實(shí)驗(yàn)八聚炳烯凝膠電泳

關(guān)于實(shí)驗(yàn)八聚炳烯凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理2)掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)第2頁,共31頁，2024年2月25日，星期天二.基本原理(一)電泳電泳:帶電顆粒在電場的作用下,向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象.(二)聚丙烯酰胺凝膠電泳

用丙烯酰胺(Acr)單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下聚合成的多孔介質(zhì).以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)。第3頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

1.聚丙烯酰胺凝膠有下列特性(1)凝膠有彈性，機(jī)械性能好；幾乎無吸附和電滲作用，樣品分離重復(fù)性好；(2)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度較高。(3)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(4)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。第4頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 蛋白分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系2.凝膠濃度的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)

第5頁,共31頁，2024年2月25日，星期天3凝膠聚合催化體系（1）光催化：核黃素

（2）化學(xué)催化：AP-TEMED催化體系第6頁,共31頁，2024年2月25日，星期天Bis將單體長鏈間連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)第7頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

化學(xué)聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，重復(fù)性好。聚合反應(yīng)受各種因素的影響：?催化劑和加速劑的濃度?pH堿性條件?溫度?分子氧?雜質(zhì)第8頁,共31頁，2024年2月25日，星期天4.聚丙烯酰胺凝膠種類(1)連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類

不連續(xù)系統(tǒng):是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進(jìn)行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進(jìn)行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。

第9頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(2)不連續(xù)體系:電極緩沖液、濃縮膠及分離膠濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。第10頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

1)樣品濃縮效應(yīng)

A.凝膠孔徑不連續(xù)性

B.緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

C.電位梯度的不連續(xù)性

2)分子篩效應(yīng)

3)電荷效應(yīng)(3)不連續(xù)體系凝膠對蛋白的分離作用第11頁,共31頁，2024年2月25日，星期天三.實(shí)驗(yàn)器材1、電泳儀,電泳槽及其附件2、培養(yǎng)皿3、搖床4、燒杯5、移液管6、微量進(jìn)樣器7、針管第12頁,共31頁，2024年2月25日，星期天電泳裝置電泳儀：提供直流電在電泳槽中產(chǎn)生電場，驅(qū)動(dòng)帶電分子的遷移第13頁,共31頁，2024年2月25日，星期天垂直平板電泳槽每組（3人）做一板膠，前后可安置兩副板，兩組共用一套電泳裝置。第14頁,共31頁，2024年2月25日，星期天四.實(shí)驗(yàn)試劑人血清；分離膠緩沖液：Tris-HCl緩沖液PH8.9；濃縮膠緩沖液:Tris-HCl緩沖液PH6.7；分離膠貯液:Acr28.0g,Bis0.735g,無離子水溶解定容至100ml；濃縮膠貯液:Acr10.0g,Bis2.5g,無離子水溶解定容至100ml；過硫酸銨溶液（AP）電泳緩沖液:Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3；固定染色液脫色液第15頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(一)垂直平板電泳槽的安裝(二)凝膠的制備(三)加樣(四)電泳(五)固定和染色(六)脫色五.操作步驟第16頁,共31頁，2024年2月25日，星期天五.操作步驟(一).垂直平板電泳槽的安裝注意短玻璃板是向內(nèi)側(cè)的。第17頁,共31頁，2024年2月25日，星期天要將玻板底邊平齊地壓緊在紅色橡膠條上，否則容易漏膠。第18頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(二).凝膠的制備1分離膠的制備(7%)配8mL(按如下順序加入）分離膠緩沖液1mL分離膠貯液2mL去離子水4mLTEMED2uL過硫酸胺（AP)1mL將上述試劑迅速混勻后，用滴管沿壁迅速加樣至2/3處，再取大約3mL的水加在上面直至凝膠凝固為止。加入此物后請迅速混勻加樣，否則易凝固無法加樣凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面.

水封的目的是為了使分離膠上緣平直，并排除氣泡第19頁,共31頁，2024年2月25日，星期天2.凝聚后倒出上層的高純水，可用濾紙?jiān)谶吘壩?.濃縮膠的制備(2.5%)配4mL(按如下順序加入）濃縮膠緩沖液0.5mL濃縮膠貯液1mL去離子水2mL過硫酸胺（AP)0.5mL迅速混勻,用膠頭滴管沿壁連續(xù)平穩(wěn)加樣到分離膠上面,直至上邊緣,迅速插入加樣梳,室溫靜置一段時(shí)間.※加樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平，注意梳子的朝向，平的一面貼長玻板.第20頁,共31頁，2024年2月25日，星期天凝膠凝聚后，垂直小心拔出加樣梳，用窄條濾紙吸在玻板邊緣吸去多余的液體。第21頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(三).進(jìn)樣除去底板，將制膠裝置放在電泳槽內(nèi)，加入稀釋10倍的Tris－甘氨酸電極緩沖液（注意：加緩沖液先從內(nèi)槽加入，上面沒過短玻璃板，外槽液面沒過最下一個(gè)螺絲處,加樣前要使凝膠凹形樣品槽內(nèi)的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.（用針筒將凹洞中的氣泡抽出）第23頁,共31頁，2024年2月25日，星期天用微量進(jìn)樣器取已經(jīng)混合好的樣品15μl

，在距凝膠凹形槽底三分之一處緩緩進(jìn)樣,每人加2個(gè)樣，兩邊各留2孔不加樣，避免邊緣效應(yīng)?！訕訒r(shí)不可過低,以防刺破膠體(三).進(jìn)樣第24頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(四).電泳將電泳儀的正極負(fù)極與電泳槽連接（方向切勿接錯(cuò)），打開電泳儀開關(guān)，開始時(shí)將電壓調(diào)至150V，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓調(diào)至250V。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離凝膠下端2cm時(shí)，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電源。第25頁,共31頁，2024年2月25日，星期天電泳結(jié)束后，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開短玻璃板，（不要撬兩邊耳朵處，易斷裂）在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，用緩沖液沖洗膠板，將其移至大培養(yǎng)皿中染色。※剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無損,染色要充分.第26頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(五).固定和染色

將凝膠放入固定染色液中，使染色液剛好沒過膠板，放到搖床上，緩慢搖動(dòng)，染色7min。(注意染色液要用漏斗回收）(六).脫色放置搖床上，用脫色液漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色褪去。

第27頁,共31頁，2024年2月25日，星期天六.實(shí)驗(yàn)結(jié)果可在培養(yǎng)皿下襯一白紙，便于觀察，用手機(jī)拍下凝膠圖，打印出來附在實(shí)驗(yàn)報(bào)告后。第28頁,共31頁，2024年2月25日，星期天1、Acr和Bis為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作應(yīng)戴手套。2、玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時(shí)會造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；撥膠時(shí)凝膠板易斷裂，為防止此現(xiàn)象，所用器材均應(yīng)嚴(yán)格的清洗。

3、安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃板的硅橡膠框時(shí)，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏，但亦不可太用力旋，易將玻板邊緣壓破。

4、制備濃縮膠時(shí)，注意梳齒邊