平面色譜法級(jí)藥學(xué)

關(guān)于平面色譜法級(jí)藥學(xué)第一節(jié)平面色譜法的分類和原理第二節(jié)薄層色譜法第三節(jié)紙色譜法本章內(nèi)容第2頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一節(jié)平面色譜法的分類和原理一、平面色譜法的分類組分在以平面為載體的固定相和流動(dòng)相之間吸附或分配平衡而進(jìn)行的一種色譜方法。

按操作方式1薄層色譜法（thinlayerchromatography）2紙色譜法(paperchromatography)3薄層電泳法(thinlayerelectrophoresis)吸附薄層色譜法分配薄層色譜法分子排阻薄層色譜法等等按分離機(jī)制第3頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天二平面色譜法參數(shù)定性參數(shù)：反映組分的保留行為相平衡參數(shù)：描述分離過(guò)程面效參數(shù)：衡量分離效能分離參數(shù)：衡量分離條件的優(yōu)劣第4頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）定性參數(shù)1比移值(Retardationfactor,Rf值)溶質(zhì)移動(dòng)距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離之比。

Rf=L/L0（適宜范圍0.2~0.8，最佳0.3~0.5）

L——原點(diǎn)至斑點(diǎn)中心的距離

L0——原點(diǎn)至溶劑前沿的距離

展開(kāi)溶劑原點(diǎn)L0L前沿第5頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天1比移值(Retardationfactor,Rf值)①

Rf數(shù)值與組分及色譜條件（薄層板活性，展開(kāi)劑等）和溫度有關(guān)②實(shí)驗(yàn)中滿足下列條件，可獲得真實(shí)Rf值：

a展開(kāi)槽密閉不泄露，薄層板周圍空間被展開(kāi)劑蒸汽所飽和，無(wú)邊緣效應(yīng);b沿分離軌跡固定相與流動(dòng)相無(wú)梯度變化;c展開(kāi)劑的前沿位置能正確測(cè)定。第6頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天2相對(duì)比移值(relativeRf；Rr)

Rr=Rf

(i)/Rf

(s)=L(i)/L(s)與組分、色譜條件、參考物質(zhì)有關(guān)。Rr值可以大于1，也可以小于1。重現(xiàn)性和可比性均比Rf值好，能消除系統(tǒng)誤差（參考物質(zhì)與組分在完全相同的條件下展開(kāi)）

第7頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天1

分配系數(shù)K=

2保留因子

k=

=3分配系數(shù)K、保留因子

k與Rf值的關(guān)系：

(二)相平衡參數(shù)組分在固定相中的量組分在流動(dòng)相中的量CsVsCmVmCsCmCs、Cm分別表示在達(dá)到分配平衡后，某物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的濃度。第8頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）面效參數(shù)1

理論塔板數(shù)（n）n=16(L/W)22塔板高度（H）H=L0/n（四）分離參數(shù)1分離度（R）R>12分離數(shù)（SN）R=1.177時(shí)，

SN=L0/(b0+b1)-1,dW1W2Rf=0Rf=1前沿原點(diǎn)SN:7~10（一般TLC板）

10~20（高效TLC板）第9頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)薄層色譜法

(thinlayerchromatography；TLC)一定義、特點(diǎn)、主要類型二吸附薄層色譜的吸附劑和展開(kāi)劑三薄層色譜操作方法四定性和定量分析五高效薄層色譜法六薄層掃描法簡(jiǎn)介七在藥物研究中的應(yīng)用第10頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天薄層色譜法特點(diǎn)：1分析速度快，需十至幾十分鐘，同時(shí)展開(kāi)多個(gè)試樣。2試樣預(yù)處理簡(jiǎn)單，對(duì)試樣限制少。3載樣量比較大，適用于制備。4儀器簡(jiǎn)單，操作方便。5分離能力較強(qiáng)，分析結(jié)果直觀。一薄層色譜法定義、特點(diǎn)及主要類型定義：將吸附劑或載體涂布成一均勻薄層，點(diǎn)樣，（密閉的容器中）展開(kāi)，斑點(diǎn)顯色，（與對(duì)照物質(zhì)比較）進(jìn)行定性定量。

第11頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天薄層色譜法的主要類型1吸附薄層色譜法原理：組分在薄層板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的過(guò)程。

