酶工程酶的固定化

關(guān)于酶工程酶的固定化酶和細(xì)胞的固定化固定化酶概述問(wèn)題的提出：游離酶的不足之處酶的穩(wěn)定性問(wèn)題在溫度、pH和無(wú)機(jī)離子等外界因素的影響下，酶的穩(wěn)定性不佳，半衰期較短，容易變性失活酶的重復(fù)使用的問(wèn)題在均相體系中的酶催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，即使仍有較高酶活力，也難以回收利用，成本較高，不便連續(xù)化生產(chǎn)產(chǎn)物分離純化的問(wèn)題酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，增加分離純化的困難，尤其是大分子產(chǎn)物第2頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化固定化酶概述游離酶的改進(jìn)思路設(shè)計(jì)一種方法，將酶束縛于特殊的相（固定化），使它與整體分開，但仍能進(jìn)行底物和效應(yīng)物的分子交換固定化酶（Immobilizedenzyme）的概念固定在一定載體

上，并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶固定化酶可像一般化學(xué)反應(yīng)中的固相催化劑一樣，既有酶催化特性，又有一般化學(xué)催化劑能回收、反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，可使生產(chǎn)工藝連續(xù)化、自動(dòng)化固定化酶克服游離酶的不足之處，增加酶的穩(wěn)定性，使昂貴的酶能重復(fù)使用第3頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化固定化酶概述固定化生物催化劑固定化酶固定化死細(xì)胞（微生物菌體）固定化活細(xì)胞（增殖細(xì)胞）固定化植物細(xì)胞固定化動(dòng)物細(xì)胞固定化原生質(zhì)體固定化酶是一個(gè)廣義的概念！第4頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化固定化酶概述固定化酶的優(yōu)點(diǎn)提高酶穩(wěn)定性，可反復(fù)或連續(xù)使用，提高使用效率，降低成本易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開，產(chǎn)物溶液無(wú)酶殘留，簡(jiǎn)化提純工藝酶反應(yīng)過(guò)程可嚴(yán)格控制較游離酶更適合多酶反應(yīng)增加產(chǎn)物收率，提高產(chǎn)物質(zhì)量固定化酶的缺點(diǎn)固定化時(shí)酶活有損失增加了生產(chǎn)初始成本只能用于可溶性底物且較小分子，催化過(guò)程受傳質(zhì)因素的限制一般適用于胞外產(chǎn)物，而胞內(nèi)產(chǎn)物分離較困難第5頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化固定化酶概述固定化酶的發(fā)展簡(jiǎn)史1916年，Nelson和Griffin（美）發(fā)現(xiàn)吸附在骨碳上的蔗糖酶仍顯示催化活力——最早的固定化酶（吸附法）1953年，Grubhofer和Schleith（德）用重氮化聚氨基苯乙烯樹脂固定化水解酶（共價(jià)結(jié)合法）1969年，千畑一郎（日）采用固定化氨基?；?，從DL-氨基酸消旋混合物中連續(xù)拆分生產(chǎn)L-氨基酸——固定化酶的首次工業(yè)規(guī)模應(yīng)用，并促使酶工程作為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科從發(fā)酵工程中脫離出來(lái)1971年，第一次國(guó)際酶工程會(huì)議確定“固定化酶”的統(tǒng)一英文名稱為ImmobilizedEnzyme第6頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化固定化酶概述固定化酶的發(fā)展簡(jiǎn)史1973年，日本首次在工業(yè)上成功應(yīng)用固定化E.coli

菌體中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸——首次報(bào)道固定化細(xì)胞的應(yīng)用1976年，法國(guó)用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精1978年，日本用固定化B.subtilis

