化學(xué)工藝學(xué)：生物物質(zhì)分離純化

第六節(jié)生物物質(zhì)分離純化一些天然存在以及通過各種生物反應(yīng)過程產(chǎn)生的物質(zhì)，涉及從低分子化合物到具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能的生物組織，包括氨基酸、糖類、脂質(zhì)、抗生素、多肽和蛋白質(zhì)等。生物物質(zhì)生物產(chǎn)品分離的流程可概括為：

產(chǎn)品捕獲粗分離純化及精制返回生物產(chǎn)品尤其是蛋白質(zhì)類生物大分子具有如下特點(diǎn)：①目的產(chǎn)物在原料液中的含量很低，有時甚至是極微量的；②含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜，除了產(chǎn)物外，還含有大量的細(xì)胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基等；③生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性差，易失活、變性；④生化產(chǎn)品種類繁多，包括了大、中、小相對分子質(zhì)量的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)復(fù)雜又各異的生物活性物質(zhì)；⑤生物產(chǎn)品一般用于食品、化妝品和醫(yī)藥，與人生命息息相關(guān)，對含量和純度要求高等特點(diǎn)。生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化生物產(chǎn)品的分離純化技術(shù)須滿足的要求：①分離條件溫和，特別對具有生物活性的物質(zhì)，在分離純化過程中必須保持其生物活性，避免其失活；②分離純化技術(shù)的選擇性好、專一性強(qiáng)，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目標(biāo)產(chǎn)物分離出來，以達(dá)到較高的分離純化倍數(shù)；③在提高單個分離技術(shù)的效率的同時，注意各操作間的有效組合和整體協(xié)調(diào)，盡可能地減少工藝過程的步驟，增加每一步的收率。生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化生物產(chǎn)品分離純化的一般步驟及主要分離純化技術(shù)的基本原理

生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化1生物物質(zhì)分離的純化方法萃取法有機(jī)溶劑萃取法原理：依靠在水和有機(jī)溶劑中的分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離。特點(diǎn)：適用于有機(jī)化合物及結(jié)合有脂質(zhì)或非極性側(cè)鏈的蛋白質(zhì)等的分離。其中反膠團(tuán)系統(tǒng)較適合于生物活性物質(zhì)的萃取。缺點(diǎn)：萃取條件嚴(yán)格，安全性低，活性收率低。生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化雙水相萃取法原理：依據(jù)目的物在不相溶的聚合物或無機(jī)鹽溶液形成的兩相中的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離特點(diǎn)：可連續(xù)或批式操作，設(shè)備要求簡單，萃取容易，操作穩(wěn)定，極易放大。適合于大規(guī)模應(yīng)用。將離子交換基團(tuán)、親和配基、疏水配基等結(jié)合在聚合物分子上可改進(jìn)分配系數(shù)及萃取專一性缺點(diǎn)：成本較高，純化倍數(shù)較低，適合于粗分離生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化反膠團(tuán)萃取法原理：利用表面活性劑形成的“油包水”微滴，對蛋白質(zhì)等進(jìn)行分離特點(diǎn)：有一定的選擇性，操作簡單，萃取能力大缺點(diǎn)：表面活性劑篩選工作量大，目前還缺乏應(yīng)用實(shí)例生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化凝膠萃取法原理：利用凝膠可發(fā)生可逆、非連續(xù)的溶脹和皺縮以及對所吸收的液體具有選擇性的性質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)分離特點(diǎn)：設(shè)備簡單、能耗低、再生容易，有良好的應(yīng)用前景缺點(diǎn)：目前還