中藥制劑分析課件

緒論

中藥制劑分析----以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，運(yùn)用現(xiàn)代分析理論和方法研究中藥制劑質(zhì)量的一門應(yīng)用學(xué)科。第一節(jié)概述一、中藥制劑分析的任務(wù)

物理

原藥材

鑒別運(yùn)用化學(xué)方法和手段中間體

檢查

生物學(xué)

制劑

含量測定

微生物學(xué)

全面控制中藥制劑的質(zhì)量中藥制劑分析的對象

制劑組方中起主要作用的有效成分、毒性成分、或其他影響療效、質(zhì)量的化學(xué)成分，對其做出定性鑒別、檢查、定量等各方面的評價(jià)。

一）中藥制劑分析的對象是復(fù)雜的混合物

1.中藥制劑的原藥材具有復(fù)雜性

①原藥材的品種、規(guī)格、產(chǎn)地、藥用部位、采收季節(jié)、加工方法等的影響。如：同名異物，同科不同種

②炮制方法的影響如：延胡索醋制；白術(shù)麩炒；草烏蒸制

二、中藥制劑分析的特點(diǎn)

2.中藥制劑化學(xué)成分的多樣性、復(fù)雜性

1）由多味中藥組成的復(fù)方制劑，化學(xué)成分極為復(fù)雜2)各種化學(xué)成分在中藥中的含量相差懸殊。3）中藥制劑由多種藥材組成，所含化學(xué)成分相互作用如：黃連、黃柏與黃芩、甘草、金銀花配伍3.制劑工藝及輔料的特殊性①制劑工藝各異---很多在單味中藥鮮品中存在的化學(xué)成分，經(jīng)過炮制或制備工藝中經(jīng)加熱處理后已不復(fù)存在，或在制備過程中因揮發(fā)、分解、成鹽(沉淀)反應(yīng)等增加了中藥分析的困難。②中藥制劑的劑型繁多，所用輔料多種多樣，輔料的存在對分析有一定影響。故測定前樣品必須經(jīng)過預(yù)處理，排除各種輔料的干擾，必要時(shí)還須進(jìn)行輔料的檢查和測定。二）以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)評價(jià)中藥制劑質(zhì)量1。首先以中醫(yī)藥理論和用藥原則為指導(dǎo)，進(jìn)行組方分析，按功能主治分出君、臣、佐、使藥味，找出主藥。

2。選擇合適的化學(xué)成分為檢測指標(biāo)，分析和評價(jià)中藥制劑的質(zhì)量三）中藥制劑有效成分的非單一性全面、整體控制中藥制劑的質(zhì)量多指標(biāo)、多成分的含量測定體系中藥指紋圖譜

三、影響中藥制劑質(zhì)量的因素(一)原料藥材的品種、規(guī)格、產(chǎn)地、藥用部位、采收季節(jié)、加工方法的影響

(二)炮制方法的影響

（三）制劑生產(chǎn)工藝的影響

(四)中藥制劑的包裝、貯藏、保管的影響

四.中藥制劑質(zhì)量控制的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢

一）國外藥物分析發(fā)展趨勢

基本的方法主要為：分離分析法、電化學(xué)法、光譜法和聯(lián)用分析方法等。

各種色譜及其聯(lián)用技術(shù)已成為占主導(dǎo)地位的常規(guī)分析方法，如HPLC、GC、HPTLC、HPCE、LC-MS聯(lián)用等。

體內(nèi)藥物分析研究，趨向于采用在線的聯(lián)用微透析分析技術(shù)，如on-lineMD-CE、on-lineMD—LC等.

手性藥物作為化學(xué)藥物的特殊群體，以HPLC和CE為主要拆分手段的手性藥物分析方興未艾，已成為全世界藥物分析的研究熱點(diǎn)。二）國內(nèi)中藥制劑分析現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢1、國內(nèi)中藥制劑分析現(xiàn)狀1）光譜法的應(yīng)用A比色法如丹參素/丹參注射液阿魏酸/當(dāng)歸浸膏--定量

B紫外-可見分光光度法單波長法如蒽醌/何首烏，香豆素/祖師栗膏--定量雙波長法靛藍(lán)、靛玉紅/喉痛消炎丸--定量三波長法小檗堿/三黃片--定量一階導(dǎo)數(shù)光譜法綠原酸/感冒咳嗽沖劑麻黃堿/哮喘丸--定量二階導(dǎo)數(shù)光譜法膽酸/清宮沖劑血竭/七厘散--定量三階導(dǎo)數(shù)光譜法氫溴酸東莨菪堿/中麻2號注射液-定量

C熒光法丹參素/丹參注射液

D紅外分光光度法

-體、-體/山道年；番木鱉堿、馬錢子堿/馬錢子

E質(zhì)譜法

F核磁共振光譜法

2）色譜法的應(yīng)用A紙色譜法已較少應(yīng)用

B薄層色譜法應(yīng)用廣泛

C棒狀薄層色譜法小檗堿/復(fù)方黃柏制劑人參皂甙/人參------定量膽酸和去氧膽酸/熊膽D氣相色譜法揮發(fā)性成分定量冰片/復(fù)方丹參片/牛黃解毒丸/冠心蘇合丸等厚樸酚、和厚樸酚/藿香正氣水麻黃堿/葛根湯E高效液相色譜法應(yīng)用廣泛，以反相HPLC為主黃連素/半夏瀉心湯紅景天甙/紅景天口服液;

甘草酸/千金升白沖劑3）電化學(xué)分析法的應(yīng)用

A庫侖法

B電位法藥物電極測定法和電位溶出分析法

4）其他

A原子吸收光譜法和冷原子技術(shù)

B原子發(fā)射光譜

CX射線分析法

中藥體系存在的突出問題具體表現(xiàn)在：(1)定量分析指標(biāo)與其主要藥效作用間缺乏相關(guān)性；(2)與化學(xué)藥物相比，中藥是一個(gè)由多成分、多因素構(gòu)成的復(fù)雜體系，目前還沒有建立起一套有效的中藥復(fù)雜體系定量分析標(biāo)準(zhǔn)。

2。國內(nèi)中藥制劑分析發(fā)展趨勢

(1)中藥有效成分的篩選與確定

應(yīng)用仿生學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科的理論和進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)，從分子、基因、受體、組織和整體水平系統(tǒng)準(zhǔn)確地確定中藥復(fù)雜體系中的藥效物質(zhì).

(2)中藥有效成分的提取與分析

中藥化學(xué)成分非常復(fù)雜，而且有效成分也具有相對性。為了高效率地提取中藥有效成分，應(yīng)用各種現(xiàn)代提取技術(shù)，如SFE、SWE、UAE等，可用于中藥復(fù)雜體系中有效成分的提取，利用準(zhǔn)確的儀器分析方法和計(jì)算機(jī)技術(shù)，通過因子分析方法對中藥復(fù)雜體系進(jìn)行定性定量評價(jià)；(3)中藥藥效物質(zhì)與中醫(yī)藥理論相關(guān)性研究

利用現(xiàn)代分析方法研究中藥復(fù)雜體系中藥效物質(zhì)與中醫(yī)藥理論的定量關(guān)系，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，闡明其作用機(jī)制，在此基礎(chǔ)上對中藥及其復(fù)方進(jìn)行全面質(zhì)量控制。

中藥制劑分析程序一般可分取樣、制備供試品、測定（包括定性鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測定）和書寫檢驗(yàn)報(bào)告。第二節(jié)

中藥制劑分析工作的基本程序一、取樣1．科學(xué)性、真實(shí)性和代表性：取樣原則是均勻、合理2．嚴(yán)格按規(guī)定的取樣方法進(jìn)行取樣。一般應(yīng)從每個(gè)包裝的四角和中央五處取樣，深度可達(dá)1/3