吸附系數(shù)Ka

大小不同實(shí)現(xiàn)分離極性強(qiáng)的組分Ka

大，Rf值??；極性弱的組分Ka

小，Rf值大。

第12頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天2分配薄層色譜法原理：多次分配的過(guò)程，分配系數(shù)（溶解度）大小不同實(shí)現(xiàn)分離分類：按流動(dòng)相與固定相極性大?。?）正相色譜固定相：含水硅膠流動(dòng)相：有機(jī)溶劑。 極性強(qiáng)的組分K大，Rf值小。（2）反相色譜：固定相：烷基化學(xué)鍵合相流動(dòng)相：水－有機(jī)溶劑。 極性強(qiáng)的組分K小，Rf值大。第13頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天3凝膠薄層色譜法：

用葡聚糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠等鋪成薄層板進(jìn)行大分子化合物的分離。凝膠是具有一定孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是利用其網(wǎng)孔大小把分子大小和形狀不同的大分子化合物分開(kāi)（一般是分開(kāi)成組，而不能分開(kāi)為單一化合物），又稱為排阻或分子篩層析法。4膠束薄層色譜法(micellarTLC)：

用低濃度表面活性劑的水溶液為流動(dòng)相，當(dāng)所用的表面活性劑水溶液需超過(guò)某一濃度（臨界膠束濃度CMC）時(shí)多余的表面活性劑不再溶解，而聚集成膠束（膠粒），因流動(dòng)相為膠體分散體系，故稱為膠束液相色譜。薄層色譜法的主要類型第14頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、吸附薄層色譜的吸附劑和展開(kāi)劑（一）吸附劑

1硅膠：多孔性無(wú)定形粉末，表面帶有硅醇基（≡Si-OH），呈弱酸性,表面pH≈5。

原理：硅醇基(吸附中心)與極性基團(tuán)形成氫鍵（吸附性）。組分與硅醇基形成氫鍵（被吸附）的能力不同而分離。

應(yīng)用：酸性和中性物質(zhì)的分離，如有機(jī)酸酚類、醛類等。堿性物質(zhì)與硅膠作用，展開(kāi)時(shí)被吸附、拖尾、甚至展不開(kāi)。第15頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天硅膠活度與含水量的關(guān)系：含水量高，活性級(jí)高，活度低。活化：加熱至100℃左右，除去吸附水提高度。（注意溫度不可過(guò)高，硅醇基→硅氧基）分離效率：與其粒度、孔徑及表面積等有關(guān)。一般地(10-40μm)(100nm)(400-600m2/g)常用硅膠：①硅膠H——不含黏合劑②硅膠G(Gypsum,石膏)：含煅石膏（CaSO4·1/2H2O）③硅膠GF254：含煅石膏和一種無(wú)機(jī)熒光劑，即錳激活的硅酸鋅，在254nm紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光背景。第16頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天2氧化鋁（活度也與含水量有關(guān)）堿性氧化鋁(pH9.0)——分離中性或堿性化合物，如生物堿、脂溶性維生素等；

中性氧化鋁(pH7.5)——分離酸性及對(duì)堿不穩(wěn)定的化合物；酸性氧化鋁(pH4.0)——酸性化合物的分離。第17頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天3聚酰胺聚己內(nèi)酰胺：白色多孔性非晶型粉末酰胺基與化合物質(zhì)子給體形成氫鍵而對(duì)化合物產(chǎn)生吸附。應(yīng)用：酚、酸、硝基、醌類等分離第18頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）展開(kāi)劑(流動(dòng)相)

選擇原則：同吸附柱色譜，根據(jù)被分離物質(zhì)的極性、吸附劑活度、展開(kāi)劑極性Stahl簡(jiǎn)圖：例：極性物質(zhì)↓活度低（活性級(jí)大）的吸附劑↓極性展開(kāi)劑

第19頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

常用溶劑的極性強(qiáng)弱順序★

★水＞酸＞吡啶＞甲醇＞乙醇＞正丙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二氯甲烷＞甲苯＞苯＞三氯乙烷＞四氯化碳>環(huán)己烷>石油醚極性強(qiáng)的溶劑，洗脫能力強(qiáng)第20頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天單一溶劑展開(kāi)→分離效果Rf

？→

Rf值太?。杭訕O性強(qiáng)的溶劑，如乙醇、丙酮等；→

Rf值太大，加極性弱的溶劑，如環(huán)己烷、石油醚等；→可加入一定比例的酸或堿,使斑點(diǎn)集中。展開(kāi)劑混合溶劑第21頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、薄層色譜操作方法1制板均勻2點(diǎn)樣集中3展開(kāi)(多種方式)預(yù)飽和4斑點(diǎn)定位

