電鏡細胞化學技術

關于電鏡細胞化學技術電鏡細胞化學技術

從光鏡組織化學的基礎上發(fā)展起來，任務是研究細胞內(nèi)各種成分在超微結構水平上分布情況以及這些化學成分在細胞活動過程中的動態(tài)變化。酶的細胞化學，免疫細胞化學，放射自顯影以及各種細胞組成的生化分析等都屬于電鏡細胞化學的范圍。第2頁,共56頁，2024年2月25日，星期天酶細胞化學的發(fā)展情況酶細胞化學是從50年代末開始發(fā)展。酶在生命活動中占有極其重要的地位，離開了酶，一切生命活動所需的物質(zhì)代謝將成為不可能。目前已知有2000多種酶。

LM組織化學方法----顯示出酶100多種

EM細胞化學-----顯示出酶80多種南醫(yī)大電鏡室----EM----顯示出酶30多種第3頁,共56頁，2024年2月25日，星期天酶細胞化學的意義酶的細胞化學定位對研究細胞的生理功能和病理過程有重要意義；很多酶可以作為細胞膜和各種細胞器的標志酶，而且有些細胞還有其特有的標志酶，這就為研究細胞器的結構與功能，細胞器的相互關系以及細胞的鑒別提供了一種新的武器。第4頁,共56頁，2024年2月25日，星期天細胞器標志酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶高爾基體TPP（硫胺素焦磷酸酶），NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶）GERL和溶酶體ACP酶（酸性磷酸酶）線粒體細胞色素氧化酶，琥珀酸脫氫酶微粒體過氧化氫酶（H2O2酶）細胞膜（膜性結構）核糖核苷酸酶（如ATP酶），堿性磷酸酶細胞器和它們的標志酶第5頁,共56頁，2024年2月25日，星期天酶細胞化學的基本原理

在生物化學中，按照催化反應的性質(zhì)將酶分成水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)換酶、裂合酶、合成酶和異構酶六大類。但在細胞化學上可以檢出的酶多數(shù)屬水解酶和氧化還原酶兩大類。第6頁,共56頁，2024年2月25日，星期天一、水解酶底物酶＋條件初級反應產(chǎn)物捕捉劑最終反應產(chǎn)物捕捉劑通常是重金屬（如鉛、鋇、銅等）一般來說，這些最終產(chǎn)物在細胞內(nèi)的位置代表酶促反應的位置，也就是酶的定位。以酸性磷酸酶為例：?－甘油磷酸鈉酸性磷酸酶PH5.0ROH＋H3PO4Pb2+Pb3(PO4)2第7頁,共56頁，2024年2月25日，星期天二、氧化還原酶包括氧化酶和脫氫酶，在氧化還原酶細胞化學方法中，包含著兩個既分開又緊密聯(lián)系的底物，在細胞化學中一個底物被還原，另一個被氧化。兩個底物中，有一個是酶的理想底物，另一個是專門選擇的在氧化還原時會起重要化學變化的某種物質(zhì)，后一種底物有很多方面可看作是捕捉劑的等效物，稱捕捉底物。第8頁,共56頁，2024年2月25日，星期天氧化酶H2O2H2O氧化酶DABDAB氧化聚合物OsO4（鋨酸）鋨黑（高電子密度）第9頁,共56頁，2024年2月25日，星期天脫氫酶琥珀酸鹽延胡索酸鹽琥珀酸脫氫酶高鐵氰化物[Fe(CN)63ˉ]亞鐵氰化物[Fe(CN)64ˉ]Cu2+亞鐵氰化銅以琥珀酸脫氫酶為例注：Cu2+存在在檸檬酸鈉或酒石酸鉀鈉條件下第10頁,共56頁，2024年2月25日，星期天常用的酶細胞化學試驗步驟

一、取材與固定

實驗動物組織最好用灌注固定，人體活檢標本以浸泡固定為主。用2％戊二醛固定液經(jīng)血管灌注固定動物組織5分鐘左右，然后取下所需的組織，切成寬1mm，長5－10mm長方形組織塊，在同樣的固定液中繼續(xù)固定，固定時間隨組織大小、種類而定。各種酶對固定液敏感度和耐受性也不同，必須根據(jù)具體情況選擇固定液的溫度、濃度、時間和PH。第11頁,共56頁，2024年2月25日，星期天常用固定劑對超微結構和酶活性保存情況保存情況保存情況超微結構的情況酶活性超微結構的情況酶活性乙醛差好羥基乙二醛好好丙烯醛好—優(yōu)秀差乙-甲基丙烯醛好好巴豆醛尚可好丙酮醛差差甲醛尚可優(yōu)秀琥珀醛尚可好戊二醛優(yōu)秀好丙醛尚可好乙二醛尚可，好好第12頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

