甲胎蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

關(guān)于甲胎蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)方法及原理技術(shù)路線結(jié)果分析應(yīng)用第2頁,共19頁，2024年2月25日，星期天通過提取肝癌病人的癌細(xì)胞組織和癌旁組織，根據(jù)mRNA豐度的測(cè)定方法，從轉(zhuǎn)錄水平對(duì)AFP（甲胎蛋白）基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)肝癌病人術(shù)中切取少量新鮮的肝癌組織及癌旁1cm的肝組織，迅速至-80℃凍存。取材目的第3頁,共19頁，2024年2月25日，星期天通過細(xì)胞RNA的提取技術(shù)，將定量的組織中的RNA提取出來，然后使用Northernblot技術(shù)，通過瓊脂糖凝膠電泳、原位轉(zhuǎn)移、放射自顯影，測(cè)定AFPmRNA的豐度。Northernblot:（諾瑟雜交）是一種通過檢測(cè)RNA的表達(dá)水平來檢測(cè)基因表達(dá)的方法。首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過與特定基因互補(bǔ)配對(duì)的探針雜交來檢測(cè)目的片段原理第4頁,共19頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞RNA的提取RNA的分離純化4.RNA轉(zhuǎn)移和固定瓊脂糖凝膠電泳分離RNA探針分子雜交放射自顯影第5頁,共19頁，2024年2月25日，星期天

TRIzol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。TRIzol法第6頁,共19頁，2024年2月25日，星期天勻漿處理:將組織在液氮中磨碎,100mg組織中加入1mlTRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。室溫（15-30℃）放置5分鐘。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。2-8℃10000×g離心15分鐘。第7頁,共19頁，2024年2月25日，星期天把水相轉(zhuǎn)移到新管中。用0.5ml異丙醇沉淀水相中的RNA。室溫放置10分鐘。6.2-8℃10000×g離心10分鐘，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，收集沉淀。7.用70℅乙醇洗滌RNA沉淀。至少加1ml70℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。8.得到RNA。第8頁,共19頁，2024年2月25日，星期天RNA樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶（如逆轉(zhuǎn)錄酶）有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。純化要求第9頁,共19頁，2024年2月25日，星期天1、凝膠準(zhǔn)備：用0.5×TBE配制2％瓊脂糖凝膠。①稱2g瓊脂糖置三角瓶中，加100ml0.5×TBE；②微波爐加熱大約1分鐘，熔化瓊脂糖；③熔化的瓊脂糖自然冷卻到60～70℃時(shí)，加入EB0.5μg/ml，并輕輕混勻。2、膠床準(zhǔn)備：①取出洗凈并曬干的膠床和梳子，在膠床未封閉的兩端貼上膠布或膠帶紙，形成約5～8mm的擋墻。②將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有1mm的間隙。③將膠床放在調(diào)整好的水平臺(tái)上。第10頁,共19頁，2024年2月25日，星期天鋪膠：將冷卻致60℃的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度3～5mm。室溫下靜置1小時(shí)左右，凝膠固化。撕去膠床兩端的膠帶紙，將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場(chǎng)負(fù)極。向電泳槽中加入0.5×TBE電泳緩沖液，以越過凝膠表面1～2mm為宜。輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。原梳齒處(樣品孔)即被緩沖液充滿，如發(fā)現(xiàn)有氣泡，應(yīng)設(shè)法去除。樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻。第11頁,共19頁，2024年2月25日，星期天上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中。加樣量一般10～30μl。蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳。開始電泳前，再次確認(rèn)凝膠樣品孔處于電場(chǎng)的負(fù)極。電泳條件：電壓1～5v/cm；時(shí)間1小時(shí)左右。電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。電泳結(jié)果分析紫外燈下觀察RNA。測(cè)量從加樣孔到各條帶的距離。一RNA片段大小的對(duì)數(shù)值對(duì)遷移的距離作用，用得到的曲線課計(jì)算點(diǎn)雜交檢測(cè)到的RNA大小第12頁,共19頁，2024年2月25日，星期天Northern印跡又稱RNA印漬術(shù)，是將存在于凝膠中的RNA分子轉(zhuǎn)移（印漬）于固定化介質(zhì)(如：硝基纖維素膜)上并加以檢測(cè)分析的技術(shù)，可以用合成的寡核苷酸片段作為探針，也可以用克隆或提取的DNA片段作為探針進(jìn)行標(biāo)記，特點(diǎn)專一性好，假陽性率低，用于RNA水平分析等。第13頁,共19頁，2024年2月25日，星期天取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。室溫下將膠浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。室溫下將膠浸到0.1mmol/LTrisHCl(pH7.5)中45min,使膠中和。20×SSC洗膠1h。20×SSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。第14頁,共19頁，2024年2月25日，星期天基因探針，即核酸探針，是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記，且順序已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列(DNA或RNA)。（將一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或熒光染料等標(biāo)記后制成的探針）根據(jù)美國(guó)PE公司提供的引物探針設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)的MGB探針序列如下：5’（FAM）－TACTGCAGAGATAAGTTT－3’（TAMRA）探針是由上?；瞪锕こ坦竞铣??！獊碜跃W(wǎng)絡(luò)資料參考第15頁,共19頁，2024年2月25日，星期天放射自顯影：是一種利用放射性核素發(fā)射的核射線，使乳膠中的鹵化銀感光形成潛影，經(jīng)顯影和定影，形成圖像。借助感光銀顆粒所在部位和強(qiáng)度，能準(zhǔn)確判斷放射性示蹤劑的分布部位和數(shù)量。第16頁,