2/3處。取得的樣品裝入清潔、干燥、具磨口塞的容器或密封的塑料袋中，并注明品名、批號、數(shù)量、取樣日期及取樣人。3．抽取供試品的數(shù)量：各類中藥制劑取樣大致是至少夠3次檢驗(yàn)的用量。貴重藥品可酌情取樣。

取樣方法1.固體樣品取樣方法：1）抽取樣品法：2)圓錐四分法：適于樣品量不大的粉末狀、小塊狀及小顆粒狀樣品的取樣2.液體樣品取樣方法分層取樣取樣量粉狀制劑（散劑、顆粒劑）一般取樣100g，可從包裝的上、中、下三層及周圍間隔相等部位取樣若干，將所得樣品混勻，按〝四分法〞從中取出所需供試量液體制劑（口服液、藥酒、糖漿、酊劑等）一般取樣200ml。同時(shí)須注意均勻取樣。固體中成藥（丸劑、片劑）成品取樣一般為100g，壓片后取樣200片。丸劑一般取10丸。

膠囊劑稱取不少于20個(gè)膠囊，傾出其中的藥料，稱定空膠囊的重量，由總重中減去，即為膠囊內(nèi)藥料的重量。依標(biāo)示量及供試量稱取部分藥料供分析。一般取樣量為100g。

注射液的取樣，灌注、熔封，滅菌前后應(yīng)經(jīng)過兩次分析。灌封前將注射液混合均勻，如液體取樣原則取樣，再按標(biāo)示量及供試量分別取部分進(jìn)行檢驗(yàn)；經(jīng)滅菌后的注射液須按原來的方法進(jìn)行分析檢驗(yàn)。已封好的安瓿，取樣量一般為200支。

其它劑型的中成藥，可根據(jù)具體情況隨意抽取一定數(shù)量，作為隨機(jī)抽樣。

供試樣品檢驗(yàn)完畢，應(yīng)保留一半數(shù)量作為留樣觀察。供試品制備的原則：最大限度地保留被測成分，除去干擾成分，并使被測成分達(dá)到分析方法檢測限所需濃度中藥制劑供試品溶液的制備一般分為提取、分離、凈化等過程。二、

供試品的制備（一）提取方法1.溶劑提取法

萃取法：適用于液體制劑

冷浸法:6~10~20倍藥重溶劑，稱重，浸泡12~24~48小時(shí)，稱重，等分取樣或取總樣測定。適宜遇熱不穩(wěn)定的有效成分；

回流提取法：不適于對熱不穩(wěn)定或具有揮發(fā)性的成分

連續(xù)回流法：樣品置索氏提取器中，利用溶劑反復(fù)提取，提取效率高，溶劑少，遇熱不穩(wěn)定的有效成分不宜用此法；超聲波提取法：樣品置容器中，溶劑提取，效率高，一般樣品30min內(nèi)即可完成。2.水蒸氣蒸餾法:適于揮發(fā)油、小分子物質(zhì)3.超臨界流體萃取法；脂溶性物質(zhì)4.升華法1.液-液萃取法:溶劑直接萃取、離子對萃取操作繁，易乳化。2.色譜法（液-固萃取法）:常用凈化劑有三氧化二鋁、氧化鎂、硅膠、活性炭、大孔樹脂、離子交換樹脂、硅藻土、鍵合相硅膠C18、C8等。

其中離子交換樹脂、硅藻土、鍵合相硅膠C18、C8等目前有較多商品預(yù)處理柱，使用方便，操作簡單，凈化效率高（二）凈化方法3.沉淀法：采用某些試劑沉淀雜質(zhì)或沉淀待測成分。4.蒸餾法：利用待測成分或其分解產(chǎn)物具有揮發(fā)性的特點(diǎn)，采用蒸餾法、收集餾液進(jìn)行含量測定，必須明確測定成分的結(jié)構(gòu)才可用此法。

三、定性鑒別

1.性狀鑒別中成藥的形狀、顏色、氣味等，凡藥典收載品，在藥典中均有規(guī)定，可按要求進(jìn)行檢查。

2.顯微鑒別含有中藥原粉的中成藥保留中藥材的顯微特征,可以通過這些特征，對中成藥進(jìn)行定性鑒別。

3.理化鑒別藥典中常用的方法有：熒光法、顯色法、沉淀法、微量升華法；紙色譜法、薄層色譜、液相色譜、氣相色譜等。中藥定性鑒別應(yīng)選擇其中主藥（君藥）、輔藥（臣藥）作為主要對象，其次應(yīng)鑒別毒劇藥及貴重藥材。

四．檢查中藥制劑需要檢查的項(xiàng)目大致可分為三類：1）污染型

中成藥一般雜質(zhì)檢查項(xiàng)目有：異物、灰分、酸不溶性灰分、重金屬、砷鹽等；衛(wèi)生學(xué)檢查：微生物細(xì)菌檢查；以及有的產(chǎn)品要求農(nóng)藥殘留量的檢測。2）特殊雜質(zhì)型

原料藥材摻假、有毒成分的限量檢查。3）劑型的要求檢查類型（制劑通則要求檢查項(xiàng)目）

中成藥一般質(zhì)量要求的檢查有：揮發(fā)油測定、水分測定（固體制劑）、乙醇含量測定、總固體、相對密度、pH值（酊劑、藥酒）、裝量差異（片重差異）、崩解度（片劑、膠囊劑）、熔點(diǎn)測定、旋光度測定等。

五．含量測定

中成藥含量測定所采用的方法除經(jīng)典的重量法、容量法(包括中和法、容量沉淀法、絡(luò)合滴定法、氧化還原法及非水溶液滴定法等)外，還可采用電位法、庫倫滴定法、比色法、可見-紫外分光光度法、紅外分光光度法、液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、雙波長薄層掃描法等。

1.有效成分明確的中藥制劑要進(jìn)行有效成分的含量測定。2.大致明確有效成分，要求測定這些成分的總量。3.對有效成分已知但無理想的測定方法的中藥制劑，可通過測定其中某些化學(xué)成分的含量間接控制有效成分的含量。4.對有效成分不明確的中藥制劑可采用以下方法：選擇可能的有效成分或主要成分（指示性成分）進(jìn)行含量測定；測定藥物的總固體量；選擇在原料加工炮制時(shí)或制備、貯存過程中易損失、破壞的成分進(jìn)行含量或限量測定。5.中藥制劑中含有劇毒性成分則要測定其含量。6.貴重藥材在制劑中投料量應(yīng)加以測定。六.原始記錄和檢驗(yàn)報(bào)告原始記錄檢驗(yàn)報(bào)告第二章中藥制劑定量分析方法

第一節(jié)可見-紫外光譜法

一、單一物質(zhì)的定量

定量依據(jù)是Beer-Lambert定律，A=

lC。測定單一物質(zhì)時(shí)，先測定物質(zhì)的吸收光譜，然后選擇最大吸收峰的波長

max進(jìn)行定量分析。一個(gè)物質(zhì)若有幾個(gè)吸收峰時(shí)，可選擇吸收峰較高，在此吸收峰處吸光度隨波長變化較小，并且其它物質(zhì)無吸收的波長作為定量條件。一般不選擇光譜最左邊的末端吸收峰作定量測定的波長。常用定量方法：

1.對照法C樣=C標(biāo)

A樣/A標(biāo)；C標(biāo)

A樣/（A標(biāo)

C

樣）=樣品%，C樣和C標(biāo)分別為樣品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品濃度，C

樣為樣品標(biāo)示濃度。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：從標(biāo)準(zhǔn)品吸光度-濃度曲線求得樣品濃度。

