言12.基因文庫12.1基因文庫的概念12.2基因文庫的類型2基因組文庫22.2.2cDNA文庫3基因組文庫與cDNA文庫的區(qū)別3其它文庫42.3基因文庫的大小42.4基因組文庫的研究進(jìn)展5克隆載體的開展5噬菌體文庫6柯斯質(zhì)?！睠osmid〕文庫6酵母人工染色體〔YAC〕文庫7細(xì)菌人工染色體〔BAC〕文庫72.5基因組文庫的構(gòu)建82.5.1BAC載體的制備8高分子量核DNA的制備9高分子量核DNA的局部消化9大片段核DNA與載體連接9重組載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞9挑選陽性克隆93.基因組文庫與保護(hù)遺傳學(xué)103.1保護(hù)遺傳學(xué)的產(chǎn)生103.2保護(hù)遺傳學(xué)的開展113.3保護(hù)遺傳學(xué)的內(nèi)容123.4保護(hù)遺傳學(xué)研究的意義134.基因組文庫在保護(hù)遺傳學(xué)方面的應(yīng)用前景134.1種質(zhì)保存與保護(hù)遺傳學(xué)134.2種質(zhì)保存方法與技術(shù)的問題探討144.3基因組文庫在種質(zhì)保存上的展望15參考文獻(xiàn)16致謝19基因組文庫構(gòu)建及其在保護(hù)遺傳學(xué)中的應(yīng)用前景1.前言近些年來,隨著工業(yè)的開展，導(dǎo)致大量面積的空氣污染，土地污染，水資源污染，以及森林和土地的濫伐濫墾使得土地荒漠化，沙漠化，從而導(dǎo)致動(dòng)植物的生活環(huán)境嚴(yán)重減少和惡化，也因此使地球上億萬年進(jìn)化而來的物種正以空前的速度大量減少。物種是地球上生物存在的根本形式。物種既是遺傳多樣性的載體，又是生態(tài)系統(tǒng)中最重要的組成局部，并且是生命世界與非生命世界聯(lián)結(jié)的紐帶。物種的滅絕是環(huán)境破壞最嚴(yán)重的后果之一。我們知道，群落可能發(fā)生退化和縮小，但只要所有的原始物種能夠幸存，群落仍具有潛在的恢復(fù)能力；一個(gè)物種的遺傳變異會(huì)隨著環(huán)境和個(gè)體數(shù)量減少而變小，但通過突變、自然選擇和重新組合，物種同樣具有遺傳變異的潛能。然而，一個(gè)物種一旦消失了，這個(gè)物種的種群將不可能恢復(fù)，該物種的DNA所蘊(yùn)藏的特有的遺傳信息和其所擁有的特征組合將永遠(yuǎn)不復(fù)存在，所具有的對(duì)人類的潛在價(jià)值將永遠(yuǎn)不會(huì)被認(rèn)識(shí)。探索有效物種的保護(hù)途徑，到達(dá)人類社會(huì)可持續(xù)開展已經(jīng)成為全世界的共識(shí)。從可持續(xù)開展戰(zhàn)略為出發(fā)點(diǎn)，人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到對(duì)頻危物種保護(hù)的重要性，并制定了相應(yīng)的保護(hù)對(duì)策，必須同遺傳因子和環(huán)境因子結(jié)合起來考慮，作為物種保護(hù)策略的重要局部,建立瀕危野生動(dòng)植物的基因組文庫,是保存其種質(zhì)資源的最為有效的實(shí)際手段和方法?；蚬こ碳夹g(shù)的迅速開展,使人類對(duì)生物體基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)及其調(diào)控的研究深入到分子水平。而對(duì)特定基因片段的別離和獲得,那么是上述研究的根底。完整的基因組文庫的構(gòu)建,使任何DNA片段的篩選和獲得均成為可能。因此,基因組文庫是進(jìn)行分子克隆和基因組結(jié)構(gòu)與功能研究的根底。2.基因文庫2.1基因文庫的概念基因工程中，需要將某種生物的全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時(shí)能夠隨時(shí)應(yīng)用它別離所需要的目的基因。這種保存基因組遺傳信息的材料，就稱為基因文庫〔genelibaray〕。在建立了成千上萬個(gè)無性繁殖的大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物或其他生物基因組片段的“倉庫”之后，研究者在尋找任何一種含有無性繁殖的目的基因〔目標(biāo)DAN〕的細(xì)胞時(shí)，就可以從這些文庫中篩選，而不必在重復(fù)地進(jìn)行整個(gè)無性繁殖的操作。有了文庫的概念，所謂目的基因的制取過程可以理解為是從DNA文庫中“釣出”目的基因的過程。建立基因文庫的目的是為了目的基因的保存、擴(kuò)增和純化，更重要的是基因文庫是別離克隆目的基因的主要途徑，也是復(fù)雜基因組作圖的重要依據(jù)?；蛭膸炜捎糜谘芯炕虻慕Y(jié)構(gòu)、功能和篩選基因工程的目的基因。此外，基因文庫還廣泛應(yīng)用于基因定位、基因調(diào)控等方面的研究。對(duì)于復(fù)雜的染色體，DNA分子來說單個(gè)基因所占比例十分微小，要想從龐大的基因組中將其別離出來，一般需要先進(jìn)行擴(kuò)增，所以需要構(gòu)建基因文庫[1]。在很多情況下目的基因的別離都離不開文庫。實(shí)際上利用低等生物如細(xì)菌、病毒、噬菌體等生長快，繁殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，而作為一種核酸擴(kuò)增篩選的載體，把目的基因或其片段用工具酶插入，重組于其中，經(jīng)篩選，克隆得到目的基因與載體重組的重組基因，成為便于保存，取用方便的基因庫?；蛭膸炫c基因庫是兩個(gè)完全不同的概念?；蛭膸焓怯弥亟MDNA技術(shù)建立起來的；而基因庫是指某一生物群體所擁有的全部基因。顯然基因庫是客觀存在的。2.2基因文庫的類型基因組文庫根據(jù)基因類型，基因文庫可分為基因組文庫和cDNA文庫?；蚪M文庫(Gneomiclibrary)指用分子克隆手段，將提取的某種生物基因組DNA經(jīng)隨機(jī)酶切或機(jī)械剪切為一定長度的片段，再與適當(dāng)?shù)妮d體DNA連接后轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞中而形成的各種片段的重組子克隆的總和[2]。