二、漂洗組織

用0.1M二甲胂酸鈉緩沖液（PH7.4）在4℃下漂洗組織，洗去戊二醛固定液，漂洗時間最少2小時以上，可以過夜。二甲胂酸鈉緩沖液是最理想的漂洗液，因為它不干擾任何酶的細胞化學反應。第13頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

三、切組織片

將長條組織塊埋在7％瓊脂中，用組織切片機切成25μm－75μm的組織片，將切下的組織片浸泡在4℃的0.1M二甲胂酸鈉緩沖液中；或?qū)⒔M織塊用冰凍切片機切成所需厚度的組織片，但需防止冰晶的產(chǎn)生。也可用振蕩切片機切成45μm左右的組織片。當被檢查的材料被充分固定時，用冰凍切片機制作切片能較好的保持微細結構。當材料不能充分固定或不能被固定時，由于冷凍溶解能引起組織結構的損傷，所以用組織切片機或振蕩切片機。對一些有方向性的組織，在切薄片前必須注意樣品的定向，事先確定所需要細胞的位置。第14頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

四、置換緩沖液

將組織片放入配制孵育液用的緩沖液中，換液2－3次，每次5－10分鐘，使組織內(nèi)部建立細胞化學反應所需的PH條件，緩沖液溫度須保持4℃左右。有些細胞化學反應中有預孵育步驟，即將組織片浸在沒有底物的孵育液里20分鐘左右，在酶與底物相遇之前使組織內(nèi)部建立起所需的PH以及足夠的捕捉劑的濃度。第15頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

五、孵育

將組織片放在新鮮配制的孵育液中，在室溫或37℃水浴箱中孵育30分鐘至2小時，孵育過程中不斷振蕩孵育液，使其容易擴散到組織內(nèi)。孵育液要求現(xiàn)配現(xiàn)用，成分一般不能有大的變動，底物和捕捉劑的濃度、緩沖液的緩沖能力等必須保持在很窄的限度內(nèi)；在一些孵育液的配方中，某些成分已接近溶解度的極限，因此在混合各種成分時必須特別小心。各種酶有其相應的孵育時間、溫度、PH，必須嚴格遵守。第16頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

六、漂洗組織

首先用配制孵育液的緩沖液清洗組織，以去除孵育液中過剩試劑，一般換洗2－3次，每次5分鐘，然后用0.1M二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，所用緩沖液保持在4℃左右。第17頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

七、后固定

用1％鋨酸固定液對組織作后固定，由于組織較薄，在4℃下固定時間一般不超過1小時。為了更好的顯示細胞的各種膜結構，可以用亞鐵氰化鉀還原的鋨酸作后固定。

第18頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

八、脫水包埋按超薄切片技術中的常規(guī)方法進行脫水和環(huán)氧樹脂包埋，但脫水時間縮短一半，且不用醋酸雙氧鈾作塊染。對超薄切片染色要慎重，因為電子染色可能會模糊細胞化學反應的細節(jié)，染色液也可能會模糊細胞化學反應的細節(jié)，染色液也可能與細胞化學反應產(chǎn)物起作用。因此，首先必須觀察未經(jīng)染色的切片，只有確證染色對細胞化學反應產(chǎn)物沒干擾的情況下才能做常規(guī)超薄切片染色。第19頁,共56頁，2024年2月25日，星期天應用第20頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共56頁，2024年2月25日，星期天免疫電子顯微技術第25頁,共56頁，2024年2月25日，星期天電鏡免疫細胞化學技術