二、

混合物的含量測定

一）

混合物中有a，b兩種組分，若兩者的最大吸收峰不重合，且在a的

1max處，b無吸收；在b的

2max處，a無吸收?？煞謩e在

1max、

2max處用單一物質(zhì)的定量方法從混合物中測定a、b的濃度。二）

混合物中有a，b兩種組分，吸收光譜部分重疊，在a的

1處，b無吸收；在b的

2處，a有吸收。先在

2處測定總吸收Aa+b，再在

1處測定Aa

1；先從Aa

1直接求出a的濃度，根據(jù)a的濃度求出Aa

2。再從Aa+b減去Aa

2后求得Ab

2，就可求得b的濃度。

（三）雙波長測定法中藥制劑分析中常用的方法為等吸收波長法和系數(shù)率法。

1．等吸收波長法

1）基本原理根據(jù)左圖選出兩個(gè)波長

1與

2，其選擇原則是干擾組分a在

1與

2處吸收度相等，即

Aa

1=Aa

2。而待測組分b在

1與

2處的差吸收度

A應(yīng)比較大，再在

1與

2處測混合組分溶液的差吸度

A。設(shè)

1為參比波長，

2為測量波長，則等吸收波長法原理示意圖

A=Aa+b

2-Aa+b

1

=（Aa

2+Ab

2）-（Aa

1+Ab

1）

=Ab

2-Ab

1=（

b

2-

b

1）CbL

2）應(yīng)用舉例喉痛消炎丸中靛藍(lán)、靛玉紅的測定

?。┻x擇等吸收波長：用2～8

g/ml的靛藍(lán)及靛玉紅的氯仿溶液在分光光度計(jì)上掃描，并用同法掃描出空白樣品溶液的吸收曲線。從左圖可知靛藍(lán)在540nm、634.4nm處有合適的等吸收波長；靛玉紅卻是在514．2nm和

566nm處有等吸收波長，而空白樣品液在上述波長處的吸收曲線幾乎成一條直線、不干擾測圖2-1-3靛藍(lán)、靛玉紅的吸收曲線

(1)靛藍(lán)(2)靛玉紅(3)無青黛樣品定，選取靛藍(lán)的測定波長

s1＝566nm、參比波長

R1=514.2nm?？蛇x靛玉紅的測定波長

s2=540nm、參比波長

R2=634.4nm。

ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密吸取靛藍(lán)對照品溶液0.25、0.50、…、2.0ml；靛玉紅對照品溶液0.20、0.40、…、1.40ml，分別放入10ml量瓶中，用氯仿稀釋至刻度，分別在上述等吸收波長處測其差吸收度：

A1=A566nm-A514.2nm

；

A2=A540nm-A634.4nm；然后用

A對C作標(biāo)準(zhǔn)曲線；并求出其一元回歸方程：

A1＝0.02241·C1(r1＝1.0000)

A2＝0.04060·C2+0.0055(r2＝1.0000)

ⅲ)含量測定：精稱喉痛消炎丸細(xì)粉約0.2g于索氏提取器中，用氯仿提取至無藍(lán)色，用氯仿定容于50ml量瓶中，再精密吸取5ml置10ml量瓶中，加氯仿至刻度即為樣品溶液。將樣品溶液在

s1與

R1，處測出

A樣1值，用以上

A1式求出靛藍(lán)的濃度及樣品中靛藍(lán)的含量。同樣，在

s2與

R2處測出

A樣2，用以上

A2式求出靛玉紅的濃度及樣品中靛玉紅的含量。

2．聯(lián)立方程法Aa+b1=Aa

1+Ab

1=a

1CaL+b

1CbLAa+b2=Aa

2+Ab

2=a

2CaL+b

2CbL

（四）三波長測定法此法要求在任一吸收曲線上，能找出滿足下述條件的三個(gè)波長：即在干擾組分的吸收曲線上，與三個(gè)波長相應(yīng)的點(diǎn)，能在一條直線上。

1．基本原理左圖中

1、

2、

3為在任一吸收曲線上，任意選擇的三個(gè)波長。A1、A2、A3為在三個(gè)波長處分別測出的吸收度。根據(jù)相似三角形的等比性質(zhì)，可推導(dǎo)出下式，

ΔA=A2-（mA1+nA3）/（m+n）

={

2–（m

1+n

3）/（m+n）}CL

三波長分光光度法的原理說明ΔA與待測組分濃度C成正比。

2．應(yīng)用舉例二陳丸中陳皮甙的測定

1）總干擾組分的制備及其吸收光譜

ⅰ)除去陳皮甙后，陳皮其他組分提取液的制備：用溶劑(含0.1％氫氧化鈉的75％乙醇液)提取陳皮粉，提取液經(jīng)薄層分離，刮取除陳皮甙以外的所有斑點(diǎn)洗脫，得除陳皮甙以外陳皮其他組分提取液(I)。

ⅱ)二陳丸空白粉提取液的制備：按處方比例配制除陳皮以外的二陳丸空白粉，用上述溶劑提取，得二陳丸空白粉提取液(Ⅱ)。將(I)、(Ⅱ)按處方比例混合，得二陳丸總干擾成分液(Ⅲ)。分光光度計(jì)分別測定陳皮甙對照品和(Ⅲ)的吸收光譜。見左圖。其他成分對陳皮甙的測定有干擾，用6批不同來源的原料按上法制備(Ⅲ)，并測其吸收光譜，結(jié)果譜形相似。可采用三波長法消除干擾。

2）選擇三個(gè)測定波長作圖法粗選，再計(jì)算精選在(Ⅲ)的

A=0處，即為精選的三個(gè)波長：λ1=318.0nm，λ2=286.0nm，λ3=275.0nm。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制不同濃度的陳皮甙對照品溶液，在選出的三個(gè)波長處，分別測定吸收度，并算出ΔA值，對ΔA值與濃度C進(jìn)行直線回歸，回歸方程為：

ΔA=9.9059C–0.0024(r=0.9990)4）樣品測定精密稱取二陳丸細(xì)粉約0.1g，加100.0ml上述溶劑浸泡提取15小時(shí)，過濾，取續(xù)濾液2.0ml，用溶劑稀釋至5.0ml，在選出的三波長處，分別測定吸收度，計(jì)算其ΔA值，再按回歸方程算出陳皮甙含量。本法平均回收率：98.28％，RSD：2.12％。

（五）差示光譜法

1．基本原理差示光譜法的關(guān)鍵有二，其一，提供一個(gè)近似理想的參比溶液。其二，使待測組分發(fā)生特征光譜變化，而賦形劑或其他共有組分卻不引起光譜變化，因而可消除它們的干擾。

設(shè)Ax、Ay分別代表兩種不同介質(zhì)中待測組分在測定波長處的吸收度，Az代表背景和干擾組分的吸收度，其不受測定介質(zhì)改變的影響。根據(jù)吸收度加和性原理，則

ΔA=A樣-A參=(Ax+Az)-(Ay+Az)=Ax-Ay

=(εx-εy)CL

差示光譜中的振幅，即最大吸收與最小吸收之差值，也可進(jìn)行定量測定，這可提高本法的專屬性。

2．應(yīng)用舉例差示光譜法測定含牛黃的中成藥中膽紅素的含量

1）測定原理膽紅素具有高度共軛體系結(jié)構(gòu)，在波長453nm處為最大吸收，在可見光照射下膽紅素易氧化成藍(lán)色產(chǎn)物，在453nm處吸收度顯著降低。