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化超臨界流體萃取原理：利用某些流體在高于其臨界壓力和臨界溫度時形成的超臨界流體作為溶劑進(jìn)行萃取特點(diǎn)：萃取能力大、速度快，可通過控制溫度和壓力改變對某些物質(zhì)的選擇性缺點(diǎn)：操作壓力大，目前大規(guī)模應(yīng)用的例子不多，但研究十分活躍生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化有機(jī)溶劑沉淀法原理：利用有機(jī)溶劑破壞蛋白質(zhì)分子的水化層，使之聚集成更大的分子而沉淀特點(diǎn)：可用于沉淀各種蛋白質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)分級沉淀，達(dá)到粗分離和濃縮的目的，應(yīng)用較廣、簡便缺點(diǎn)：需低溫下進(jìn)行，沉淀時會發(fā)生蛋白質(zhì)變形失活沉淀法生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化鹽析法原理：利用無機(jī)鹽破壞蛋白質(zhì)分子的水化層，中和表面電荷，使之聚集成更大的分子團(tuán)而沉淀特點(diǎn)：可用于蛋白質(zhì)分級沉淀或沉淀、粗分離及濃縮作用，對生物活性有一定的保護(hù)作用，方法簡便，可大規(guī)模應(yīng)用缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)的回收率一般，產(chǎn)生的廢水含鹽高，對環(huán)境有較大影響生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化等電點(diǎn)沉淀法原理：利用帶電物質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最小的原理，在低的離子強(qiáng)度下，調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)等所帶電荷為零，使蛋白質(zhì)等物質(zhì)沉淀出來，從而實(shí)現(xiàn)分離特點(diǎn)：方法簡單、有效，成本較低，是常用的粗分離方法缺點(diǎn)：酸化時，目標(biāo)產(chǎn)物比較容易失活生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化化學(xué)沉淀法原理：通過化學(xué)試劑與目的產(chǎn)物形成新的化合物，改變?nèi)芙舛榷恋硖攸c(diǎn)：可針對性沉淀目的產(chǎn)物缺點(diǎn)：通用性差，需分解沉淀，回收目的產(chǎn)物生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化超濾和微濾原理：利用膜的篩分性質(zhì)，以壓差為傳質(zhì)推動力，膜具有明顯的孔道結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：超濾適用于分離或濃縮直徑1~50nm的生物大分子，微濾適用于細(xì)胞、細(xì)菌和微粒子的分離，目標(biāo)物質(zhì)的大小范圍0.01~10

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缺點(diǎn)：膜易堵塞，膜需經(jīng)常清洗、再生膜分離生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化透析原理：利用膜的篩分性質(zhì)，以濃差為傳質(zhì)推動力特點(diǎn)：用于生物大分子的脫鹽和復(fù)性缺點(diǎn)：樣品處理量小電滲析原理：利用分子的荷電性質(zhì)和分子大小的差別進(jìn)行分離特點(diǎn)：用于氨基酸和有機(jī)酸等生物小分子的分離純化缺點(diǎn)：設(shè)備成本較高，操作較復(fù)雜，膜易堵塞，膜需經(jīng)常清洗、再生生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化滲透汽化原理：利用溶質(zhì)間透過膜的速度不同，以壓差和溫差為推動力特點(diǎn)：適合于乙醇和丁醇等揮發(fā)性發(fā)酵產(chǎn)物的分離缺點(diǎn)：設(shè)備成本較高，操作較復(fù)雜，膜易堵塞，膜需經(jīng)常清洗、再生生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化離子交換層析原理：依據(jù)被分離物質(zhì)各組分的電荷性質(zhì)、數(shù)量以及與離子交換劑的吸附和交換能力不同而達(dá)到分離的目的特點(diǎn)：適用于帶有電荷的大、中、小及生物活性或非生物活性物質(zhì)的分離純化，純化效率較高，可柱式操作和攪拌式操作。