細(xì)胞生產(chǎn)淀粉酶——固定化細(xì)胞產(chǎn)酶的先例1979年，固定化毛地黃細(xì)胞和長(zhǎng)春花細(xì)胞成功——固定化植物細(xì)胞技術(shù)的突破1982年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸——固定化原生質(zhì)體技術(shù)誕生第7頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化固定化酶概述固定化酶的專著Carrier-boundImmobilizedEnzymes:Principles,ApplicationsandDesignWrittenbyLin-QiuCao《載體固定化酶——原理、應(yīng)用和設(shè)計(jì)》楊晟，袁中一譯，化學(xué)工業(yè)出版社，2008第8頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化本章內(nèi)容酶的固定化酶的固定化方法（重點(diǎn)）固定化酶的性質(zhì)（重點(diǎn)）固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述（補(bǔ)充內(nèi)容）固定化酶的應(yīng)用細(xì)胞的固定化細(xì)胞固定化方法（重點(diǎn)）微生物細(xì)胞固定化植物細(xì)胞固定化動(dòng)物細(xì)胞固定化原生質(zhì)體的固定化第9頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化幾個(gè)概念固定化酶（immobilizedenzyme）水不溶酶（waterinsolubleenzyme）固相酶（solidphaseenzyme）酶的固定化（enzymeimmobilization）制備“固定化酶”的過(guò)程，即將酶或菌體與不溶性載體結(jié)合的過(guò)程固定化采用的酶的類型粗酶，或是提純后的酶結(jié)合在菌體或細(xì)胞碎片上的酶/酶系（固定化菌體）第10頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶制備原則維持酶的催化活性及專一性應(yīng)有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化應(yīng)有最小的空間位阻酶與載體必須結(jié)合牢固穩(wěn)定性好載體具有惰性成本盡可能低固定化酶制備的原則第11頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法第12頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法第13頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法（重點(diǎn)）包埋法物理吸附法離子結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法其他方法固定化方法的比較▲第14頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——包埋法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中的固定化方法多孔載體瓊脂、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚酰胺、火棉膠等第15頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——包埋法凝膠包埋法天然凝膠天然多糖及其衍生物特點(diǎn)：條件溫和，操作簡(jiǎn)便，對(duì)酶活影響小，強(qiáng)度較差合成凝膠合成聚合物材料，如聚丙烯酰胺特點(diǎn)：強(qiáng)度高，對(duì)環(huán)境的耐受性好，但要依靠聚合反應(yīng)進(jìn)行包埋，酶活有一定損失適用性不適用于底物或產(chǎn)物分子很大的酶的固定化第16頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——包埋法聚丙烯酰胺凝膠的合成與酶的包埋——網(wǎng)格型第17頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——包埋法半透膜包埋法（微膠囊）微膠囊材料：聚酰胺膜、火棉膠膜等，孔徑幾埃至幾十埃，比酶分子直徑小適用性：底物和產(chǎn)物都是小分子的酶微膠囊制備方法界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而成膜析出界面聚合法：親水性單體+疏水性單體在界面發(fā)生聚合脂質(zhì)體包埋法：類似于“細(xì)胞質(zhì)膜”式的結(jié)構(gòu)聚電解質(zhì)絡(luò)合法：如海藻酸鈉與聚賴氨酸通過(guò)靜電作用結(jié)合其他方法，如自組裝法等第18頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——包埋法微膠囊制備過(guò)程——界面聚合法第19頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——物理吸附法利用固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使其固定的方法是一種可逆的物理方法結(jié)合力：依靠分子間力結(jié)合，作用力弱，酶易脫落操作條件：條件溫和，酶不發(fā)生變性載體材料無(wú)機(jī)載體：活性炭、多孔玻璃、高嶺土、氧化鋁、羥基磷灰石等有機(jī)載體：多糖類凝膠、大孔吸附樹脂等第20頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——離子結(jié)合法非共價(jià)結(jié)合法的一種，是通過(guò)酶分子與載體之間的靜電引力

相結(jié)合可以采用填充柱式操作特點(diǎn)靜電作用力的強(qiáng)度比范德華力強(qiáng)，因此，通過(guò)離子結(jié)合法得到的固定化酶的穩(wěn)定性好于物理吸附法結(jié)合的酶量具有最大值（飽和性）對(duì)pH值、離子強(qiáng)度變化較敏感，在高鹽條件下不穩(wěn)定，酶容易被洗脫第21頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——離子結(jié)合法所用的載體材料一般為合成的離子交換劑陰離子型：DEAE-纖維素/葡聚糖、TEAE-纖維素等陽(yáng)離子型：羧甲基纖維素（CMC）、Dowex系列陽(yáng)離子交換樹脂（如Dowex-50等）第22頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——共價(jià)結(jié)合法通過(guò)共價(jià)鍵