2）選用日光下照射30分鐘或在紅外燈下照射4小時(shí)測ΔA值。

3）精密稱取膽紅素2mg于50ml棕色量瓶中，加入適量冷(10℃以下)的酸性氯仿(150ml氯仿中含0.05ml濃鹽酸)，于冰水浴中超聲振蕩20分鐘，稀釋至刻度，制成儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取0，4、0．8、1，2、1.6、2.0ml儲(chǔ)備液于10ml量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，測其光照前后在453nm處的吸收度?；貧w方程膽紅素在酸性氯仿溶液中的吸收光譜為ΔA=0.0804C+0.00570(r=0.9995)。

a．光照前b．光照后除光照反應(yīng)外，其余操作均需避光。

4）分別制得六應(yīng)丸、六神丸、牛黃消炎丸的空白樣品對照液，在453nm處測得各自光照前后的A值，計(jì)算ΔA。實(shí)驗(yàn)表明三種成藥ΔA值為零或幾乎為零。說明其他干擾組分在以上光照條件下不干擾膽紅素的測定。

5）精密稱取六應(yīng)丸、六神丸各60mg，牛黃消炎丸120mg置10ml帶塞的試管中，準(zhǔn)確加入冷酸性氯仿10ml，冰水浴中振蕩20分鐘，過濾，棄去初濾液，測續(xù)濾液光照前后的A值，算出ΔA值。由回歸方程算得樣品的含量。

本法加樣回收率：六應(yīng)丸為98.8％，RSD=1.8％；六神丸為100.7％，RSD=2.2％；牛黃消炎丸為93.0％，RSD＝1.1％。

（六）導(dǎo)數(shù)光譜法

1．導(dǎo)數(shù)光譜及其特征通常的吸收光譜，其吸收度是波長的函數(shù)

A=C·E=C·?（λ）。對波長求導(dǎo)，將其微分系數(shù)（dnA/dλn～λ）對波長掃描可得導(dǎo)數(shù)光譜圖。特征：

(1)導(dǎo)數(shù)光譜的階數(shù)愈高，峰形愈尖銳且數(shù)量亦增多。

(2)在零階光譜的極大處，其相應(yīng)的奇階光譜通過零點(diǎn)。在零階光譜的兩拐點(diǎn)處，奇階導(dǎo)數(shù)光譜為極大或極小。

(3)偶階導(dǎo)數(shù)光譜的形狀與零階光譜類似，零階光譜的峰值對應(yīng)于偶階導(dǎo)數(shù)光譜的極值，零階光譜的拐點(diǎn)在偶階導(dǎo)數(shù)光譜中通過零點(diǎn)。

(4)導(dǎo)數(shù)光譜譜帶的極值數(shù)等于導(dǎo)數(shù)階數(shù)加1。高斯曲線及其一至四階導(dǎo)數(shù)曲線

導(dǎo)數(shù)分光光度的優(yōu)點(diǎn)：a．能檢出兩個(gè)或兩個(gè)以上的重疊吸收帶；

b．能分辨在強(qiáng)吸收曲線“肩部”的弱吸收帶；

c．能精密確定單一吸收峰位置；

d．能消除基線（背景）的影響；

e．能進(jìn)行定量測定。

2．基本原理吸收光譜服從Beer定律：A＝ε·C·L

根據(jù)導(dǎo)數(shù)光譜的定義，對上式求導(dǎo)，則：

dA/dλ=（dε/dλ）·CL；d2A/dλ2=（d2ε/dλ2）·CL；

……dnA/dλn=（dnε/dλn）·CL；式中L為定值，給定物質(zhì)在特定波長處的dε/dλ、d2ε/dλ2……dnε/dλn也是定值，因此，dA/dλ∝C，d2A/dλ2∝C……dnA/dλn∝C。

常用的定量參數(shù)的選擇方法有：

1）峰-谷法測量相鄰峰、谷之間的距離。左圖中的h1·h2(振幅，用D表示)。

2）基線法取相鄰二同向峰(正或倒)的公切線為基線，以中間的反向峰峰尖至基線的距離為測量值。左圖中p1。

3）峰-零法測量峰值到零線間的垂直距離，左圖中p2。

4）面積法根據(jù)一階或二階導(dǎo)數(shù)光譜面導(dǎo)數(shù)光譜的測量積，

進(jìn)行定量測定。

3．共存組分干擾吸收的消除

1）一階導(dǎo)數(shù)光譜法消除線性干擾吸收

A=ελCL+aλ+bdA/dλ=（dε/dλ）CL+a

說明線性干擾在一階導(dǎo)數(shù)光譜中對定量參數(shù)D(振幅)沒有影響，D只與待測組分濃度成正比。

D=(dA/dλ)峰

-(dA/dλ)谷

=[(dε/dλ)

峰-(dε/dλ)

谷]CL

2）高階導(dǎo)數(shù)光譜法消除非線性干擾吸收及用于重疊峰的分離，定量

若干擾組分吸收對波長呈非線性，為一近似的二次吸收曲線，則總吸收度為

A=ελCL+eλ2+fλ+g

對其求一階、二階導(dǎo)數(shù)得：

dA/dλ=（dε/dλ）CL+eλ

+fd2A/dλ2=（d2ε/dλ2）CL+e

4.導(dǎo)數(shù)光譜法中的主要參數(shù)

1)微分階數(shù)(n)n的選擇主要由干擾組分吸收曲線的形狀而定。n越大，分辨力愈強(qiáng)，但信噪比將降低。

2)波長間隔(Δλ)Δλ愈大，測量靈敏度增大，但分辨率降低，通常Δλ選1~2nm為好。

3)中間波長(λm)通常需選兩個(gè)λm，即λm1、λm2

。其選擇原則：待測組分的導(dǎo)數(shù)曲線在λm1、λm2處的形狀易辨認(rèn)，較特征；而干擾組分在此處的導(dǎo)數(shù)值相等或相近。

5.應(yīng)用舉例

1)肺露中丹皮酚含量的測定

(ⅰ)干擾丹皮酚測定情況的考察：按處方配比，分別取藥材，加水適量，蒸餾提制成22味藥材的模擬液，以水為空白，分別繪制紫外吸收光譜圖。從圖中看出，牡丹皮蒸提液紫外吸收很強(qiáng)，枇杷葉和蘆根蒸提液紫外吸收較弱，干擾丹皮酚的測定，實(shí)驗(yàn)表明：丹皮酚在堿性溶液中的吸收光譜發(fā)生紅移，Δλ=35±2nm。

1．牡丹皮2．枇杷葉3．蘆根

(ⅱ)選擇測定波長精取丹皮酚對照液2ml，枇杷葉和蘆根蒸提液各10ml，分別于25ml量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液至刻度，混勻。以0.1mol/L氫氧化鈉溶液為空白，繪制吸收光譜（零階）和一階導(dǎo)數(shù)光譜，如下圖。按中間波長選擇原則，選330和370nm為中間波長，則測定波長為328nm和332nm，368nm和372nm。蒸提液在0.1mol／L氫氧化鈉溶液中的光譜圖一階導(dǎo)數(shù)光譜圖1．肺露2．丹皮酚3．枇杷葉4．蘆根1．丹皮酚2．枇杷葉3．蘆根

(ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)曲線精密量取丹皮酚對照液(0.1mg/ml)0.5、1.0、……3.0ml，分別于25ml量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液至刻度，混勻，以0.1mol/L氫氧化鈉溶液為空白，在測定波長處測吸收度，計(jì)算一系列ΔA值。ΔA=(A328-A332)-(A368-A372)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：

ΔA=-11.08C+0.0009（r=0.9997）

(ⅳ)樣品測定取同一批號或不同批號樣品，分別精密量取10ml于25ml量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液至刻度，混勻，以0.1mol/L氫氧化鈉溶液為空白，在測定波長處測其吸收度，算出ΔA，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算樣品中丹皮酚含量。本法平均回收率99.57％，RSD=0.82%。