第22頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天1薄層板的制備（1）薄層板的選擇表面光滑、平整、潔凈，厚度一致玻璃板、塑料板或鋁箔大小按實(shí)驗(yàn)需要選規(guī)格：

10cm×10cm10cm×l5cm20cm×10cm20cm×20cm

第23頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）薄層板的涂布：將固定相、粘合劑和水，按比例混合均勻、無(wú)氣泡的固定相勻漿均勻玻璃板(厚度為0.25～0.5mm)玻板置室溫下水平臺(tái)上晾干在反射光及透射光下檢視薄層板表面應(yīng)均勻，干整，無(wú)麻點(diǎn)、無(wú)氣泡、無(wú)破損及污染。研磨涂布（使用涂布器、傾倒涂層、浸涂、噴涂）第24頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）薄層板的活化一般活化：硅膠110℃烘30分鐘，氧化鋁110℃烘45分鐘強(qiáng)活化：硅膠150℃烘4h，氧化鋁180℃烘4h冷卻后立即使用或置干燥箱中備用，或用商品預(yù)制板。第25頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天2點(diǎn)樣樣品溶液：濃度0.01％～0.1％,溶劑：有機(jī)溶劑，如乙醇或甲醇等，避免用水；點(diǎn)樣工具：點(diǎn)樣毛細(xì)管或微量注射器點(diǎn)樣基線距底邊1.0-1.5cm樣點(diǎn)一般為圓點(diǎn)，直徑一般2-4mm采用分量多次點(diǎn)，每次點(diǎn)樣需自然干燥或電吹風(fēng)吹干后，才能二次點(diǎn)樣。點(diǎn)樣量:幾微升，薄層定量或薄層制備時(shí)，可幾百微升點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。

第26頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天3展開(kāi)將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開(kāi)缸的展開(kāi)劑中，浸入展開(kāi)劑的深度為距原點(diǎn)5mm為宜，密閉，待展開(kāi)至規(guī)定距離，除另有規(guī)定外，一般為8～15cm，取出薄層板，標(biāo)記溶劑前沿，晾干，按具體試驗(yàn)的規(guī)定檢測(cè)。展開(kāi)缸如需預(yù)先用展開(kāi)劑預(yù)平衡，可在缸中加入適量的展開(kāi)劑，必要時(shí)并在壁上貼二條與缸一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開(kāi)劑中，蓋嚴(yán)，使展開(kāi)缸平衡。避免邊緣效應(yīng)。第27頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天邊緣效應(yīng)：同一組分在同一板上處于邊緣斑點(diǎn)的Rf比處于中心的Rf值大的現(xiàn)象。產(chǎn)生原因：展開(kāi)劑的蒸發(fā)速度從薄層中央到兩邊緣逐漸增加，即處于邊緣的溶劑揮發(fā)速度較快。在相同條件下，致使同一組分在邊緣的遷移距離大于中心的遷移距離。薄層色譜的邊緣效應(yīng)展開(kāi)劑：氯仿-甲醇（95：5）展開(kāi)距離10cm第28頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天展開(kāi)一個(gè)TLC板，一個(gè)紫色的斑點(diǎn)被分離為一個(gè)紅色斑點(diǎn)與一個(gè)藍(lán)色斑點(diǎn)第29頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天樣品的二次展開(kāi)B一次展開(kāi)C二次展開(kāi)A點(diǎn)樣溶劑展開(kāi)方向第30頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天4斑點(diǎn)的確定斑點(diǎn)位置的確定方法：（1）在日光燈下觀察，畫出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置；（2）在紫外燈下（254nm或365nm）觀察有無(wú)暗斑或熒光斑點(diǎn)，并記錄其顏色、位置及強(qiáng)弱。（3）254nm紫外燈下，摻入了少量熒光物質(zhì)的薄板呈黃綠色熒光，被測(cè)組分在熒光薄層板上猝滅而產(chǎn)生暗斑進(jìn)行檢出。(注意帶防護(hù)眼鏡)（4）利用顯色劑顯色斑點(diǎn)（適合無(wú)色無(wú)紫外吸收的物質(zhì)）。