電鏡免疫細胞化學技術是在細胞超微結構水平上研究抗原抗體反應的部位并研究其動態(tài)變化。

1959年，Singer首先提出用電子密度較高的鐵蛋白(Ferritin)標記抗體的方法，使在細胞超顯微水平上研究抗原抗體反應成為可能。在此基礎上，相繼發(fā)展了雜交抗體技術、鐵蛋白抗鐵蛋白復合物技術、免疫酶技術及膠體金標記技術等。第26頁,共56頁，2024年2月25日，星期天對標記物的要求標記物必須是電子密度高的物質(zhì)，在電鏡下可識別標記物與抗體或與抗原反應必須不改變抗體或抗原的活性標記物在電子的轟擊下不改變形狀常用的標記物有鐵蛋白、辣根過氧化物酶（HRP）、膠體金等第27頁,共56頁，2024年2月25日，星期天基本操作組織固定與取材：固定要求保存良好的細胞超微結構和保持組織的抗原性，取材要求迅速、精細。固定液：過碘酸－賴氨酸－多聚甲醛液（PLP液），多聚甲醛－戊二醛混合液，4%多聚甲醛液免疫染色：包埋前染色、包埋后染色、超薄冰凍切片染色包埋：樹脂包埋、低溫包埋第28頁,共56頁，2024年2月25日，星期天包埋前染色即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應陽性部位取出，修整成小塊，按常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定、脫水、包埋。包埋前染色的組織以中層較為理想；表層因受機械修整，結構往往保存不好；深層因抗體不能透入，免疫反應弱或無。在做超薄切片前應先做半薄切片，找出免疫反應陽性部位。第29頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

優(yōu)點：

1.標本染色前不經(jīng)過鋨酸固定、脫水、包埋等過程，抗原未被破壞，易于獲得良好的免疫反應。

2.可在免疫反應陽性部位定位做超薄切片，提高電鏡下的檢出率。

3.適于含抗原量較少的組織。

缺點：

由于經(jīng)過一系列的免疫染色步驟，常出現(xiàn)一定的超微結構的損傷。第30頁,共56頁，2024年2月25日，星期天包埋后染色

組織標本經(jīng)固定、脫水及樹脂包埋，制成超薄切片后，再進行免疫組化染色。

注意點：

1、OsO4可使抗原活性明顯降低。

2、銅網(wǎng)易與化學物質(zhì)產(chǎn)生反應，故需選鎳網(wǎng)或金網(wǎng)。

3、在免疫組化處理的全過程中，應注意保持網(wǎng)面濕潤，以免影響抗原活性。第31頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

優(yōu)點：

超微結構保存較好，方法簡便，陽性結果有高度的可重復性，同一張切片上可進行多重免疫染色。缺點：

抗原活性在電鏡生物樣品處理過程中可能減弱甚至喪失；包埋在環(huán)氧樹脂中的組織不易進行免疫反應等。第32頁,共56頁，2024年2月25日，星期天超薄冰凍切片染色將組織置于2.3mol/l蔗糖液中，投入液氮中速凍，在冰凍超薄切片機上切片。優(yōu)點：樣品抗原性保存較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點。缺點：需配備冰凍超薄切片機，且技術難度較大。第33頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

不論哪一種免疫電鏡技術都面臨微細結構的保存和組織中抗原活性的保存這一對矛盾。如戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細結構的保存，但抗原活性有影響；而H2O2能增加樹脂穿透性，但對微細結構有損傷，能使反應部位產(chǎn)生孔洞。在生物樣品的處理過程中，應同時注意到這兩方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作應注意徹底，否則非特異性產(chǎn)物和其他污染物會影響特異性反應物的顯示和觀察。第34頁,共56頁，2024年2月25日，星期天免疫電鏡膠體金標記法第35頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

金標法是Faulk和Taylor在1971年提出的，并首先用于免疫電鏡。金標法是利用膠體金在堿性環(huán)境中帶有負電荷的性質(zhì)，使其與抗體相吸附，從而將抗體標記。

LM:金標記的抗體與抗原反應時，呈鮮艷的櫻紅色

EM:金顆粒具有很高的電子密度，清晰可見第36頁,共56頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點標記抗體不復雜，對微細結構損傷小。金顆粒電子密度高，在TEM下清晰可見。利用不同直徑的金顆粒標記不同的抗體，是研究突出小泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)共存的有力工具。由抗原抗體反應部位結合金顆粒數(shù)量的多少可以進行粗略的免疫細胞化學定量分析?？梢詫ε囵B(yǎng)細胞內(nèi)抗原進行標記定位。金具有強烈的激發(fā)電子能力----可以用于TEM和SEM的觀察。金標液無毒性，對人體無害。膠體金被科技工作者認為是當前最理想的標記物之一。第37頁,共56頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

應用于電鏡水平的免疫金染色法，可分為包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色對細胞膜的穿透性差，一般只用于細胞表面的抗原標記；細胞內(nèi)部的抗原標記普遍采用包埋后染色。第38頁,共56頁，2024年2月25日，星期天包埋后染色1.超薄切片厚50~70nm左右，載于200~300網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上。