2）清宮沖劑中膽酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜測定法

（?。└蓴_情況的考察膽酸對照液與樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜顯示，在397nm，386nm波長處有相應(yīng)的吸收峰和吸收谷。陰性樣品二階導(dǎo)數(shù)光譜呈近乎平直線條，見下左圖。豬去氧膽酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜將360～420nm區(qū)間的吸收消除為二次無關(guān)吸收，不干擾樣品中膽酸的含量測定如下中圖。下右圖表明，膽酸二階導(dǎo)數(shù)光譜，其峰-谷振幅值D與濃度具有良好的線性關(guān)系，因此，可用397nm，386nm兩波長的振幅D為定量參數(shù)，用峰-谷法進(jìn)行測定。

樣品，膽酸對照品溶膽酸、豬去氧膽酸二對照品溶液液二階導(dǎo)數(shù)光譜階導(dǎo)數(shù)光譜二階導(dǎo)數(shù)光譜A．樣品B.膽酸對照品C.陰性樣品1．膽酸2．豬去氧膽酸

(ⅱ)測定條件零階光譜掃描波長：190~550nm；二階導(dǎo)數(shù)光譜掃描波長，360～420nm；Δλ=5nm。

(ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱定膽酸對照品約30mg，置100ml量瓶中，加入60％醋酸稀釋至刻度，分別精密吸取0.1、0.2…1.0ml于15ml具塞刻度試管中，加60％醋酸至1.0ml，加入稀硫酸14．0ml，搖勻，70℃水浴中放置20分鐘，取出靜置20分鐘后，用1.0ml60％醋酸加14.0ml上述稀硫酸作空白，測二階導(dǎo)數(shù)光譜。中間波長397nm，386nm，測出各峰-谷振幅值D，得回歸方程：

D=57.3066C–0.1547(r=1．000)(ⅳ)樣品測定精密稱取約2.5g樣品粉末加50ml氯仿回流提取4小時(shí)，常壓回收氯仿至干，用60％醋酸溶解，定容于10ml量瓶中，精密吸取1.0ml樣品液于15ml具塞刻度試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，測峰-谷振幅值D，按回歸方程計(jì)算樣品中膽酸含量。

本法平均回收率：102.9％，RSD＝0.6％。第二節(jié) 薄層色譜法

薄層色譜法(TLC)是一種微量的分離分析技術(shù)，具有設(shè)備簡單，檢出靈敏，測定快速，應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)。薄層色譜定量的方法可分為二類，一類是薄層洗脫定量法，將被測化合物從薄層上洗脫下來，萃取后，再選擇適當(dāng)方法進(jìn)行測定。另一類是在展開后的薄層上直接進(jìn)行測定。

一、薄層洗脫定量

1．點(diǎn)樣在薄層板的起始線上，將定量的樣品液點(diǎn)成一條狀，點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)避免任何損失。在板的兩邊，點(diǎn)上對照品作為定位劑，如圖A，然后，在選好的溶劑中層開，斑點(diǎn)要集中，不應(yīng)有拖尾現(xiàn)象。

2．定位對本身有顏色的化合物可直接定位，對有熒光的化合物可在紫外光下觀察定位，對多數(shù)無色化合物不可在薄層上直接噴顯色劑定位，此時(shí)，應(yīng)將待測組分的薄層部分用玻璃板懸空蓋住后再噴，這樣可利用兩邊的對照點(diǎn)顯色定位。

3．捕集、洗脫和測定定位后，應(yīng)捕集洗脫，若為軟板，可將待測組分的帶狀區(qū)域用捕集器收集，如圖(B)。若為硬板，可直接用捕集器收集，也可用刀片將樣品區(qū)帶的吸附劑定量地刮下，再用合適溶劑洗脫后，進(jìn)行定量測定，如圖(C)。

洗脫溶劑，一般應(yīng)選極性較大，對待測化合物溶解度亦較大的溶劑，如乙醚、氯仿、丙酮、乙醇、甲醇等，在單一溶劑洗脫效果欠佳時(shí)，可采用混合溶劑。洗脫方法可采用滲濾法、多次浸出法、加熱溫浸法、索氏回流提取法等。對不易洗脫的化合物，也可不經(jīng)洗脫，在吸附劑中加入適當(dāng)?shù)娘@色劑，使其定量反應(yīng)，然后離心或過濾后再進(jìn)行測定。

二、薄層上直接定量薄層上直接定量的方法有目測法、測面積法、儀器測量法。，目前，用薄層掃描儀掃描測定斑點(diǎn)中化合物含量的方法已成為薄層定量的主要方法，此法也可用于紙色譜、電泳凝膠及其他介質(zhì)的色譜。

(一)測定原理與方法

1．吸收測定法

(1)Kubelka-Munk原理及方程：當(dāng)強(qiáng)度為I0的單色光照射到厚度為X的薄層后，其情況如下圖所示。

I0為入射光強(qiáng)度i（x）為x處的透射光強(qiáng)。j（x）為x處的反射光強(qiáng)。X為固定相厚度。

Kubelka-Munk指出，當(dāng)強(qiáng)度為I0的單色光照射到厚度為X的薄層后，光的反射和透射符合下述微分方程：

-di/dX=-(S+K)i+Sjdj/dX=-(S+K)j+Si

S：單位厚度薄層固定相的散射系數(shù)；K為薄層色譜斑點(diǎn)或單位厚度薄層固定相的吸收系數(shù)；X為由載板表面算起的薄層厚度。

i與j的一般解為：

i=Asinh(bSx)+Bcosh(bSx)

j=(aA-bB)sinh(bSx)+(aB-bA)cosh(bSx)A，B常數(shù)，a=（S+K）/S，b=（a2-1）1/2

，Sinh=（ex-e-x）/2；Cos=（ex+e-x）/2，A/B=a/b。為討論方便，一般計(jì)算邊界的i和j，即薄層下表面的透射光和上表面的反射光。

X=0時(shí)，j=0，i=I0TX=X時(shí)，i=I0，j=I0R

則T=b/[asinh（bSX）+bcosh（bSX）]R=sinh（bSX）/[asinh（bSX）+bcosh（bSX）]SX稱作散射參數(shù)，它與薄層厚度、散射系數(shù)有關(guān)。Merck硅膠板的SX=3，青島硅膠板SX＝3，日本和光硅膠F板SX=7。SX數(shù)值大小直接影響薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度-濃度曲線偏離Beer定律的程度。薄層色譜斑點(diǎn)中物質(zhì)的含量包含于a及b兩個(gè)參數(shù)中，已知a=（S+K）/S，b=（a2-1）1/2

，乘以X，則

a=（SX+KX）/SXb=[KX（2SX+KX）]1/2/SXKX為吸收參數(shù)，相當(dāng)于薄層色譜單位面積中物質(zhì)的含量（

g/cm2），即KX=C。

薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度：理想的空白薄層板的K=0，但一般K0。為消除影響，通常以空白板為基準(zhǔn)，測定相對透光率及相對反射率來計(jì)算薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度。透射法A=-lg（T/T0）反射法A=-lg（R/R0）

-lgT/T0或-lgR/R0為儀器檢測部分所獲得的信號，它們和KX間的關(guān)系曲線相當(dāng)于一般分光光度法中的A-C曲線，在溶液中，A-C曲線為一直線，而在薄層上，-lgT/T0或-lgR/R0和濃度間不呈線性關(guān)系，比較下圖可以看出彎曲度隨SX增加而增加。不同SX時(shí)，吸光度與KX間關(guān)系曲線

a．透射法測定-lgT/T0與KX間關(guān)系b．反射法測定-lgR/R0與KX間關(guān)系

目前對Kubelka-Munk曲線處理采用兩類方法：曲線校直法和計(jì)算機(jī)回歸法。島津CS系列采用前者，CAMAG儀器采用后者。

1．校正前的標(biāo)準(zhǔn)曲線2．校正后的標(biāo)準(zhǔn)曲線

曲線校直法是一種簡便的薄層色譜掃描定量校準(zhǔn)方法，但比較粗糙，且有時(shí)難于知道薄層板的SX的準(zhǔn)確值。

2．熒光測定法熒光測定法的定量依據(jù)為：F=φI0abCF為熒光強(qiáng)度；φ為熒光效率；I0為入射光強(qiáng)度；a為吸收系數(shù)；b為薄層厚度；c為樣品濃度。F與C成正比，二者之間存在線性關(guān)系。熒光測定法與吸收測定法不同，其測量值與斑點(diǎn)形狀無關(guān)。本身具有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的化合物均可用本法測量。熒光測定法選擇性高，因激發(fā)光與熒光波長均能加以選擇，可避免一些其他組分的干擾，其靈敏度比吸收法高100～1000倍，最低可測到10～50pg樣品。