第31頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天通用型顯色劑：碘：生物堿、氨基酸類、肽類、脂類、皂苷類10％硫酸乙醇溶液：105℃加熱10-15min，大多數(shù)有機(jī)物（紅色、棕色、紫色或出現(xiàn)熒光）0.05％熒光黃甲醇溶液：芳香族與雜環(huán)專屬型顯色劑：如：0.3%茚三酮丁醇溶液（含3%醋酸）檢測(cè)氨基酸及脂肪伯胺類化合物，顯粉紅色到紫色；等等第32頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天10種精油通過(guò)薄層色譜展開(kāi)后，再使用香草醛試劑顯色后的效果。第33頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、定性和定量分析1定性分析

a比較Rf值或Rr值、斑點(diǎn)顏色或熒光b常采用已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照（同一板上展開(kāi)）c多種展開(kāi)系統(tǒng)的Rf值與對(duì)照品一致。2定量分析

a洗脫法b直接定量法

b1.目視比較法（如雜質(zhì)檢查方法）

b2.薄層掃描法第34頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

雜質(zhì)檢查方法1雜質(zhì)對(duì)照品比較法：配制試樣溶液（A）和規(guī)定限量濃度的雜質(zhì)對(duì)照品溶液（B）斑點(diǎn)顏色：試樣中雜質(zhì)不得比雜質(zhì)對(duì)照品深2主成分自身對(duì)照法供試品溶液（A1）,將其稀釋一定倍數(shù)得到低濃度溶液（A2）作為對(duì)照溶液,將供試液和對(duì)照液一同展開(kāi)，供試液中雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色不得比對(duì)照液主斑點(diǎn)深。AB雜質(zhì)A1A2雜質(zhì)主斑點(diǎn)第35頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天五高效薄層色譜法1高效薄層板：商品預(yù)制板2點(diǎn)樣：濃溶液一次點(diǎn)樣點(diǎn)樣器：鉑-銥合金點(diǎn)樣毛細(xì)管、微量注射器或?qū)Ｓ命c(diǎn)樣儀器。3展開(kāi)：與經(jīng)典薄層色譜法相同的展開(kāi)方式?；?qū)Ｓ酶咝П由V展開(kāi)槽（重現(xiàn)性較好）。4定量分析：均采用薄層掃描儀定量分析。第36頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天六薄層掃描法簡(jiǎn)介（一）薄層掃描法基本原理用一定波長(zhǎng)和強(qiáng)度的光照射到薄層斑點(diǎn)上進(jìn)行整個(gè)斑點(diǎn)掃描，用儀器測(cè)量透過(guò)斑點(diǎn)或被斑點(diǎn)反射的光束強(qiáng)度的變化達(dá)到定量的目的。

斑點(diǎn)掃描積分面積－物質(zhì)含量第37頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）薄層掃描儀組成：主機(jī)：光源：可見(jiàn)光源鎢燈400-800nm

紫外光源氘燈200-400nm

（光源選擇桿變換）

分光器：光柵200-800nm

檢測(cè)器：光電倍增管

數(shù)據(jù)處理及信號(hào)輸出第38頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天1薄層色譜掃描儀光束系統(tǒng)光波長(zhǎng)1波長(zhǎng)2檢測(cè)器斬波器光波長(zhǎng)1檢測(cè)器光波長(zhǎng)1檢測(cè)器斬波器A單光束B(niǎo)雙光束C雙波長(zhǎng)第39頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.1透射法光源與檢測(cè)器在薄層板上下兩側(cè)。光源發(fā)出的光經(jīng)單色器成為一定波長(zhǎng)的單色光，光束照到薄層斑點(diǎn)上，測(cè)量透射光強(qiáng)度。實(shí)際應(yīng)用少光源單色器2薄層色譜掃描儀測(cè)定方法第40頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.2反射法光源與檢測(cè)器在薄層板同側(cè)。光源發(fā)出的光經(jīng)單色器成為一定波長(zhǎng)的單色光，光束照到薄層斑點(diǎn)上，部分被薄層吸收，部分經(jīng)過(guò)漫反射又折回表面成為反射光，測(cè)量反射光強(qiáng)度，得到反射光譜。反射吸收度與物質(zhì)含量有確定關(guān)系，可進(jìn)行定量。光源單色器第41頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天3薄層色譜掃描儀掃描方式直線型掃描（linearscan）用一束比斑點(diǎn)寬度略寬的光作一個(gè)方向的等速掃描。鋸齒型掃描(zigzagscan）或稱飛點(diǎn)（flyingspot）掃描用微小的正方形光速在對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行Y軸等速直線掃描的同時(shí)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行X軸等輻往復(fù)掃描，光束運(yùn)動(dòng)軌跡呈鋸齒形。直線掃描鋸齒掃描輪廓曲線積分曲線第42頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天A

