模式生物酵母菌省公開課金獎(jiǎng)全國(guó)賽課一等獎(jiǎng)微課獲獎(jiǎng)?wù)n件

模式生物--大腸桿菌、酵母菌張紅霞1/36大腸桿菌介紹大腸桿菌（Escherichiacoli），是相對(duì)簡(jiǎn)單單細(xì)胞原核生物，全部DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成機(jī)器都包含在同一細(xì)胞器中，能夠相對(duì)輕易培養(yǎng)和操作。2/36酵母菌介紹酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無(wú)性繁殖單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔(dān)子菌綱（擔(dān)子酵母菌）、半知菌類（半知酵母菌），共由56個(gè)屬和500多個(gè)種組成。假如說(shuō)大腸桿菌是外源基因最成熟原核生物表示系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟真核生物表示系統(tǒng)。3/36釀酒酵母（Sacharomycescerevisiae）是第一個(gè)最少在一萬(wàn)年前就能被人工培育真菌，是最簡(jiǎn)單真核生物，是由一個(gè)細(xì)胞組成獨(dú)立生物個(gè)體，能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，易于培養(yǎng)和操作，被稱為真核生物中“大腸桿菌”。早在1996年就完成了釀酒酵母基因組測(cè)序，這是人類第一次取得真核生物基因組完整核苷酸序列，被稱為遺傳學(xué)研究上一座里程碑。4/36大腸桿菌基因組大腸桿菌通常只有一條染色體，比高等生物基因組要小得多，而且含有較高基因密度（大約每1kb就有一個(gè)基因），沒有內(nèi)含子和極少有重復(fù)DNA，易于尋找和分析基因.5/36經(jīng)過(guò)對(duì)酵母全基因組序列測(cè)定，其基因組大小約為12Mb，初步確定了5885個(gè)編碼蛋白質(zhì)基因，140個(gè)rRNA基因、275個(gè)tRNA基因，第一次揭示了一個(gè)真核生物全部基因數(shù)目和大致上功效分類.酵母基因組中有快要31％編碼蛋白質(zhì)或者含有開放閱讀框，與哺乳動(dòng)物編碼蛋白質(zhì)基因有高度同源性。酵母菌基因組6/36酵母與其它真核生物相比，它們基因組較小（約12Mb），基因數(shù)目也比較少（約5885）.與大腸桿菌類似，它們能夠在試驗(yàn)室里快速繁殖，在理想條件下，每次細(xì)胞分裂大約90min，能夠從單個(gè)細(xì)胞繁殖成克隆群體.酵母作為模式試驗(yàn)系統(tǒng)最主要優(yōu)點(diǎn)是，酵母細(xì)胞不但簡(jiǎn)單，而且含有全部真核生物細(xì)胞主要特征，如含有一個(gè)獨(dú)立細(xì)胞核、多條線性染色體包裝成染色質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)包含了全部細(xì)胞器（如線粒體）和含有細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)（如肌動(dòng)纖維蛋白）等.7/36大腸桿菌遺傳學(xué)研究應(yīng)用大腸桿菌生活周期很短，而且單個(gè)細(xì)胞能夠很輕易取得一個(gè)遺傳上同源細(xì)胞群體（克隆）.細(xì)菌是單倍體，這意味著即使是隱性突變，也能夠表現(xiàn)出突變表型，同時(shí)細(xì)菌之間能夠方便地進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換，細(xì)菌這些特征便于對(duì)其進(jìn)行遺傳學(xué)研究.8/36大腸桿菌作為生命科學(xué)研究模式系統(tǒng)，其主要優(yōu)勢(shì)是含有遺傳交換系統(tǒng).遺傳交換使定位突變、構(gòu)建含各種突變菌株、構(gòu)建用來(lái)區(qū)分顯性突變和隱性突變及進(jìn)行順反式分析部分雙倍體菌株成為可能.這種遺傳交換系統(tǒng)主要經(jīng)過(guò)兩種方式構(gòu)建.9/36第一個(gè)方式是大腸桿菌經(jīng)過(guò)性結(jié)合交換DNA，大腸桿菌育性質(zhì)粒（F因子，F(xiàn)-factor）具備把本身從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞能力.F因子介導(dǎo)結(jié)合是一個(gè)復(fù)制過(guò)程，F(xiàn)+細(xì)胞轉(zhuǎn)移一個(gè)拷貝F因子給F-細(xì)胞.有時(shí)，F(xiàn)因子整合到染色體中，就會(huì)引發(fā)寄主染色體經(jīng)過(guò)接合向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移.含有整合F因子菌株叫做Hfr菌株（高頻重組菌株，Hfr