3．熒光淬滅法用紫外光照射熒光薄層板時(shí)，薄層板產(chǎn)生熒光(背景)，而在板上樣品斑點(diǎn)處，因樣品對紫外光有吸收，照到薄層斑點(diǎn)處的紫外光有所減弱，則產(chǎn)生的熒光也減弱，樣品呈暗色斑點(diǎn)。測定時(shí)，由熒光減弱的程度測出樣品中被測物含量。

(三)定量方法主要有外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法，前者更為常用。

1．外標(biāo)法首先做待測組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其縱坐標(biāo)為各個(gè)斑點(diǎn)的峰面積積分值A(chǔ)，橫坐標(biāo)為相應(yīng)各斑點(diǎn)的物質(zhì)量(微克數(shù))。此時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線有2個(gè)目的，其一確定該組分的線性范圍。其二看標(biāo)準(zhǔn)曲線是否通過原點(diǎn)，若通過原點(diǎn)，分析樣品時(shí)用外標(biāo)一點(diǎn)法定量，若不通過原點(diǎn)，分析樣品時(shí)用外標(biāo)二點(diǎn)法定量。

(1)外標(biāo)一點(diǎn)法：C＝FA

(2)外標(biāo)二點(diǎn)法：C=F1A+F2

C1=F1A1+F2C2=F1A2+F2

解聯(lián)立方程得：F1=（C1-C2）/（A1-A2）

F2＝0.5(C1+C2)–0.5F1(A1+A2)

2．內(nèi)標(biāo)法通常配2份不同濃度的含不同量內(nèi)標(biāo)物的對照品溶液，并在一定量樣品溶液中加入已知質(zhì)量的內(nèi)標(biāo)物，將這兩種溶液分別點(diǎn)在薄層上，展開后，內(nèi)標(biāo)物與對照品分開，用同一波長掃描，測峰面積。用對照品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)，用二者的濃度比為橫坐標(biāo)作圖，所得曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法

C/CIS

＝A/AIS·FF＝C/CIS·AIS/A

內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法中標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式為：

C1/（CIS）1=F1·A1/（AIS）1+F2C2/（CIS）2=F2·A2/（AIS）2+F1解上述聯(lián)立方程式得：

F1=[C1/（CIS）1-C2/（CIS）2]/[A1/（AIS）1-A2/（AIS）2]F2=0.5[C1/（CIS）1+C2/（CIS）2]–0.5F1·[A1/（AIS）1+A2/（AIS）2](四)影響薄層掃描定量的因素

1．吸附劑性能及薄層質(zhì)量薄層厚薄要均勻，吸附劑粒度要均勻。粒度不均，影響散射系數(shù)。厚度增加，Rf值增大。厚度下降，展開后斑點(diǎn)擴(kuò)散較嚴(yán)重。透射法測定時(shí)，厚度增加，峰面積值增加；反射法測定時(shí)，厚度增加，峰面積值減少。

2．點(diǎn)樣操作與隨行標(biāo)準(zhǔn)原點(diǎn)直徑以1～3mm較合適，點(diǎn)樣過多會(huì)使原點(diǎn)“超載”，展開劑出現(xiàn)“繞行”現(xiàn)象，引起斑點(diǎn)拖尾或重疊，使掃描峰形不對稱或不能“基線分離”。定量點(diǎn)樣時(shí)，盡可能在同一塊薄層板上同時(shí)點(diǎn)上已知濃度的對照品，即隨行標(biāo)準(zhǔn)，一同展開，定量，并由這些對照品的測定值計(jì)算樣品含量。

3．展開條件將薄層板與展開槽進(jìn)行預(yù)飽和，可得到重現(xiàn)的色譜圖。

展開時(shí)溫度變化應(yīng)盡量小。展距要適宜，一般Rf值在0.2～0.8時(shí)最佳。展開用的溶劑必要時(shí)需經(jīng)過預(yù)處理。第一節(jié)性狀鑒別性狀鑒別的內(nèi)容：

顏色、形態(tài)、性狀、氣、味、其他二.各種劑型的性狀描述

見教材p.14～15三.物理常數(shù)測定一、制片方法1．散劑、膠囊劑取粉末，直接加水或水合氯醛透化裝片。2．片劑用刀片直接從藥片斷面刮取少量粉末或研碎后取少量樣品透化裝片。3．水丸、錠劑研成粉末后取少量直接透化裝片4．蜜丸取蜜丸切碎，加水?dāng)嚢?，洗滌后，置離心管中離心分離沉淀。如此反復(fù)處理以除去蜂蜜后透化裝片

第二節(jié)顯微鑒別若觀察細(xì)胞內(nèi)含物形狀，應(yīng)選用不同試劑制片淀粉粒水或甘油醋酸試液；糊粉粒甘油；水溶性內(nèi)含物乙醇或水合氯醛試液(不加熱)

固定標(biāo)本片制片方法

取中成藥粉末置離心管中，加乙醇浸過上面，玻棒攪拌5～10分鐘后離心使粉末沉積，傾去稀醇液，再加無水乙醇二次，丙酮一次，丙酮、二甲苯等量混合液一次，如前操作，每次10～20分鐘；最后加入純二甲苯，略加攪拌，取處理后的樣品微量置載玻片上，滴加中性樹膠，加蓋玻片封藏，貼標(biāo)簽。

二、觀察要點(diǎn)

中成藥粉末鏡檢時(shí)，首先要了解處方中的藥味組成，明確其來源的藥用植物的部位，才能根據(jù)該部位的顯微特征來進(jìn)行檢出。

(一)根類木栓組織碎片，表面觀多為多角形細(xì)胞，排列緊密。導(dǎo)管直徑、節(jié)的長短、末梢壁的穿孔及增厚壁的紋理類型草酸鈣結(jié)晶晶形、分泌組織、淀粉粒的形狀、臍點(diǎn)層紋(二)根莖類與根類藥材粉末特征相似。而淀粉粒有時(shí)較大，有鱗葉組織，退化的鱗葉表皮細(xì)胞大多狹長，細(xì)胞壁平直或波狀彎曲。

(三)莖類1．莖類表皮細(xì)胞及垂周壁的形狀，氣孔的類型，毛茸的類型及形態(tài)導(dǎo)管的類型、直徑、長短。管胞的形態(tài)；纖維的形狀、直徑、長短、有無晶纖維等。草酸鈣結(jié)晶多為方晶及簇晶，單子葉植物偶見針晶。薄壁組織碎片、石細(xì)胞。

2．皮類纖維的直徑、長短及形狀，是否成束存在，細(xì)胞壁厚薄、木化與否，能否看到胞腔及壁孔等。石細(xì)胞的形狀、細(xì)胞壁增厚情況。草酸鈣結(jié)晶多為方晶及簇晶，砂晶及針晶較少。皮類藥材粉末不應(yīng)含有木質(zhì)部組織，如導(dǎo)管、管胞等。