將酶與載體結(jié)合的固定化方法，是載體結(jié)合法中報(bào)道最多的方法載體材料的選擇天然有機(jī)載體多糖（瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素、甲殼素等）蛋白質(zhì)、細(xì)胞剛性無(wú)機(jī)物：玻璃、陶瓷、硅膠合成聚合物：聚酯、聚酰胺（如聚賴氨酸）、尼龍酶分子中用于共價(jià)連接的基團(tuán)氨基、羧基、巰基、羥基第23頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合過(guò)程（對(duì)照：酶的大分子修飾）載體活化：載體上引入活潑基團(tuán)偶聯(lián)：活化后的載體通過(guò)活潑基團(tuán)與酶分子中的特定基團(tuán)連接

——避免活性中心的基團(tuán)被偶聯(lián)共價(jià)結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)共價(jià)結(jié)合牢固，酶很難脫落，可長(zhǎng)時(shí)間使用缺點(diǎn)共價(jià)結(jié)合可能影響酶的空間構(gòu)象，從而影響酶的催化活性操作較繁瑣第24頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——共價(jià)結(jié)合法載體活化和偶聯(lián)反應(yīng)：(1)含氨基載體第25頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——共價(jià)結(jié)合法載體活化和偶聯(lián)反應(yīng)：(2)含羧基載體（如CMC）琥珀酰亞胺第26頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——共價(jià)結(jié)合法載體活化和偶聯(lián)反應(yīng)：(2)含羧基載體（如CMC）第27頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——共價(jià)結(jié)合法載體活化和偶聯(lián)反應(yīng)：(3)含羥基載體（多糖類）第28頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——共價(jià)結(jié)合法載體活化和偶聯(lián)反應(yīng)：(3)含羥基載體（多糖類）第29頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——共價(jià)結(jié)合法載體活化和偶聯(lián)反應(yīng)：(4)含硅無(wú)機(jī)載體方法一：在載體表面包覆一層有機(jī)層（如瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、白蛋白等），或用表面聚合的方法“鍍上”一層聚合物，再對(duì)包覆后的表面進(jìn)行活化處理方法二：利用有機(jī)硅試劑直接活化硅羥基第30頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法可以用于含酶菌體或菌體碎片的固定化常用的交聯(lián)試劑戊二醛（glutaraldehyde）己二胺（hexamethylenediamine）順丁烯二酸酐（maleicanhydride）第31頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——交聯(lián)法酶分子之間的交聯(lián)酶與水不溶性載體的交聯(lián)（區(qū)別于共價(jià)結(jié)合法）第32頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——交聯(lián)法酶分子間的戊二醛交聯(lián)：氨基的交聯(lián)反應(yīng)交聯(lián)時(shí)的pH值一般與酶的等電點(diǎn)pI相同第33頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——交聯(lián)法酶與載體交聯(lián)：采用交聯(lián)劑將酶分子偶聯(lián)到水不溶性載體上，形成水不溶性的固定化酶第34頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——交聯(lián)法交聯(lián)得到的固定化酶/固定化菌體結(jié)合牢固，酶很難脫落，可長(zhǎng)期使用交聯(lián)反應(yīng)條件劇烈，而且交聯(lián)需酶分子中的多個(gè)基團(tuán)同時(shí)參與，致使酶活力損失較大雙重固定化法包埋+交聯(lián)吸附+交聯(lián)第35頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法——其他方法熱處理法：選擇性熱變性將含目標(biāo)酶的細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)酶變性而保留目標(biāo)酶活性制得的固定化菌體僅適用于熱穩(wěn)定性較好的酶控制溫度和時(shí)間，以防過(guò)熱例：含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌菌體在60～65oC溫度下處理15min，葡萄糖異構(gòu)酶全部固定在菌體內(nèi)熱處理法也可與交聯(lián)法及其他固定化方法聯(lián)用，進(jìn)行雙重固定化第36頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化方法的比較特征載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法離子結(jié)合法物理吸附法共價(jià)結(jié)合法制備易易難中較難結(jié)合力中弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)酶活性高高中或低低高載體再生性較容易容易難不能再生不能再生底物專一性不變不變可變可變不變穩(wěn)定性中低高高高固定化成本低低高中中或高抗微生物能力無(wú)無(wú)無(wú)可能較強(qiáng)第37頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的性質(zhì)——穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性一般會(huì)得到提高，可耐受較高溫度，但無(wú)規(guī)律可循保存穩(wěn)定性好，保存時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)，不易被蛋白酶降解對(duì)變性劑（如尿素、有機(jī)溶劑、鹽酸胍等）的耐受性提高，能保留較高酶活力對(duì)酶抑制劑、對(duì)不同pH值的穩(wěn)定性提高穩(wěn)定性提高第38頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的性質(zhì)——最適溫度與游離酶相比，固定化酶的最適溫度一般變化不大部分酶固定化后最適溫度發(fā)生明顯變化例1：利用重氮化法制備固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，最適溫度比游離酶高出5～10oC例2：色氨酸酶與載體共價(jià)結(jié)合之后，最適溫度比游離酶高5～15oC采用不同方法固定化同一種酶，最適溫度也可能不同例：氨基?；福ㄓ坞x酶最適60oC）用DEAE-葡聚糖凝膠為離子結(jié)合載體得到的固定化酶最適溫度為72oC；用DEAE-纖維素結(jié)合后，最適溫度為67oC；用烷基化共價(jià)結(jié)合后，最適溫度比游離酶有所下降第39頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的性質(zhì)