strain），這種材料對(duì)于進(jìn)行遺傳交換研究非常有用。10/36第二種方式是經(jīng)過(guò)噬菌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)，噬菌體成熟時(shí)有一部分噬菌體DNA被寄主DNA所取代，當(dāng)噬菌體感染下一個(gè)細(xì)胞時(shí)，從以前寄主那里取得染色體DNA片段能夠和被感染寄主染色體發(fā)生重組，造成遺傳信息從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。11/36在酵母系統(tǒng)中，單倍體和雙倍體細(xì)胞存在促進(jìn)了酵母遺傳分析.酵母在單倍體和二倍體狀態(tài)下均能生長(zhǎng)，并能在試驗(yàn)條件下較為方便地控制單倍體和二倍體之間相互轉(zhuǎn)換，這種轉(zhuǎn)換是經(jīng)過(guò)交配（單倍體到雙倍體）和孢子生成（雙倍體到單倍體）來(lái)實(shí)現(xiàn)，這對(duì)其基因功效研究十分有利.比如，要想知道一個(gè)特定基因是否是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需，能夠在單倍體里敲除這個(gè)基因，單倍體細(xì)胞只能承受非必需基因敲除。酵母菌遺傳學(xué)研究應(yīng)用12/36酵母中輕易對(duì)其基因組做準(zhǔn)確人為突變，當(dāng)把末端與基因組任何一個(gè)特定區(qū)域同源線性DNA引入到酵母細(xì)胞中，酵母基因組就會(huì)發(fā)生非常高同源重組，造成目標(biāo)染色體序列被所用目標(biāo)染色體片段所取代.如準(zhǔn)確地刪除整個(gè)基因編碼區(qū)、改變單個(gè)特定密碼子，甚至改變開啟子中一個(gè)特定堿基對(duì)，這使得研究基因或其調(diào)控序列功效等詳細(xì)問(wèn)題變得比較輕易.13/36在20世紀(jì)60年代末，Hartwell、Hunt和Nurse便認(rèn)識(shí)到用遺傳學(xué)方法研究細(xì)胞周期可能性.Hartwell采取釀酒酵母細(xì)胞建立系統(tǒng)模型，經(jīng)過(guò)一系列試驗(yàn)，分離出細(xì)胞周期基因發(fā)生突變酵母細(xì)胞，相繼發(fā)覺了一系列與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)CDC基因（celldivisioncyclegenes）。14/36一個(gè)被稱為“START”基因?qū)刂聘鱾€(gè)細(xì)胞周期最初階段含有決定性作用.Nurse在Hartwell基礎(chǔ)上，發(fā)覺了調(diào)整細(xì)胞周期一個(gè)關(guān)鍵物質(zhì)CDK（細(xì)胞周期蛋白依賴激酶），并證實(shí)CDK是經(jīng)過(guò)對(duì)其它蛋白質(zhì)化學(xué)作用（磷酸化作用）來(lái)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期.鑒于利用酵母分子遺傳學(xué)對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控理論巨大貢獻(xiàn)，Hunt、Hartwell和Nurse榮獲了21世紀(jì)首屆諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng).15/36細(xì)胞生命活動(dòng)中許多過(guò)程諸如酶催化代謝反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)修飾與加工、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等都表現(xiàn)為一個(gè)蛋白質(zhì)與另一個(gè)蛋白質(zhì)間相互作用.傳統(tǒng)免疫印跡、Westernblot等方法極難滿足對(duì)蛋白質(zhì)分子之間相互作用這一動(dòng)態(tài)過(guò)程研究需要.利用酵母轉(zhuǎn)錄因子特點(diǎn)，F(xiàn)ields和Song于1989年創(chuàng)建了一個(gè)非常簡(jiǎn)便而有效研究蛋白質(zhì)相互作用方法———酵母雙雜交系統(tǒng)。16/36酵母雙雜交系統(tǒng)最突出特點(diǎn)是能夠在酵母這種生長(zhǎng)快速且易操作體系中研究真核細(xì)胞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，而且還可經(jīng)過(guò)cDNA文庫(kù)篩選直接找到與未知蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)基因。17/36近年來(lái)為了適應(yīng)更廣泛用途，在原有酵母雙雜交系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展了大量衍生系統(tǒng)，如蛋白質(zhì)三雜交系統(tǒng)、激酶三雜交系統(tǒng)、小配體三雜交系統(tǒng)、RNA三雜交系統(tǒng)等類型.另外，還出現(xiàn)了為研究膜蛋白相互作用而改進(jìn)SOS富集系統(tǒng)（SOSrecruitmentsystem，SRS），在該系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)之間相互作用被人為限制在酵母細(xì)胞膜上。18/36應(yīng)用19/36利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素1982年，美國(guó)ElyLiLi企業(yè)首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個(gè)上市基因工程藥品。由基因工程菌合成重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)分，而且還含有沒有免疫原性、注射吸收快速等優(yōu)點(diǎn)，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中巨大潛力。20/36大腸桿菌作為表示外源基因受體菌特征大腸桿菌表示外源基因優(yōu)勢(shì)21/36大腸桿菌作為表示外源基因受體菌特征大腸桿菌表示外源基因劣勢(shì)22/36藍(lán)白斑篩選23/36篩選原理