3．木類可見導(dǎo)管、管胞、木纖維、木射線及木薄壁細(xì)胞。細(xì)胞壁通常均木化。不應(yīng)有木栓細(xì)胞及綠色組織等。

(四)花類1．苞片及花萼構(gòu)造類同葉片，表面上可見到氣孔及毛茸2．花冠上表皮細(xì)胞常呈乳頭狀或絨毛狀突起而無氣孔，下表皮細(xì)胞常不呈乳頭狀，細(xì)胞壁微波狀彎曲。維管束組織細(xì)小。3．雄蕊1）花粉囊內(nèi)壁細(xì)胞的壁不均勻地增厚，呈網(wǎng)狀、螺旋狀、環(huán)紋狀及點(diǎn)狀等；2）花粉粒具圓形、長圓形或多面形等多種形狀。通常具內(nèi)外兩層壁，外壁多數(shù)具各種雕紋。4．雌蕊柱頭的表皮細(xì)胞呈乳頭狀突起，或分化成絨毛狀

(五)葉類1．表皮上下表皮細(xì)胞的形狀、大小，角質(zhì)層的形態(tài)，垂周壁的形狀、厚度或增厚情況以及有無氣孔、毛茸等。2．氣孔氣孔的形狀、大小、型式，保衛(wèi)細(xì)胞的形狀及內(nèi)含物，副衛(wèi)細(xì)胞的數(shù)目、大小、形狀。3．毛茸注意毛茸的種類。非腺毛：注意細(xì)胞的數(shù)目、形狀、長短、大小、細(xì)胞壁的厚薄及表面形態(tài)等。多為單列性多細(xì)胞毛，少為單細(xì)胞毛。形狀一般呈長圓錐形或線形；細(xì)胞壁一般較薄，外壁表面大都光滑。腺毛：注意頭部的形狀、大小、細(xì)胞的數(shù)目、排列情況以及柄部的長短、細(xì)胞數(shù)目及行列數(shù)目等。(六)果實(shí)類1．果皮細(xì)胞的形狀、大小。2．外果皮上可能有非腺毛及腺毛，注意長短、形狀。3．中果皮內(nèi)的分泌組織油細(xì)胞，油室、油管、石細(xì)胞等

4．內(nèi)果皮石細(xì)胞，大小、細(xì)胞壁的厚薄，如為鑲嵌層，則應(yīng)注意其排列形式。(七)種子類1．種皮表皮毛的形狀、細(xì)胞壁的厚薄、是否木化、有無紋理；石細(xì)胞形狀、大小、色澤散布及細(xì)胞壁的增厚情況。柵狀細(xì)胞及油細(xì)胞。

2．外胚乳細(xì)胞大小、形狀、壁厚、色澤、細(xì)胞內(nèi)含物3．內(nèi)胚乳細(xì)胞形狀、厚度、內(nèi)含物。

4．胚的子葉有無分泌組織及細(xì)胞的內(nèi)含物。

三、應(yīng)用實(shí)例

六味地黃丸的顯微定性鑒別

[顯微鑒別]取本品置顯微鏡下觀察，(1)薄壁組織棕色至黑棕色，細(xì)胞多皺縮，內(nèi)含棕色核狀物。(熟地黃)(2)果皮表皮細(xì)胞橙黃色，表面觀類多角形，垂周壁略連珠狀增厚。(山茱萸)(3)淀粉粒三角狀卵形或矩圓形，直徑24—40um，臍點(diǎn)短縫狀或人字狀。(山藥)3a草酸鈣針晶束3b淀粉粒(4)草酸鈣簇晶存在于無色薄壁細(xì)胞中，有時(shí)數(shù)個(gè)排列成行。(牡丹皮)(5)不規(guī)則分枝狀團(tuán)塊無色，遇水合氯醛溶化；菌絲無色，直徑4-6um。(茯苓)(6)薄壁細(xì)胞類圓形，有橢圓形紋孔，集成紋孔群。(澤瀉)一、一般化學(xué)反應(yīng)法中藥制劑一般選擇有效成分、特征成分作為鑒別的對象。一般化學(xué)反應(yīng)鑒別法多在試管中用濕法反應(yīng)進(jìn)行，制劑樣品要先制成適宜的供試液。一般情形下用50％-70％乙醇回流提取制備供試液。

第三節(jié)中藥制劑的一般理化鑒別法一般化學(xué)反應(yīng)法用于中藥制劑鑒別應(yīng)注意：(1)慎重使用專屬性不好的分析反應(yīng)，如泡沫生成反應(yīng)、三氯化鐵顯色反應(yīng)等。(2)在分析前對樣品進(jìn)行分離、精制，除去干擾分析反應(yīng)的物質(zhì)，借此改善鑒別方法的專屬性。(3)采用陰性對照和陽性對照的方式，對擬定的鑒別方法進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證，防止出現(xiàn)假陽性。

取本品6片(去包衣)，研細(xì)，加乙醇10ml，溫?zé)?0分鐘，過濾，濾液作如下反應(yīng)：(1)取濾液5ml，加鎂粉少量與鹽酸0.5ml，加熱，即顯紅色（黃芩中有大量黃酮）(2)另取濾液4ml，加氫氧化鈉試液，顯紅色，再加30％過氧化氫溶液，加熱，紅色不消失，加酸或酸性時(shí)，紅色變?yōu)辄S色。（大黃中含有羥基蒽醌）

實(shí)例1牛黃解毒片中大黃、黃芩的定性鑒別反應(yīng)實(shí)例2牙痛一粒丸中蟾蜍、朱砂、雄黃的定性鑒別反應(yīng)(1)取本品約0.1g，研細(xì)，加氯仿5ml，浸泡1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)哟佐倭渴谷芙猓俚渭恿蛩?，初顯藍(lán)紫色，漸變?yōu)樗{(lán)綠色。（蟾蜍）(2)取本品約0.2g，研細(xì)，加水濕潤后，加氯酸鉀的硝酸飽和溶液2ml，振搖，放冷，離心，取上清液，加氯化鋇試液0.5ml，搖勻，溶液呈白色渾濁，離心，棄去上層酸液，再加水2ml，振搖，沉淀不溶解。（雄黃）(3)取本品適量，研細(xì)，用鹽酸濕潤后，在光潔的銅片上摩擦，銅片表面即顯銀白色光澤，加熱烘烤后，銀白色消失（朱砂）

二、顯微化學(xué)鑒別法

(一)取藥材的切片、粉末或中成藥粉末，置載玻片上，滴加各種試劑，加蓋玻片，在顯微鏡下觀察產(chǎn)生的結(jié)晶或沉淀，以及特殊的顏色等，作為鑒別的特征。

例：黃連粉末滴加稀鹽酸，放置5分鐘，可見小檗堿鹽酸鹽黃色結(jié)晶析出。

穿心蓮用水濕潤，切成橫切片，滴加乙醇后加Kedde試液，葉肉組織顯紫紅色(穿心蓮內(nèi)酯成分的不飽和內(nèi)酯環(huán)反應(yīng))。

丁香切片滴加30％氫氧化鈉飽和溶液，略放置，可見油室內(nèi)有針狀丁香酚鈉結(jié)晶析出。

肉桂粉末加氯仿2～3滴，略浸漬，速加2％鹽酸苯肼1滴，可見黃色針狀或桿狀結(jié)晶(肉桂酸反應(yīng))。

(二)取藥材粗粉加適當(dāng)?shù)娜軇┙?，將浸提液置載玻片上，滴加各種試劑，加蓋玻片，在顯微鏡下觀察反應(yīng)。例：檳榔粉末0.5g，加水3～4ml及稀鹽酸1滴，微熱數(shù)分鐘，過濾，取濾液1滴于載玻片上，加碘化鉍鉀試液1滴，即發(fā)生混濁，放置后可見石榴紅球形或方形結(jié)晶(檳榔堿)。