這個(gè)文庫像是一個(gè)貯存有基因組全部序列的信息庫,故稱為基因組文庫,又稱之人工構(gòu)建的基因“活期儲(chǔ)蓄所”?；蚪M文庫根據(jù)DNA來源又有核基因組文庫、葉綠體基因組文庫以及線粒體基因組文庫?；蚪M文庫構(gòu)建時(shí)遺傳信息供體是基因組DNA，因此無發(fā)育時(shí)期及組織器官特異性，在一個(gè)完全的基因組文庫中包含著真核基因組DNA上的所有編碼區(qū)及非編碼區(qū)序列的克隆，生物有機(jī)體的每一個(gè)基因在文庫中都有其克隆，該克隆的基因片段里包括著間隔序列，因此，基因組文庫可以真實(shí)地顯示基因組的全部結(jié)構(gòu)信息。cDNA文庫cDNA文庫(cDNAlibrary)是指某一生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA文庫是有時(shí)效性的。文庫構(gòu)建時(shí)的信息供體是某一時(shí)空條件下的細(xì)胞總mRNA，它是在轉(zhuǎn)錄水平上反映該生物在某一特定發(fā)育時(shí)期，某一特定組織或器官在某種環(huán)境條件下的基因表達(dá)情況，并不能包括該生物有機(jī)體的全部基因。再者，cDNA文庫只反映mRNA的分子結(jié)構(gòu)。cDNA中不含有真核基因的間隔序列及調(diào)控區(qū)，確切的說cDNA并不是真正上的基因。基因組文庫與cDNA文庫的區(qū)別基因組文庫與cDNA文庫的最主要區(qū)別是，基因組文庫含有而cDNA文庫不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列〔重復(fù)序列等〕。與基因組文庫一樣，cDNA文庫也是指一群含重組DNA的細(xì)菌或噬菌體克隆，每個(gè)克隆只含一種mRNA的信息，足夠數(shù)目克隆的總和包含了細(xì)胞的全部mRNA信息。cDNA文庫便于克隆和大量擴(kuò)增，可以從中篩選到所需目的基因，并用于表達(dá)。目前這兩類基因文庫在基因工程中都得到有效應(yīng)用。選擇哪一種，主要是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。在別離RNA病毒基因，研究功能蛋白序列，別離特定發(fā)育階段或特定組織特異表達(dá)的基因時(shí)構(gòu)建cDNA文庫。在研究mRNA分子中不存在的序列及基因組作圖時(shí)必須構(gòu)建基因組文庫。構(gòu)建基因文庫的目的在于保存并克隆基因，目前克隆基因主要就是cDNA克隆和基因組克隆兩種方法[3]，基因組克隆這種方法能克隆到基因的非編碼區(qū)調(diào)控序列和內(nèi)含子序列，便于研究基因調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)和功能，這是cDNA克隆無法滿足的[4]。許多研究資料說明，在真核細(xì)胞中表達(dá)外源真核基因時(shí)，一些含有內(nèi)含子序列的基因要比經(jīng)cDNA克隆的不含內(nèi)含子序列的基因表達(dá)效率高[5-7]，而且由其轉(zhuǎn)錄來的含有內(nèi)含子序列的mRNA不易降解[8]，因此，某些情況下需要克隆含有內(nèi)含子序列的基因就只有選擇基因組克隆。另外，對(duì)于某些低豐度mRNA基因通過cDNA克隆是很困難的，選擇基因組克隆更為適宜。其它文庫此外，從基因文庫的功能上可分為克隆文庫和表達(dá)文庫。從構(gòu)建基因文庫的不同載體上主要可分為質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒和人工染色體四大類文庫。不同的載體適于構(gòu)建不同的基因文庫。2.3基因文庫的大小一個(gè)基因文庫應(yīng)該包含的克隆數(shù)目與該生物基因組的大小和被克隆DNA的長度有關(guān)?；蚪M越大，所需克隆數(shù)就越多。克隆時(shí)每一個(gè)載體中允許插入外源DNA片段的長度越長，那么需要克隆數(shù)就越少。如果一個(gè)基因庫中的總的克隆數(shù)較少，那么從中篩選目的基因比擬容易，但是由于插入片段較長，以后的分析就比擬困難。為了到達(dá)以一種合理的概率能夠從文庫中篩選到某一目的基因，該文庫的群體應(yīng)該足夠大，必須含有最低重組克隆數(shù)的3～10倍。1975年L.Clark和J.Carbon[9]提出一個(gè)可以計(jì)算某一基因文庫中應(yīng)該包含的克隆數(shù)目的公式：N=㏑〔1-P〕∕㏑〔1-X∕Y〕N:所需重組體個(gè)數(shù)〔基因文庫大小〕P：希望獲得的概率〔選出某一基因的概率，一般為99%〕X:文庫中每個(gè)克隆所含的外源DNA片段的平均長度Y:該生物基因組的大小〔單倍體基因組長度〕原核生物的基因組較小,需要的克隆數(shù)也較少；真核生物的基因組較大,克隆數(shù)需相應(yīng)增加,才能包含所有的基因。此外,每一載體DNA中所允許插入的外源DNA片段的長度較大,那么所需總克隆數(shù)越少；反之那么所需數(shù)越多。如果一個(gè)基因文庫的總克隆數(shù)較少,那么從中篩選基因雖然比擬容易,但會(huì)給以后的分析造成困難,因?yàn)槠蔚拈L度增加了。所以在建立基因文庫前應(yīng)根據(jù)研究目的來確定DNA片段的長度和克隆數(shù)目,并以此確定構(gòu)建基因文庫的載體種類。2.4基因組文庫的研究進(jìn)展2.4.1克隆載體的開展克隆載體是能攜帶外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行擴(kuò)增的DNA，一個(gè)理想的克隆載體有助于目的基因的重組、選擇和鑒定。因此，它必須具備以下幾個(gè)條件:①具有自我復(fù)制能力；②含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)；③具有選擇性標(biāo)記以區(qū)分轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞(如:抗藥性、營養(yǎng)缺陷型以及形成噬菌斑的能力等)；④分子量較小，便于DNA體外操作[2]。作為遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容,基因組文庫的概念早在20世紀(jì)70年代就已被Clarke和Carbon提出[9],Maniatis等[10]在1978年設(shè)計(jì)了哺乳動(dòng)物基因組的大量隨機(jī)片段方案?？