應(yīng)用廣泛，常用于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)缺點(diǎn)：操作較復(fù)雜，試劑消耗量較大，成本高，放大比較困難，離子交換劑需再生后方可再用層析法生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化吸附層析法原理：依據(jù)范德華力、氫鍵等作用力將分離物吸附于吸附劑上，然后改變條件進(jìn)行洗脫，達(dá)到分離純化的目的特點(diǎn)：吸附色譜可柱式或攪拌式操作。吸附劑種類繁多，可選擇范圍和應(yīng)用范圍廣，吸附和解吸的條件溫和，不需要復(fù)雜的再生缺點(diǎn)：選擇性較低，柱式操作放大困難生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化凝膠層析法原理：依據(jù)分子大小進(jìn)行分離特點(diǎn)：分離條件溫和，活性收率較高，選擇性和分辨率高，應(yīng)用廣，適合于生物大分子的分離純化缺點(diǎn)：放大較困難，稀釋度高，操作不易掌握生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化疏水層析法原理：依靠疏水相互作用進(jìn)行分離特點(diǎn)：選擇性較好，使用穩(wěn)定性好，應(yīng)用較廣缺點(diǎn)：成本較高，放大困難，需較嚴(yán)格控制條件，保證活性收率生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化親和層析法原理：依據(jù)目的產(chǎn)物與專一性配基的專一性相互作用進(jìn)行分離特點(diǎn)：選擇性極高，純化倍數(shù)和效率高，可從復(fù)雜的混合物中直接分離目的產(chǎn)物缺點(diǎn)：成本高，配基親和穩(wěn)定性差，使用壽命有限，親和材料制備復(fù)雜，放大困難生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化結(jié)晶法原理：利用只有同類分子或離子才能排列成為晶體的性質(zhì)進(jìn)行分離特點(diǎn)：選擇性好，成本低，設(shè)備簡單，操作方便，廣泛應(yīng)用與抗生素等的分離缺點(diǎn)：要得到均勻的結(jié)晶時需要很高的操作要求，常常需要純凈的初始溶液、濃縮以及重結(jié)晶才能得到高品位的產(chǎn)物結(jié)晶法生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化2生物分離工藝介紹設(shè)計生物分離工藝流程時應(yīng)從以下幾個方面考慮：（1）產(chǎn)品的純度和質(zhì)量（2）分離方法的合理組合包括合理組合分離技術(shù)，設(shè)計合理的分離順序及分離過程的銜接，進(jìn)行各種分離技術(shù)的集成化（3）分離的成本考慮盡可能地降低成本，設(shè)法減少操作步驟并盡可能地增加每一步的收率，縮短周期生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化生物分離工藝的設(shè)計方法方法啟發(fā)式：借鑒相同或相似產(chǎn)品的分離工藝來進(jìn)行設(shè)計設(shè)計啟發(fā)式：依據(jù)設(shè)計者的豐富經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行工藝設(shè)計的一種設(shè)計方法專家啟發(fā)式：依據(jù)專家系統(tǒng)進(jìn)行定性和定量分析后，通過檢查、驗(yàn)證、移植進(jìn)行分離工藝的設(shè)計數(shù)學(xué)模型式：依據(jù)分離純化技術(shù)和生產(chǎn)過程中已建立的數(shù)學(xué)模型，對工藝進(jìn)行檢驗(yàn)和設(shè)計，僅適用于簡單工藝的設(shè)計合成式：依據(jù)上述四種方法進(jìn)行合成生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化分離工藝設(shè)計常采用的過程