曼陀羅葉少許，加氯仿提取，提取液蒸干，加發(fā)煙硝酸1滴，顯黃色，加氫氧化鉀1粒，顯紫堇色(莨菪烷類成分Vitali反應(yīng))。

(三)取藥材切片或粉末，滴加各種試劑，直接觀察反應(yīng)現(xiàn)象。例：鐘乳石少許，加濃鹽酸數(shù)滴，能產(chǎn)生大量氣泡(碳酸鹽分解產(chǎn)生CO2)。

番木鱉胚乳薄片，加1％釩酸銨-硫酸試液1滴，胚乳速顯紫色(番木鱉堿)，另取切片加發(fā)煙硝酸1滴，即顯橙紅色(馬錢子堿)。

大黃粉末少許，置白磁板上，加氫氧化鈉液l滴，顯深紅色(蒽醌鈉鹽)。

三、升華法操作方法：取金屬片安放在有圓孔(直徑約2cm)的石棉板上，在金屬片上放一小金屬圈(內(nèi)徑約1.5cm，高約0.8cm)，對準(zhǔn)石棉板上的圓孔，圈內(nèi)放入預(yù)先研細(xì)成粉末的中藥制劑一薄層，圈上覆蓋載玻片，在石棉板下圓孔處用酒精燈緩緩加熱，至粉末開始變焦，去火待冷，載玻片上有升華物凝集。將載玻片反轉(zhuǎn)后，置顯微鏡下觀察結(jié)晶形狀、色澤，或取升華物加試液觀察反應(yīng)。實(shí)例牛黃解毒丸微量升華鑒別取本品進(jìn)行微量升華，先得白色升華物后（冰片），繼得黃色升華物（大黃中蒽醌）。將升華物分別置顯微鏡下觀察：白色升華物呈不定形的無色片狀結(jié)晶，加新制的1％香草醛硫酸溶液，漸顯紫紅色，黃色升華物呈黃色針狀結(jié)晶或羽狀結(jié)晶，遇堿顯紅色，遇酸變?yōu)辄S色。

四、熒光法有些中藥材中含有能產(chǎn)生熒光的化學(xué)成分，在可見光、紫外光照射下能發(fā)出熒光，或經(jīng)試劑處理后發(fā)出熒光。含有這類藥材的中藥制劑可用熒光法進(jìn)行鑒別。通常的操作方法是取制劑的提取液點(diǎn)在濾紙上或試紙上，置紫外光燈下(365nm)觀察，有時(shí)則是加一定的試劑后再進(jìn)行觀察。

實(shí)例l元胡止痛片的熒光鑒別取本品適量，去糖衣，研細(xì)，取粉末1g，加0.25mol／L硫酸液10ml振搖片刻，濾過，取濾液數(shù)滴，點(diǎn)于濾紙上，陰干后置紫外光燈(365nm)下觀察，顯亮黃色熒光。

五、光譜法

(一)可見—紫外分光光度法

不同的藥材所含的成分不同，在一定條件下吸收光譜的特征可用于鑒別藥材。利用這一特點(diǎn)，可見-紫外分光光度法也可用于中藥制劑的鑒別。

(二)紅外光譜法

六、色譜法中藥制劑可用色譜法鑒定，包括薄層色譜法、紙色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法。(一)薄層色譜法使用本法鑒定中藥制劑，通常是在同一塊薄層板上點(diǎn)入樣品和適宜的對照物，采用同一條件依法層析展開，經(jīng)顯色或用其他方法檢出色譜斑點(diǎn)后，將樣品與對照物所得的色譜圖進(jìn)行對比，作出鑒定。

1．樣品應(yīng)作適當(dāng)?shù)念A(yù)處理對樣品進(jìn)行初步的分離精制常用的預(yù)處理方法有：升華法，蒸餾法，溶劑提取法，小型層析柱的柱色譜法、離子交換法等。

2．展開劑的選擇選用能突出主要斑點(diǎn)，便于分析比較的展開劑，如果鑒別的對象相同，應(yīng)首先試用已有的、較成熟的展開劑。如無現(xiàn)有展開劑，可先以無水乙醇-苯（1∶4）展開，如主要物質(zhì)的Rf在0.8以上，改用苯-氯仿（1∶3），如主要物質(zhì)的Rf在0.3以下，改用丙酮-甲醇（1∶1）。

3．對照品的選擇中國藥典(一部)作薄層鑒別用的對照物有對照品和對照藥材兩種。

TLC用作中藥制劑鑒別的另一類對照物是陰陽對照溶液。

4．薄層色譜的掃描定性鑒別

TLC展開后，斑點(diǎn)的檢識(shí)方法，有通用性的，如在紫外光燈下觀察出現(xiàn)的熒光，或用碘蒸氣、稀硫酸、磷鉬酸顯色等，這類方法專屬性不強(qiáng)。另一類是專屬性較好的顯色劑，例如碘化鉍鉀試液，茚三酮試液和三氯化鋁試液等，一般可依次說明斑點(diǎn)歸屬。還可用薄層掃描儀將薄層板上的斑點(diǎn)轉(zhuǎn)換繪制成峰形色譜圖，這種色譜圖以斑點(diǎn)展開后移動(dòng)的距離為橫坐標(biāo)，斑點(diǎn)對光輻射的吸收強(qiáng)度或發(fā)射熒光的強(qiáng)度為縱坐標(biāo)的峰形曲線圖譜。

應(yīng)用實(shí)例1.大黃及含大黃的成藥

1）供試液制備取各樣品適量，加甲醇20ml浸漬1h，過濾，取濾液5ml，蒸干，加水10ml使溶解，再加HCl1ml，水浴加熱30min，立即冷卻，乙醚提取兩次，20ml/次，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)勇确氯芙獬?ml。2）對照液制備取大黃對照藥材0.1g．按供試液制備作為對照藥材溶液；另取蘆薈大黃素，大黃酸，大黃素，大黃素甲醚，大黃酚對照品，加甲醇制成1mg/ml的溶液，作為對照品溶液。3）薄層板硅膠H加0.3％CMC-Na溶液的自制板；厚度：300um4）點(diǎn)樣分別點(diǎn)樣4uL。

5）展開劑石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)放置后的上層溶液。

6）展開方式上行展開；展距：7cm。

7）顯色置紫外光燈(365nm)下檢視。

8）色譜識(shí)別紫外光燈(365nm)下，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的五個(gè)橙黃色熒光主斑點(diǎn)。

9）備注在部分成藥樣品的色譜中，除大黃的五個(gè)蒽醌成分的斑點(diǎn)外，尚有其它熒光斑點(diǎn)，為處方中的其它成分。1234567891011121314151617

樣品：1．蘆薈大黃素；2．大黃酸；3．大黃素；4．大黃素甲醚；5．大黃酚；6．大黃(掌葉大黃)對照藥材；7．大黃(唐古特大黃)對照藥材；8．大黃流浸膏；9．小兒化毒散；10．檳榔四消丸；11．木香檳榔丸；12．枳實(shí)導(dǎo)滯丸；13．牛黃上清丸；14．清寧丸；15．一捻金；16．牛黃解毒片；17．牛黃解毒丸

2.黃連、黃柏及含黃連、黃柏的成藥

1）供試液制備取各品種藥粉適量，加甲醇5ml，置水浴回流15min，過濾，濾液濃縮至1ml。

2）對照液制備取鹽酸香檳酒小檗堿，硫酸黃連堿，硫酸表小檗堿，非洲防己堿，藥根堿，鹽酸巴馬汀對照品，加甲醇制成每0.5mg/ml的溶液，作為對照品溶液。

3）薄層板硅膠G自制板；厚度：500um

4）點(diǎn)樣分別點(diǎn)樣1-2ul

5）展開劑苯