寺≥d體作為基因組文庫構(gòu)建中的重要媒介,提高其容納量一直是重要開展方向之一。自Cohen等1973年構(gòu)建第一個(gè)質(zhì)粒載體pSC101作克隆載體以來[11],隨著分子生物學(xué)技術(shù)的開展,越來越多的克隆載體相繼出現(xiàn),這些載體的開展推動(dòng)了結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究。同時(shí)隨著人類基因組方案和植物基因組方案的實(shí)施,克隆載體的整體結(jié)構(gòu)、克隆能力和轉(zhuǎn)化效率等都有了長足的開展?？梢园芽寺≥d體的開展劃分為三個(gè)階段[11-13]:第一階段以質(zhì)粒(Plasmid)、λ噬菌體(λ-bacteriophage)、柯斯質(zhì)粒(Cosmid,又稱粘粒)為主,主要特點(diǎn)是載體在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定遺傳、易別離、轉(zhuǎn)化效率高,但是克隆容量有限,一般小于45kb。第二階段的克隆載體那么突破了上述載體容量,顯著特點(diǎn)是載體的容載能力擴(kuò)大,約100～350kb,主要有酵母人工染色體(Yeastartificialchromosome,YAC)、細(xì)菌人工染色體(Bacterialartificialchromosome,BAC)、源于噬菌體P1的人工染色體(Pl-derivedartificialchromosome,PAC)以及目前正在開發(fā)中的哺乳動(dòng)物人工染色體〔Mammalianartificialchromosome，MAC〕和人類人工染色體〔Humanartificialchromosome，HAC〕載體系統(tǒng)。第三個(gè)開展階段是以近幾年開展起來的雙元細(xì)菌人工染色體(BinaryBAC,BIBAC)和可轉(zhuǎn)化人工染色體(Transformation-competentartificialchromosome,TAC),這些載體不僅具有較大的克隆容量,而且具備了直接轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的功能。幾種克隆載體性質(zhì)的比擬〔見表1〕。表1幾種克隆載體性質(zhì)的比擬Table1Comparisonofsomecloningvectors開展階段載體宿主載體容量遺傳穩(wěn)定性嵌合性可否轉(zhuǎn)化植物一質(zhì)粒噬菌體柯斯質(zhì)粒大腸桿菌大腸桿菌大腸桿菌15～20kb17～20kb30～45kb穩(wěn)定穩(wěn)定穩(wěn)定低低低否否否二YACBACPAC酵母菌大腸桿菌大腸桿菌350～1000kb100～300kb100～300kb不穩(wěn)定穩(wěn)定穩(wěn)定高低低否否否三BIBACTAC大腸桿菌∕農(nóng)桿菌大腸桿菌∕農(nóng)桿菌100～300kb100kb穩(wěn)定穩(wěn)定低低可可噬菌體文庫噬菌體具有一個(gè)48kb的龐大而復(fù)雜的基因組，含有許多常用限制酶的多個(gè)酶切位點(diǎn)，是最早使用的建庫克隆載體[14,15]。噬菌體及其與大腸桿菌宿主相互作用的遺傳學(xué)研究為構(gòu)建噬菌體載體和相應(yīng)的宿主菌株提供了理論根底。噬菌體載體可歸納成兩種不同的類型：只有一個(gè)限制酶切位點(diǎn)可供插入外源DNA片段的載體稱作插入型載體；具有成對(duì)的限制酶切位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的區(qū)段可被外源DNA片段所取代的載體稱作替換型載體。噬菌體的克隆容量可到達(dá)23kb，具有高效的體外包裝和轉(zhuǎn)染效率，考慮到重組噬菌體總和要代表某種生物的整個(gè)基因組，這些特性是非常重要的[14]。對(duì)于哺乳動(dòng)物基因組文庫，篩選到某一特定序列的幾率為99％需要大約8×105個(gè)重組子[9]?？滤官|(zhì)粒〔Cosmid〕文庫柯斯質(zhì)?！睠osmid〕文庫是為克隆和增殖基因組DNA大片段而設(shè)計(jì)的。人們期望大容量的載體的出現(xiàn)能顯著的減少構(gòu)建、繁殖、篩選具有大基因組的生物基因組文庫所需的工作量。1979年Royal等[16]首先確定了在Cosmid載體中克隆大片段的可能性。此后,Cosmid克隆曾用于構(gòu)建果蠅、小鼠和人的基因組文庫,并從數(shù)種生物中別離得到基因[17-19]。酵母人工染色體〔YAC〕文庫真正的人工染色體要在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制并遺傳下去,必須具備三個(gè)元件：復(fù)制起始區(qū)〔originofreplication),參與染色體DNA復(fù)制起始結(jié)構(gòu)的形成；著絲粒(centromere),負(fù)責(zé)染色體向子細(xì)胞的傳遞；端粒(telomere),對(duì)染色體DNA兩個(gè)末端起封口和保護(hù)作用。Murray等1983年利用這三個(gè)元件構(gòu)建了第一個(gè)酵母人工染色體[20]。YAC載體的突出特點(diǎn)是容載能力大,如動(dòng)物的YAC文庫平均插入長度達(dá)900～1000kb。植物YAC文庫平均插入片段一般為100～350kb,其原因是植物細(xì)胞較大,有硬而厚的細(xì)胞壁,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)多糖和DNA水解酶類多,難以得到超大分子量的基因組DNA。由于YAC插入片段大,構(gòu)建基因組文庫時(shí),只需要較少的克隆數(shù)便可以覆蓋整個(gè)基因組,使構(gòu)建高等生物基因組遺傳圖譜和物理圖譜成為可能,基因組方案得以順利實(shí)施。