——最適pH值（難點(diǎn)）酶固定化后最適pH值一般會(huì)發(fā)生變化產(chǎn)物性質(zhì)的影響——積累效應(yīng)酸性產(chǎn)物：最適pH

堿性產(chǎn)物：最適pH

載體性質(zhì)的影響——吸附效應(yīng)帶負(fù)電載體：最適pH

帶正電載體：最適pH取決于微環(huán)境第40頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的性質(zhì)——最適pH值載體性質(zhì)的影響——原因：正負(fù)離子之間的相互吸引作用第41頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的性質(zhì)——底物特異性固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有關(guān)作用于低分子量底物的酶，特異性無(wú)明顯變化（如氨基?；浮⑵咸烟茄趸傅龋┘瓤勺饔糜诖蠓肿拥孜?，又可作用于小分子底物的酶，特異性往往會(huì)發(fā)生變化例：固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對(duì)二肽或短肽的作用保持不變，而對(duì)酶蛋白的降解活力僅為游離酶的3%左右原因載體的空間位阻作用，大分子底物難于接近酶分子第42頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化小結(jié)：影響固定化酶性能的因素酶的因素：主要是活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生變化載體因素：在固定化酶的周圍形成了能對(duì)底物產(chǎn)生立體影響的擴(kuò)散層及靜電的相互作用等引起的變化主要的影響質(zhì)量傳遞效應(yīng)載體產(chǎn)生的（靜態(tài)）和反應(yīng)產(chǎn)生的（動(dòng)態(tài)）質(zhì)子梯度固定化酶的穩(wěn)定性和產(chǎn)率第43頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化影響固定化酶性能的因素——質(zhì)量傳遞效應(yīng)酶的固定化意味著酶的機(jī)動(dòng)性受到精確限制，從而影響溶質(zhì)的運(yùn)動(dòng)性能，這種現(xiàn)象即質(zhì)量傳遞效應(yīng)反應(yīng)速率的降低是由于載體材料表面內(nèi)外的擴(kuò)散限制造成的加強(qiáng)質(zhì)量傳遞的一些措施降低載體顆粒的大小：小顆粒具有較大的比表面積，可以加快分子和載體之間的接觸速率；粒徑下限一般為100m加強(qiáng)反應(yīng)體系的混合：通過(guò)加強(qiáng)攪拌、通氣等方式減小傳質(zhì)阻力酶與載體結(jié)合時(shí)，盡可能結(jié)合在載體的外部，可以減小擴(kuò)散的阻力，對(duì)大分子底物尤其適用第44頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化影響固定化酶性能的因素——質(zhì)子梯度pH遷移現(xiàn)象：固定在離子交換載體上的固定化酶的最適pH可能遷移3～4個(gè)pH單位，這主要是由溶質(zhì)分子的帶電基團(tuán)和帶電載體的靜電相互作用（分配作用）引起的水解反應(yīng)中，當(dāng)固定化酶釋放質(zhì)子時(shí)能觀察到動(dòng)態(tài)的質(zhì)子梯度，如酯的水解；通過(guò)不斷加入堿，使之?dāng)U散入載體，從而減小pH遷移使用具有足夠大容量的緩沖體系來(lái)減少動(dòng)態(tài)pH梯度影響固定化酶性能的因素——固定化酶穩(wěn)定性和產(chǎn)率選擇最有利于固定化酶保持穩(wěn)定的固定化方式第45頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化影響固定化酶動(dòng)力學(xué)特征的主要因素空間效應(yīng)（構(gòu)象效應(yīng)和位阻效應(yīng)）構(gòu)象效應(yīng)：由于酶與載體間的共價(jià)鍵作用，引起酶活性部位發(fā)生扭曲和變形，改變活性部位的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活力下降位阻效應(yīng)（屏蔽效應(yīng)）：載體結(jié)構(gòu)上的某些不良特征致使酶的活性部位難以與底物接觸，給酶活性部位造成空間障礙分配效應(yīng)由于載體的親水性、疏水性、靜電作用等原因，使得底物、產(chǎn)物