野生型大腸桿菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶能夠?qū)o(wú)色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍(lán)色物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。有色物質(zhì)能夠使整個(gè)培養(yǎng)菌落產(chǎn)生顏色改變，而顏色改變是判定和篩選最直觀有效方法。24/36工程菌及載體基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺點(diǎn)型菌株。這種宿主菌染色體基因組中編碼β-半乳糖苷酶基因突變，造成其編碼β-半乳糖苷酶失去正常N段一個(gè)146個(gè)氨基酸短肽（即α肽鏈），從而不含有生物活性，即無(wú)法作用于X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。用于藍(lán)白斑篩選載體含有一段稱為lacz'基因，lacz'中包含：一段β-半乳糖苷酶開啟子；編碼α肽鏈區(qū)段；一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)。25/36α-互補(bǔ)缺點(diǎn)株基因無(wú)法單獨(dú)編碼有活性β-半乳糖苷酶，但當(dāng)菌體中含有帶lacz'質(zhì)粒后，質(zhì)粒lacz'基因編碼α肽鏈和菌株基因組表示Ｎ端缺點(diǎn)β-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，含有與完整β-半乳糖苷酶相同作用X-gal生成藍(lán)色物質(zhì)能力，這種現(xiàn)象即α-互補(bǔ)。26/36

操作中，添加IPTG(異丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中β-半乳糖苷酶開啟子，在含有X-gal固體平板培養(yǎng)基中菌落展現(xiàn)藍(lán)色。以上是攜帶空載體菌株產(chǎn)生表型。當(dāng)外源DNA（即目標(biāo)片段）與含lacz'載體連接時(shí)，會(huì)插入進(jìn)MCS，使α肽鏈讀碼框破壞，這種重組質(zhì)粒不再表示α肽鏈，將它導(dǎo)入宿主缺點(diǎn)菌株則無(wú)α互補(bǔ)作用，不產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中X-gal產(chǎn)生藍(lán)色，培養(yǎng)表型即展現(xiàn)白色菌落。27/36

試驗(yàn)中，通常藍(lán)白篩選是與抗性篩選一同使用。含X-gal平板培養(yǎng)基中同時(shí)含有一個(gè)或各種載體所攜帶抗性相對(duì)應(yīng)抗生素，這么，一次篩選能夠判斷出：未轉(zhuǎn)化菌不含有抗性，不生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)化了空載體，即未重組質(zhì)粒菌，長(zhǎng)成藍(lán)色菌落；轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒菌，即目標(biāo)重組菌，長(zhǎng)成白色菌落。28/36酵母基因工程利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗由乙型肝炎病毒（HBV）感染引發(fā)急慢性乙型肝炎是一個(gè)嚴(yán)重傳染病，每年約有200萬(wàn)病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。當(dāng)前對(duì)乙型肝炎病毒還沒有一個(gè)有效治療藥品，所以高純度乙型疫苗生產(chǎn)對(duì)預(yù)防病毒感染含有重大社會(huì)效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠確保。29/36產(chǎn)乙肝表面抗原重組巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母構(gòu)建PARS2BglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1BglIIpBSAG15111kbBglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1his+轉(zhuǎn)化子重組分子轉(zhuǎn)化his-受體細(xì)胞染色體DNA30/36

重組菌首先在含有甘油培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導(dǎo)乙肝病毒表面抗原多肽（HBsAg）表示，最終S蛋白產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白總量3%在大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個(gè)240L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可取得90克22nmHBsAg顆粒，足夠制成900萬(wàn)份乙肝疫苗。31/36

酵母菌作為表示外源基因受體菌特征