雖然YAC能容載較大的片段,但是YAC克隆的穩(wěn)定性較差,操作也不方便,具有自身難以克服的缺點(diǎn)：①存在嵌合現(xiàn)象(chimerism),即一個(gè)YAC克隆中的插入子可能來自兩個(gè)或多個(gè)不同的片段,嵌合體的比例到達(dá)10%～50%,這種現(xiàn)象使染色體步行(chromosomewalking)和基因別離難度加大；②YAC克隆的穩(wěn)定性差,插入片段存在重排和喪失現(xiàn)象,這對(duì)染色體物理圖譜的構(gòu)建和基因別離都十分不利；③插入片段的別離和純化困難；④轉(zhuǎn)化效率低[9]。細(xì)菌人工染色體〔BAC〕文庫BAC載體系統(tǒng)是在大腸桿菌F因子的根底上開展而來的,F因子具有穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn),其復(fù)制是嚴(yán)謹(jǐn)型的,在每個(gè)細(xì)胞中僅有1～2個(gè)拷貝,減小了插入片段發(fā)生重組的機(jī)率,并且F因子能夠攜帶1Mb的外源片段。1992年,Shizuya等[21]利用F因子的oriS、repE、parA和parB等與復(fù)制和調(diào)節(jié)拷貝數(shù)有關(guān)的基因,以氯霉素抗性基因?yàn)檫x擇標(biāo)記,并利用電激穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B,構(gòu)建了第一個(gè)細(xì)菌人工染色體載體pBAC108L,它能夠克隆約300kb的外源片段,但是它只有轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記而無重組子選擇標(biāo)記,重組子的選擇必需通過雜交進(jìn)行驗(yàn)證。為了進(jìn)一步方便BAC克隆的篩選,將lacZ基因引入了pBAC108L的克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建了pBeloBAC11載體[22],這樣重組子可以通過藍(lán)白斑進(jìn)行篩選,pBeloBAC11載體是第二代BAC載體的代表。目前常用的載體有pECBAC1、pBeloBAC11等[23]。BAC載體的容載能力一般為100～350kb,雖然容量沒有YAC載體大,但是BAC具有更多優(yōu)點(diǎn)：①以大腸桿菌為寄主,轉(zhuǎn)化率高,構(gòu)建BAC文庫比YAC文庫更容易；②BAC載體以環(huán)型超螺旋狀態(tài)存在,從大腸桿菌中提取質(zhì)粒較方便,而從酵母中別離DNA較困難；③BAC的復(fù)制子來源于F因子,可穩(wěn)定遺傳,嵌合及重組現(xiàn)象少;④可以通過菌落原位雜交來篩選目的基因,方便快捷；⑤BAC載體在克隆位點(diǎn)的兩側(cè)具有T7和Sp6聚合酶啟動(dòng)子,可以用于轉(zhuǎn)錄獲得RNA探針或直接用于插入片段的末端測(cè)序[22]。2.5基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫是進(jìn)行分子克隆和基因組結(jié)構(gòu)與功能研究的根底?；蚪M文庫的構(gòu)建實(shí)際就是基因組DNA片段的克隆過程?；蚪M文庫的構(gòu)建過程如下：①載體的選擇和制備；②生物基因組DNA的提取和片段化〔制備成適合克隆長度和相應(yīng)末端的DNA片段〕；③DNA片段和載體的連接；④重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞〔大腸埃細(xì)菌或酵母菌等〕；⑤初庫的擴(kuò)增。近年來得到廣泛應(yīng)用的載體主要是人工染色體載體系列：YAC、BAC和PAC(P1-derivedartificialchromosome)。比擬而言,BAC具有嵌合和重排頻率相對(duì)低、外源DNA能穩(wěn)定遺傳、轉(zhuǎn)化效率高、重組DNA容易別離等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了YAC的缺乏。此外,BAC在轉(zhuǎn)化前無需對(duì)重組子進(jìn)行包裝的優(yōu)點(diǎn)是PAC所不及的,所以,近年來該類載體得到了迅速的開展并在構(gòu)建基因組文庫方面得到了廣泛的應(yīng)用。下面以BAC載體構(gòu)建基因組文庫的過程來說明。BAC載體的制備BAC載體的好壞直接關(guān)系到文庫中空白載體的比例和文庫的質(zhì)量。載體DNA的提取采取堿裂解法，用氯化銫—溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)載體DNA[24]。用限制性內(nèi)切酶對(duì)載體DNA進(jìn)行酶切消化，為減少空白載體的比例還應(yīng)用脫磷酶對(duì)載體進(jìn)行充分的脫磷處理[25]，再用連接酶對(duì)脫磷后的載體DNA進(jìn)行自連，最后回收完全脫磷的線性化載體。對(duì)載體濃度、脫磷效果和連接能力進(jìn)行檢測(cè)。高分子量核DNA的制備核DNA的制備,一般是在液氮中將組織研磨成粉末,而且在整個(gè)研磨過程中均使組織浸在液氮中。為了防止核DNA降解,一般采用兩種低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋核DNA的方法,一是將核DNA包埋在低熔點(diǎn)瓊脂糖中形成栓塞(plugs),二是將核DNA包埋在低熔點(diǎn)瓊脂糖和礦物油混合物中形成微粒(microbead)。通過比擬試驗(yàn),plugs在制備方法、保護(hù)核DNA、操作上具有明顯優(yōu)點(diǎn)。高分子量核DNA的局部消化其目的使通過限制性內(nèi)切酶的不完全消化,產(chǎn)生大小比擬適合和集中的片段,一般通過脈沖場(chǎng)凝膠電泳進(jìn)行兩次片段選擇[26,27]。大片段核DNA與載體連接大片段核DNA是否能有效連接到載體上主要取決于插入DNA片段與載體的比例,對(duì)于不同生物采用的比例不同,大多數(shù)BAC文庫采用1∶5～15(摩爾比)[26,27]。重組載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞對(duì)于轉(zhuǎn)化大腸桿菌而言,電轉(zhuǎn)化是目前普遍使用的一種方法。電轉(zhuǎn)化效率與插人片段的大小有關(guān)，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低；反之，越高。