B

C斑點(diǎn)ABC對(duì)于不規(guī)則斑點(diǎn)，兩種掃描結(jié)果不一樣。同一斑點(diǎn)從A、B、C三個(gè)不同方向掃描，鋸齒掃描所得積分值變動(dòng)小，而直線掃描所得積分值變動(dòng)大。直線掃描鋸齒掃描第43頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天4散射參數(shù)的選擇——非線性關(guān)系的校正曲線校正：實(shí)驗(yàn)前根據(jù)薄層板的類型，選擇合適的散射參數(shù)（SX），由計(jì)算機(jī)根據(jù)適當(dāng)?shù)男拚绦颍詣?dòng)進(jìn)行校正。曲線較直后方可進(jìn)行定量分析。島津薄層掃描儀一般設(shè)有10個(gè)散射參數(shù)，硅膠薄層板，SX一般選用3，氧化鋁板選7.樣品量吸光度DCBAA未校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線B校正不夠C校正合適D校正過(guò)頭第44頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天5

定量分析法（１）外標(biāo)法：分別配制對(duì)照品溶液和樣品溶液，先做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在同一塊薄層板上交叉點(diǎn)對(duì)照品溶液和樣品溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（對(duì)照品含量和峰面積值）和樣品的面積值計(jì)算出樣品的含量。（２）外標(biāo)一點(diǎn)法（３）外標(biāo)兩點(diǎn)法A1aC10AxCx外標(biāo)一點(diǎn)法A1aC10A2CxC2b外標(biāo)兩點(diǎn)法第45頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天6分析誤差薄層分析的誤差包括三個(gè)方面：點(diǎn)樣誤差、展開(kāi)誤差、定位誤差和檢測(cè)誤差。采用自動(dòng)點(diǎn)樣器，誤差可控制在0.5%，熟練的分析人員用毛細(xì)管點(diǎn)樣，誤差小于1.0%，若用微量進(jìn)樣器，誤差會(huì)大一些。展開(kāi)誤差來(lái)自鋪板的均勻性和樣品展開(kāi)效果，若采用預(yù)制的高效薄層板，誤差會(huì)明顯降低，采用雙波長(zhǎng)鋸齒掃描，也能有效降低展開(kāi)誤差。第46頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天定位誤差：斑點(diǎn)的位置和大小判定，擴(kuò)散、脫尾等易產(chǎn)生定位誤差。檢測(cè)誤差來(lái)自光源的穩(wěn)定性、光檢測(cè)器的穩(wěn)定性以及樣品對(duì)光吸收（或熒光產(chǎn)生）的線性度等方面。為減少這些誤差，需要非常精密的機(jī)電系統(tǒng)，這也直接導(dǎo)致產(chǎn)品高昂的價(jià)格。通常情況下，薄層掃描分析的誤差可控制在3%以下。第47頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天七薄層色譜法在藥物分析中的應(yīng)用1藥物與毒物的快速鑒定；2藥物的鑒別和純度檢查；3混合物質(zhì)的分離和微量提純（包括異構(gòu)體的分離）；4復(fù)方制劑的定性與定量分析；5藥物及其制劑在制備和貯藏過(guò)程中的穩(wěn)定性考察，及有關(guān)質(zhì)量的研究；鹵菜中色素的鑒別第48頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天6體液中藥物及其代謝物的分離分析；7中草藥有效成分的分離、提純與研究；8化學(xué)藥物合成反應(yīng)歷程的判斷與控制，及中間體的質(zhì)量控制；為一般柱色譜或高效液相色譜法選擇合適的分離條件；幫助判斷分析物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及用于物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定?！璭tc.七薄層色譜法在藥物分析中的應(yīng)用第49頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

使用薄層色譜法分離綠葉的提取物（如菠菜）的7個(gè)階段。胡蘿卜素洗脫的速度很快因此只能在第二步中看到。葉綠素A和B在最后一步的中間位置，葉黃素是保持黃色的第一個(gè)斑點(diǎn)。

從左到右：第1階段-第7階段第50頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天黑墨水在T