2.置1%H2O2內(nèi)10min至1h，增進樹脂穿透性，有利于抗體進入。滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。

3.雙蒸水洗3次，每次10min，第一、二次洗法如步驟2，浮于液滴上，第三次以盛有雙蒸水的加樣器沿鎳網(wǎng)面沖洗，水流應有適當壓力，但不易過強，用濾紙在網(wǎng)緣將水吸干。

4.浮于正常羊血清（1:50~1:100）滴上，室溫30~60min，以飽和固定劑中的游離醛基占據(jù)非特異性結合部位，以阻斷非特異性吸附。

5.PBS漂洗3min，3次。第39頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6.濾紙吸干，孵育于第一抗體血清上，先室溫預孵1h，再置于4℃冰箱24~36h。（從冰箱取出后需室溫放置1h）

7.PBS漂洗3min，3次。

8.PBS（內(nèi)含1%的牛血清白蛋白，PH8.2）中5min，此步為膠體金結合做準備。

9.膠體金標記抗體液1:30~1:100，淡紅色為適宜稀釋液，室溫孵育1h。

10.雙蒸水洗3min，3次。如作雙重染色，則應將鎳網(wǎng)翻過來，用另一類抗體血清，重復上述步驟2~10。

11.枸櫞酸鉛染色5min，然后雙蒸水洗。

12.飽和醋酸鈾染色5min，雙蒸水洗凈。

13.電鏡觀察。第40頁,共56頁，2024年2月25日，星期天應用第41頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共56頁，2024年2月25日，星期天組織內(nèi)雌激素受體的CG-HRP-E2標記技術第44頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

雌激素受體(ER)除存在于性器官外，幾乎在全身器官或多或少的存在。對相應的組織進行ER的定性、定量檢查，對研究疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療都有重要意義。有生化法、組化法、組化免疫法及新近發(fā)展起來的單克隆抗體，已有學者對這些方法進行評價。近來有的作者用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)雌二醇(E2)檢測乳腺癌水平，并廣泛地得到應用。上述方法均缺乏精確的定性和定量研究南醫(yī)大電鏡室首次將膠體金(CG)與HRP偶聯(lián)E2結合作為配體形成了CG-HRP-E2，使ER在電鏡下顯示，可在細胞超微結構水平進行定位和定量分析。第45頁,共56頁，2024年2月25日，星期天結果HRP-E2在LM下顯示CG-HRP-E2在EM下顯示相應的靶細胞核內(nèi)和胞漿內(nèi)有不同程度的膠體金顆粒分布附表：細胞漿與細胞核內(nèi)的ER平均密度(顆粒數(shù)/0.12nm2)種類例數(shù)胞漿內(nèi)胞核內(nèi)增生期間腺細胞102.15±1.802.96±2.233.26±2.54增生期間質(zhì)細胞101.50±1.22腺癌細胞61.34±1.813.22±1.28第46頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第47頁,共56頁，2024年2月25日，星期天討論CG穩(wěn)定，迅速吸附蛋白質(zhì)而不改變生物活性E2對靶細胞內(nèi)ER有高度親和力與專一性HRP和CG都是標記物創(chuàng)新之處在于把CG與HRP-E2（有售）相結合，形成CG-HRP-E2標記物，能很好標記靶細胞內(nèi)的胞漿和胞核受體HRP-E2與CG-HRP-E2結果完全吻合在超微結構水平上進行精確的定性和定量方法可靠，試劑來源易，價格低廉本科研（國家自然科學基金資助—免疫電鏡細胞化學部分）結果證明靶細胞中，核內(nèi)ER明顯多于漿內(nèi)ER，為30年來關于核受體或漿受體的爭論提供了一個有力的科學檢測手段第48頁,共56頁，2024年2月25日，星期天細胞形態(tài)立體計量學第49頁,共56頁，2024年2月25日，星期天細胞形態(tài)立體計量學的意義是對細胞及其結構成分的形態(tài)進行定量分析的一種方法，也就是用立體學的方法來分析細胞形態(tài)結構（膜結構、顆粒結構、纖維結構）從二維圖像推導三維空間結構，要用到幾何概率論等一些數(shù)學方法，這一套方法稱為立體學（Stereology）。將立體學的方法用在細胞形態(tài)的分析上，就是形態(tài)計量學（CellMorphometry）第50頁,共56頁，2024年2