此外，轉(zhuǎn)化條件也直接影響轉(zhuǎn)化效率、插入片段大小及假陽性克隆的含量。因此，在大規(guī)模轉(zhuǎn)化前需進(jìn)行轉(zhuǎn)化預(yù)試驗(yàn)，以選擇最正確的轉(zhuǎn)化條件。挑選陽性克隆陽性克隆的挑選有人工和機(jī)器人操作兩種。文庫構(gòu)建完成后,還需要對(duì)文庫進(jìn)行評(píng)價(jià),其質(zhì)量的上下標(biāo)準(zhǔn)包括:文庫中克隆的數(shù)量、平均插入片段的大小、細(xì)胞器DNA的含量以及假陽性克隆的含量等。BAC文庫構(gòu)建的流程〔如圖1〕。圖1BAC文庫構(gòu)建流程圖Fig.1BAClibraryestablishmentflowchart3.基因組文庫與保護(hù)遺傳學(xué)瀕危動(dòng)植物基因組文庫構(gòu)建的目的在于有效、永久保存和利用其基因資源、快速克隆重要經(jīng)濟(jì)和抗逆性狀基因以及為廣泛、深入開展分子生物學(xué)研究提供珍貴的材料。作為保護(hù)遺傳學(xué)中物種保護(hù)策略的重要局部,建立瀕危野生動(dòng)植物的基因組文庫,在保存其種質(zhì)資源是最為有效的實(shí)際手段和方法,并能為進(jìn)一步開展與生殖、疾病和重要經(jīng)濟(jì)性狀等方面有關(guān)的功能基因的研究,提供可靠的材料保證。3.1保護(hù)遺傳學(xué)的產(chǎn)生生命在地球上出現(xiàn)至今,已經(jīng)有三十多億年的歷史。經(jīng)過屢次大絕滅和適應(yīng)輻射,各種生命形式共同締造了自然界的一片繁榮景象。然而,近幾百年來,由于世界人口的高速增長,人類經(jīng)濟(jì)活動(dòng)的不斷加劇,特別是現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的飛速開展,盲目利用自然資源,大面積砍伐森林和延伸農(nóng)業(yè)耕地等社會(huì)行為,己嚴(yán)重地毀壞了自然資源和生態(tài)系統(tǒng)的平衡,并由此引發(fā)的一系列惡果,如土地荒漠化和沙化、全球氣候反常、環(huán)境污染、水土流失和生物多樣性嚴(yán)重喪失等,不僅使人類社會(huì)陷于糧食短缺、資源匱乏和可持續(xù)開展受阻,也使許多野生動(dòng)植物因受到不同程度的脅迫而僅殘存于片段化的生境中。由于種群隔離、基因交流中斷以及嚴(yán)重的近親繁殖,這使得地球上的生物多樣性正在急劇下降。尤其是在生物多樣性十分豐富的熱帶、亞熱帶開展中國家,由于人口膨脹和經(jīng)濟(jì)開展所帶來的壓力,生態(tài)系統(tǒng)正受到嚴(yán)重的破壞,許多物種已經(jīng)滅絕，大量物種處于瀕危狀態(tài)；許多物種的種群規(guī)模正在銳減,種內(nèi)遺傳多樣性急劇喪失。與此同時(shí),人類對(duì)生物資源的依賴和需求卻在日益增大。在這些嚴(yán)酷的事實(shí)面前,人們終于認(rèn)識(shí)到,自然界中物種的多樣性和進(jìn)化潛力是其自身生存和開展的根底,保護(hù)物種及其所蘊(yùn)藏的遺傳多樣性就是保護(hù)生物多樣性,就是保護(hù)人類賴以生存的資源,就是保護(hù)人類自己。以上種種原因及相關(guān)背景下促使了一門新興學(xué)科—保護(hù)生物(ConservationBiology)的產(chǎn)生和開展[28-30]。保護(hù)生物學(xué)有兩個(gè)目的:一是研究人類對(duì)生物多樣性的影響；二是研究防止物種滅絕的有效途徑[28-30]。目前保護(hù)管理方案可在許多水平上制定和實(shí)施,上至生態(tài)系統(tǒng),下至個(gè)體水平,而分子遺傳學(xué)技術(shù)在各個(gè)水平上均能起到極其重要的作用。目前世界上許多物種都面臨著滅絕的危險(xiǎn),據(jù)最新估計(jì)現(xiàn)有物種的滅絕速率是化石記錄上的4～5倍[30,31]。這個(gè)問題的嚴(yán)重性意味著制定切實(shí)可行的保護(hù)方案將顯得特別重要。由于遺傳變異與環(huán)境因子是相互作用的,它們不能看作是兩個(gè)獨(dú)立的影響因子[32]。因此,從長遠(yuǎn)來看,瀕危物種保護(hù)對(duì)策的制定必須同遺傳因子和環(huán)境因子結(jié)合起來考慮。研究物種遺傳變異不僅能夠深入了解該物種現(xiàn)在和過去的進(jìn)化歷史,而且還能搞清其遺傳多樣性現(xiàn)狀[29]。只有在弄清物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性現(xiàn)狀的前提下,才能夠制定出切實(shí)可行的保護(hù)策略,否那么,任何物種保護(hù)措施的實(shí)施,都不會(huì)取得實(shí)質(zhì)性的成效。因此,隨著保護(hù)生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的不斷開展和相互滲透,也就孕育產(chǎn)生了保護(hù)遺傳學(xué)(ConservationGenetics)[30-33]這個(gè)分支學(xué)科。3.2保護(hù)遺傳學(xué)的開展盡管保護(hù)遺傳學(xué)這一名詞的提出和廣泛應(yīng)用的時(shí)間并不很長,但遺傳學(xué)在資源和物種保護(hù)中的應(yīng)用那么可以回溯到20世紀(jì)30年代。1937年,Errington和Hamerstromsh在野生動(dòng)物管理方面首次提出了“ConservationBiology”這一名詞,而20世紀(jì)二三十年代,俄羅斯科學(xué)家Vavilov等通過對(duì)農(nóng)作物的研究已開始強(qiáng)調(diào)遺傳多樣性的重要性。此后的幾十年間,染色體、等位酶、DNA等多種遺傳分析手段逐步得到廣泛應(yīng)用,為保護(hù)遺傳學(xué)研究積累了大量資料,所涉及的物種也從農(nóng)作物擴(kuò)展到野生動(dòng)植物和人類。尤其是70年代以后,分子生物學(xué)和群體遺傳學(xué)的迅猛開展,為保護(hù)遺傳學(xué)研究的開展奠定了堅(jiān)實(shí)的理論和技術(shù)根底。1978年第一屆國際保護(hù)生物學(xué)大會(huì)的召開,標(biāo)志著該學(xué)科確實(shí)立,而在眾多保護(hù)生物學(xué)研究者中,有相當(dāng)一局部是從事遺傳學(xué)和群體遺傳學(xué)研究工作的。