生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化生物物質(zhì)下游加工過程的一般流程原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線1路線2細(xì)胞破碎碎片分離路線1A路線1B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超過濾)濃縮(超過濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化由于產(chǎn)物及雜質(zhì)的種類不同，生化產(chǎn)品的分離純化工藝也是不同的。但還是有一些共同點(diǎn)，總是將最容易分離的物質(zhì)放在前面，而將難以分離的物質(zhì)留在后面進(jìn)行分離。第一步采用非特異性低分辨率的分離技術(shù)，如沉淀、粗吸附；第二步采用高分辨、較高選擇性的分離技術(shù)；最后選擇兼有高選擇性分離純化、澄清、脫鹽等作用的分離技術(shù)。這種工藝安排是基于在粗分離時，物料體積較大，使用便宜、低選擇性的技術(shù)來降低成本。而后面的步驟由于物料體積的減小和雜質(zhì)的減少，就可以比較經(jīng)濟(jì)地使用更昂貴的高選擇性分離步驟。生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化3動物細(xì)胞培養(yǎng)的下游過程動物細(xì)胞培養(yǎng)是指動物細(xì)胞在體外條件下的存活和生長，此時細(xì)胞不再形成組織。應(yīng)用：生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體、免疫調(diào)節(jié)劑、酶和激素等。例如，中國倉鼠卵巢成纖維細(xì)胞（CHO細(xì)胞）以及敘利亞幼倉鼠腎腫瘤細(xì)胞（BHK細(xì)胞）廣泛用于表達(dá)重組蛋白。生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化3動物細(xì)胞培養(yǎng)的下游過程通常采用如下的工藝：培養(yǎng)液凈化富集初步純化精制產(chǎn)品。在動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物蛋白的分離純化過程中，一旦條件合適，就應(yīng)采用分離純化效率最高的層析法進(jìn)行蛋白的分離純化。但具體如何選擇，就要根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物和準(zhǔn)備處理的原料情況來確定。生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化病毒的分離純化在病毒的生產(chǎn)過程中，首先應(yīng)考慮的因素是可得到的最大病毒濃度、在純化過程中出現(xiàn)難分離的雜質(zhì)以及潛在的致敏性等。病毒的分離純化步驟為：培養(yǎng)液溶胞產(chǎn)物的澄清病毒懸浮液的濃縮濃縮液的純化產(chǎn)品。病毒懸浮液的濃縮則可采用沉淀法、吸附-洗脫法、超濾法等來進(jìn)行。病毒濃縮液的純化可采用密度梯度離心、病毒親和色譜、分子篩色譜等方法。生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化基因工程產(chǎn)物的分離純化工藝設(shè)計基因工程產(chǎn)物分離純化工藝的設(shè)計特點(diǎn)：（1）產(chǎn)物的表達(dá)形式不同采取的設(shè)計策略不同（2）根據(jù)蛋白性質(zhì)的不同選用不同的分離過程通常是根據(jù)產(chǎn)物分子的理化參數(shù)和生物學(xué)特性來進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計。生物化工反應(yīng)單元操作——生物物質(zhì)分離純化蛋白特性與工藝設(shè)計的關(guān)系等電點(diǎn)決定離子交換的種類及條件?？梢岳玫鞍踪|(zhì)離子交換層析分離等電點(diǎn)相同但表面電荷分布不同的兩個蛋白質(zhì)。對于等電點(diǎn)處于極端位置（pI＜5或pI＞8）的基因工程產(chǎn)物應(yīng)首選離子交換層析，往往一步即可去除幾乎所有的雜質(zhì)。相對分子質(zhì)量選擇不同孔徑及分級分離范圍的介質(zhì)。凝膠排阻層析就是根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)分子的動力學(xué)體積的大小進(jìn)行分離。疏水性決定與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度。利用蛋白質(zhì)的疏水性的差異來分離純化的層析方法主要有疏水層析和反相層析。特殊反應(yīng)性決定產(chǎn)物的氧化、還原及部分催化性能的抑制。聚合性決定是否需要采用預(yù)防聚合、解聚及分離去除聚合體。生物特異性決定親和配基的選擇。蛋白質(zhì)的生物特異性可以幫助選擇特異性的親和配基，親和分離由于其選擇性強(qiáng)，在產(chǎn)物純化中具有較大的潛力，但應(yīng)注意選擇親和力適中而特異性較強(qiáng)的配基。溶解性決定分離體系及蛋白濃度。穩(wěn)定性決定工藝采用的溫度及流程操作時間等。蛋白特性及與工藝設(shè)計的關(guān)系