此后保護(hù)遺傳學(xué)方面的研究日益增多,保護(hù)遺傳學(xué)逐步形成和完善了自己的理論體系和研究方法,開始以一門嶄新學(xué)科的姿態(tài)出現(xiàn)。在此其間,由Frankel和Soule編著的《Conservation&Evolution》(1981)和由Schonewald-Cox等編輯的《GeneticsandConser-vation》(1983)對(duì)該領(lǐng)域的開展起到了積極的作用。1991年由Falk和Holsinger編輯的《GeneticsandConservationofRarePlants》是對(duì)植物該領(lǐng)域研究的一個(gè)較為全面的回憶和總結(jié)。如今,保護(hù)遺傳學(xué)已經(jīng)逐漸開展成為一門成熟的學(xué)科,全世界許多學(xué)者在從事這方面的研究,有關(guān)的文獻(xiàn)資料逐年增加。2000年,在國際著名的學(xué)術(shù)出版社KluwerAcademicPublishers的組織和推動(dòng)下,一份名為《ConservationGenetics》的國際性專業(yè)期刊在荷蘭創(chuàng)刊,標(biāo)志著這門學(xué)科已逐步成熟并受到國際社會(huì)的廣泛關(guān)注。3.3保護(hù)遺傳學(xué)的內(nèi)容保護(hù)遺傳學(xué)就是運(yùn)用遺傳學(xué)的原理和研究手段,以生物多樣性尤其是遺傳多樣性的研究和保護(hù)為核心的一門新興學(xué)科。實(shí)際上,它可以說是一個(gè)多學(xué)科的綜合,融合了群體遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、數(shù)學(xué)和系統(tǒng)與進(jìn)化等許多領(lǐng)域的研究內(nèi)容,兼有根底科學(xué)和應(yīng)用科學(xué)的性質(zhì)，即具有很強(qiáng)的理論根底,又具有豐富的實(shí)踐內(nèi)涵,可以說沒有保護(hù)遺傳學(xué)參與的生物保護(hù)將是粗糙和不盡合理的。保護(hù)遺傳學(xué)是在對(duì)瀕危物種制定正確的保護(hù)策略中應(yīng)運(yùn)而生的,它首先要解決的問題是確立保護(hù)單元、查明物種當(dāng)前的遺傳學(xué)狀況(即遺傳多樣性水平、種群的分化程度等),并據(jù)此決定對(duì)其實(shí)施何種保護(hù)策略。由于保護(hù)遺傳學(xué)是一門綜合性很強(qiáng)的學(xué)科,其研究內(nèi)容涉及物種保護(hù)的各個(gè)方面。盡管不同學(xué)者有不同的觀點(diǎn),但正如Avise&Hamrick(1996)在《ConservationGenetics》一書中所指出的,其核心內(nèi)容不外乎5個(gè)方面的內(nèi)容,即研究種群內(nèi)遺傳變異的水平及其意義；種群內(nèi)個(gè)體間的親緣關(guān)系式樣；種群的群體遺傳結(jié)構(gòu)和種群間的進(jìn)化關(guān)系；種間界限和雜交；以及物種或更高級(jí)別類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。此外,物種的進(jìn)化歷史、適應(yīng)潛力和瀕危的機(jī)制、交配系統(tǒng)及其進(jìn)化機(jī)制、外來種入侵的遺傳后果、栽培群體經(jīng)濟(jì)形狀衰退、法學(xué)鑒定(包括與貿(mào)易有關(guān)的品種和品系鑒定)等等都屬于保護(hù)遺傳學(xué)的研究范疇。可以說，保護(hù)遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容目標(biāo)是通過對(duì)物種遺傳多樣性等相關(guān)因子的研究,提出科學(xué)的保護(hù)策略,使之在保護(hù)方案實(shí)施后,能夠使物種具備應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的能力,實(shí)現(xiàn)保護(hù)物種遺傳多樣性和進(jìn)化潛力的目標(biāo)。3.4保護(hù)遺傳學(xué)研究的意義物種和遺傳資源的擁有量是衡量一個(gè)國家經(jīng)濟(jì)和社會(huì)開展能力的重要指標(biāo)之一。許多實(shí)例說明，一個(gè)物種、一個(gè)品種乃至一個(gè)基因都可能是繁榮國家經(jīng)濟(jì)的源泉，我國雜交水稻就是成功地利用了野生水稻中的不育基因。由于基因鑒別能力有限，目前我國大多數(shù)生物遺傳資源尚未充分利用，但生物遺傳資源的開發(fā)和利用前景十分廣闊。因此，保存和保護(hù)物種及其遺傳資源關(guān)系到國家經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)開展和子孫后代的繁榮富強(qiáng)。我國雖具有豐富的野生動(dòng)植物資源和眾多的珍稀瀕危動(dòng)物,但是絕大多數(shù)物種并未得到科學(xué)的保護(hù)和管理,特別是經(jīng)濟(jì)的高速開展又直接威脅著物種的生存和開展,長期下去必將使其走向絕滅。近幾年,這方面的研究雖然在我國已有所開展,但是研究根底還相當(dāng)薄弱,特別有關(guān)保護(hù)遺傳學(xué)的研究也才剛剛起步,也未得到足夠的重視,而且其開展速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于經(jīng)濟(jì)開展水平。因此為了加強(qiáng)對(duì)我國的珍稀瀕危野生動(dòng)物的保護(hù)和管理,提供經(jīng)濟(jì)有效的科學(xué)保護(hù)對(duì)策,我國應(yīng)加強(qiáng)瀕危野生動(dòng)植物保護(hù)遺傳學(xué)的研究。4.基因組文庫在保護(hù)遺傳學(xué)方面的應(yīng)用前景4.1種質(zhì)保存與保護(hù)遺傳學(xué)種質(zhì)是決定生物種性并將其豐富的遺傳信息從親代傳給子代的遺傳物質(zhì)的總稱，是物種進(jìn)化、遺傳學(xué)研究和育種的物質(zhì)根底。種質(zhì)資源的多樣性，是維持生態(tài)平衡的重要前提，直接關(guān)系到工農(nóng)業(yè)的開展方向和人類的生存。但是，由于環(huán)境惡化及人類活動(dòng)的破壞等原因，種質(zhì)資源的流失十分嚴(yán)重，一些珍貴、稀有的物種以及一些具有良好抗性的地方栽培品種已經(jīng)滅絕或?yàn)l臨滅絕。因此，如何保存現(xiàn)有的頻危種質(zhì)不再受到破壞，保護(hù)物種種質(zhì)資源的遺傳多樣性已成為全球關(guān)注的話題。長期而有效的保存種質(zhì)是解決動(dòng)植物遺傳根底越發(fā)狹窄與物種退化的重要途徑之一；同時(shí),也是拯救珍稀和瀕危動(dòng)植物物種的有效措施。通過對(duì)物種種質(zhì)資源的相關(guān)因子的遺傳學(xué)研究,提出科學(xué)的保護(hù)策略,使之在保護(hù)方案實(shí)施后,能夠使物種具備應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的能力,實(shí)現(xiàn)保護(hù)物種遺傳多樣性和進(jìn)化潛力的目標(biāo)。隨著生物技術(shù)的日新月異,物種質(zhì)資源的保存方法也產(chǎn)生了很大的變化，如種子保存、活體保種、干細(xì)胞庫、突變體庫、生殖細(xì)胞庫、cDNA文庫、基因組文庫等的研究表達(dá)了在保護(hù)遺傳學(xué)上的應(yīng)用。4.2種質(zhì)保存方法與技術(shù)的問題探討傳統(tǒng)的保存植物種質(zhì)資源的方法是建立種子庫。雖然采用低溫保存可大大延緩正常種子的壽命,但此法卻難以保存頑拗性種子。與種子庫相比,采用植物細(xì)胞、組織或器官,能最大限度地抑制生理代謝強(qiáng)度,降低劣變發(fā)生頻率,到達(dá)長期保存種質(zhì)的目的。相對(duì)而言,由于動(dòng)物體本身功能和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,其種質(zhì)資源的保存更具有較高的難度。早期主要采用福爾馬林、乙醇等多種固定劑浸泡組織標(biāo)本的保存,和血樣的采集保存,這兩種技術(shù)比擬直接和簡單。隨著低溫生物學(xué)和生殖生物學(xué)的不斷開展,超低溫保存技術(shù)開始應(yīng)用于動(dòng)物的組織、體細(xì)胞和生殖細(xì)胞等。通過對(duì)防凍劑、解凍速度及冷凍模式等方面的研究,人們?cè)诒４嫘∈蟆⒓倚?、人和一些瀕危動(dòng)物的胚胎方面,均取得成功。然而,保存物種資源,尤其是瀕危野生動(dòng)植物的種質(zhì)資源,歸根到底,是要保存其珍貴的遺傳物質(zhì)和有限的基因資源。實(shí)驗(yàn)說明[34,35],福爾馬林和75%酒精都可以用于樣品保存,有滲透力強(qiáng)、防腐殺菌效果好、固定速度快的優(yōu)點(diǎn),即能以較快的速度使蛋白質(zhì)變性,使樣品中的DNA酶變性失活,從而使基因組DNA得到保護(hù)而免遭降解，福爾馬林雖然能夠長時(shí)間地保存標(biāo)本中的DNA，但此類固定劑為強(qiáng)致癌物質(zhì),且與空氣接觸后容易被氧化成甲酸,而甲酸對(duì)基因組DNA有較強(qiáng)的降解作用。如果對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行DNA分子生物學(xué)研究，雖然乙醇對(duì)DNA沒有或僅有較弱的降解作用，但是蛋白質(zhì)被乙醇固定時(shí)間長會(huì)造成細(xì)胞核難被破裂,核內(nèi)DNA離心過程中容易沉淀到管底[35]。使用血液中的DNA作為模板的缺乏之處，在于血液的保存時(shí)間不能太長，時(shí)間過長會(huì)造成DNA的降解。在-85℃的條件下保存，保存期限不能超過3個(gè)月；在-70℃下保存，保存期限那么不超過2個(gè)月[36,37]?；铙w保種解決了“保種的對(duì)象是群體而不是某些性狀”的問題,并且把群體劃為亞群,這有利于保種的實(shí)踐[38]。在亞群間有隔離的情況下,可以保持物種遺傳多樣性,在亞群間有遷移的情況下,可以有效地延長保種世代數(shù)而不發(fā)生退化。對(duì)于珍貴的物種資源,進(jìn)行活體保種有其積極的現(xiàn)實(shí)意義。但是,當(dāng)群體有效含量下降到一定水平后,受遺傳漂變、交配體制、近交系數(shù)等因素的制約,活體保種有很大局限性。另外,對(duì)如此眾多的瀕危動(dòng)物進(jìn)行全面保種,對(duì)于我國這樣一個(gè)開展中國家來說是不現(xiàn)實(shí)的。相對(duì)來說,低溫保存種質(zhì)細(xì)胞(冷凍保種)彌補(bǔ)了活體保種的缺陷:冷凍配子、胚胎和體細(xì)胞,便于迅速將那些即將滅絕、數(shù)量有限的物種遺傳資源冷凍保存起來；世代間隔無限延長,擺脫了地域和生態(tài)環(huán)境的限制,防止了因種群波動(dòng)引起的瓶頸效應(yīng)。然而超低溫技術(shù)帶來的負(fù)面效應(yīng)也是顯而易見的,采取怎樣的冷凍程序和防凍劑以減少對(duì)種質(zhì)細(xì)胞的損傷,仍然是超低溫學(xué)學(xué)者奮斗的方向。因此,該技術(shù)并非種質(zhì)資源保存的首選?；蚪M文庫的出現(xiàn)有效地解決了這些疑難。它通過將生物體全部基因的隨機(jī)片段重組為DNA克隆群體來完整地保存其基因信息,并通過整合于菌株的克隆傳代方式,使其全部的基因方便且穩(wěn)定地代代相傳,到達(dá)永久性地保存瀕危野生動(dòng)植物基因資源的目的。這是一種最平安、最可靠、維持費(fèi)用最低的遺傳資源保存方法。4.3基因組文庫在種質(zhì)保存上的展望眾所周知,人類在“造就”瀕危物種的同時(shí),也使其棲息地和食物鏈遭到嚴(yán)重破壞。在此情況下,一局部瀕危物種如朱鹮等在經(jīng)過一段時(shí)間的保護(hù)后,其資源得到一定程度的恢復(fù)。但是,也有相當(dāng)一局部物種如白眉長臂猴、華南虎等,由于種群數(shù)量極度稀少,其野生資源恢復(fù)的希望十分渺茫。因此,建立其基因資源庫,實(shí)施物種的離體保護(hù),已成為保護(hù)遺傳學(xué)的主要任務(wù)之一。否那么,物種滅絕,其基因資源就會(huì)永久地消失。建立瀕危野生動(dòng)植物的基因組文庫,是基因離體保護(hù)的主體內(nèi)容也是生物多樣性保護(hù)的根底工作之一。我們有理由相信,作為物種保護(hù)策略的重要局部,建立瀕危野生動(dòng)植物的基因組文庫,是保存其種質(zhì)資源的最為有效的實(shí)際手段和方法,并將在其保護(hù)遺傳學(xué)領(lǐng)域于多種遺傳標(biāo)記的篩選,以及在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域于基因組方案和與生殖、疾病和重要經(jīng)濟(jì)性狀等有關(guān)的功能基因的研究中,發(fā)揮重要作用。參考文獻(xiàn)[1]曉虹,金黎明.細(xì)菌人工染色體文庫的構(gòu)建及應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào),2005,16(6)：668－671.[2]JosePerez-ortin，MareelL，EmiliaMatallana.etal.Makingyourowngene1ibrary.BioehemiealEdueation，1997，25(4)：23－42.[3]蔡英.大鼠基因組文庫的構(gòu)建及其初步鑒定[D].天津醫(yī)科大學(xué)，2006.1－50.[4]夏平安，劉維全，江禹，等.家蠅基因組文庫的構(gòu)建[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，23(5)：421－423.[5]李鵬，何泉，陳蘭英.轉(zhuǎn)基因小鼠外源基因局部內(nèi)含子序列缺失及其對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，1999,15(5)：704－708.[6]PowellJS，BerknerKL，LeboRV，etal.Humanerythropoietingene:Highlevelexpressioninstablytransfectedmammaliancellsandchromosomelocalization[J].JProeNatlAcadSciUSA，1986，83(17)：6465－6491.[7]BaehlJ，OlssonC，ChitkaraN，etal.TheIgmutantisdependentonthepresencepositionandorientationofthelargeintronenhanee[J].JProeNatlAcadSciUSA，1998，95(5)：2396－2399.[8]NobuyoshiM，LinXH，TakimotoY，etal.TranscriptionregulationofthePDGFA-chaingenebyfirstintronelements[J].BioehemBiophysResCommun，1997，230(3)：569－572.[9]ClarkeL，CarbonJ.AcolonybankcontainingsyntheticE.eolihybridplasmidsrepresentativeoftheentiregenome[J].Cell,1976,9：91－99.[10]ManiatisT,HardisonRC,LacyE,LauerJ,ConnellC.TheisolationofstructuralgenesfromlibrariesofeucaryoticDNA.Cell,1978.[11]樊穎倫，趙開軍.大片段克隆載體研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志，2004,24(3)：12－16.[12]劉祥林，聶劉旺.基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2005.59－98.[13]賀淹才.簡明基因工程原理[M].北京：科學(xué)出版社，2005.53－97.[14]唐爽.山羊基因組文庫構(gòu)建[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005.1－30.[15]Murray,N.E.andMurray.K.1974.ManipulationofrestrictiontargetsinphagelambdatoformreceptorchromosomesforDNAfragments[J].Nature,1976,251－476.[16]RoyalA,GarapinAC,CamiB,etalmonfeaturesintheorganisationofthreegenesexpressedinchicken-oviductunderhormonalcontrol[J].Nature,1979,279：125－132.[17]MeyerowitzEM,GregoryMG,LouiseSPetal.Anewhigh-capacitycosmidvectoranditsuse[J].Gene,1980,11：271－282.[18]CattaneoR,GorskiJ,andMachB.Cloningofmultiplecopiesofimmunoglobulinvariablekappagenesincosmidvectors[J].NucleicAcidsRes,1981,9：2777－2790.[19]GrosveldFG,LundT,MurrayEJ,etal.Theconstructionofcosmidlibrarieswhichcanbeusedtotransformeukaryoticcells[J].NucleicAcidsRes,1982,10：6715－6732.[20]MurrayAW,SzostakJW.ConstructionofartificialchromosomeinYeast[J].Nature,1983,305：89－193.[21]ShizuyaH,BirrenB,KimU,etal.Cloningandstablemaintenanceof300-kilobase-pairfragmentsinEscherichiacoliusinganF-factor-basedvector[J].PNAS,1992,89(18)：8794－8797.[22]ShizuyaH,KourosM.Thedevelopmentandapplicationsofthebacterialartificialchromo