等在微環(huán)境與宏觀體系間發(fā)生不對(duì)等分配，從而改變反應(yīng)體系的組成平衡，影響酶催化效率擴(kuò)散限制效應(yīng)指底物、產(chǎn)物及其他效應(yīng)物的遷移和轉(zhuǎn)運(yùn)速率受到限制分為外擴(kuò)散限制和內(nèi)擴(kuò)散限制第46頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述第47頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述載體表面固定化酶的動(dòng)力學(xué)外擴(kuò)散限制載體可視為無(wú)孔介質(zhì)，因此無(wú)內(nèi)擴(kuò)散載體顆粒內(nèi)部的擴(kuò)散－反應(yīng)方程同時(shí)存在外擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散問(wèn)題，情況較復(fù)雜，如微膠囊球形顆粒（最常見）圓柱形顆粒薄片形（較少見）第48頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述載體表面固定化酶的傳質(zhì)過(guò)程步驟1：底物從液相主體擴(kuò)散到載體外表面步驟2：底物在載體外表面進(jìn)行反應(yīng)，生成產(chǎn)物步驟3：產(chǎn)物從外表面擴(kuò)散進(jìn)入液相主體Nernst擴(kuò)散膜鄰近載體表面處存在一液體滯流膜（假想），擴(kuò)散阻力集中于該膜內(nèi)，產(chǎn)生相應(yīng)的濃度梯度第49頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述載體表面固定化酶外擴(kuò)散限制時(shí)的表觀反應(yīng)速率底物由液相主體擴(kuò)散到載體外表面的速率為rd——底物從液相主體擴(kuò)散到載體表面的速率，mol·L-1·s-1KL——底物傳質(zhì)系數(shù)，m·s-1a——傳質(zhì)比表面積，m-1c0——底物在液相主體中的濃度，mol·L-1ci——底物在載體表面的濃度，mol·L-1(6-1)第50頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述載體表面固定化酶外擴(kuò)散限制時(shí)的表觀反應(yīng)速率設(shè)底物的酶促反應(yīng)速率符合Michaelis-Menten方程，則其在固定化酶外表面處的表觀反應(yīng)速率ri（mol·L-1·s-1）為穩(wěn)態(tài)條件下，rd=ri，即式(6-3)表示穩(wěn)態(tài)條件下，底物外擴(kuò)散速率等于固定化酶外表面處的反應(yīng)速率(6-2)(6-3)第51頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述載體表面固定化酶外擴(kuò)散限制時(shí)的表觀反應(yīng)速率引入無(wú)因次量則式(6-3)可改寫為cS——無(wú)量綱底物濃度K——無(wú)量綱米氏常數(shù)Da——Damk?hler準(zhǔn)數(shù)（無(wú)量綱）(6-4)(6-5)第52頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述載體表面固定化酶外擴(kuò)散限制時(shí)的表觀反應(yīng)速率解式(6-5)得其中，Da

為一重要參數(shù)（Damk?hler準(zhǔn)數(shù)），其物理意義為當(dāng)Da<<1時(shí)，過(guò)程為反應(yīng)速率控制，ci=c0，ri=r0當(dāng)Da>>1時(shí)，過(guò)程為擴(kuò)散速率控制，ci≈0，ri=KLa·c0(6-6)(6-7)(6-8)第53頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述載體顆粒內(nèi)部固定化酶的傳質(zhì)過(guò)程步驟1：底物從液相主體穿過(guò)液膜擴(kuò)散到載體（膠囊）的外表面步驟2：底物穿過(guò)膠囊微孔，進(jìn)入膠囊內(nèi)部，與酶分子接觸步驟3：底物在膠囊內(nèi)被酶分子催化發(fā)生反應(yīng)，生成產(chǎn)物步驟4：產(chǎn)物穿過(guò)膠囊微孔，排出膠囊步驟5：產(chǎn)物穿過(guò)液膜，從膠囊外表面擴(kuò)散進(jìn)入液相主體第54頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述球形載體顆粒內(nèi)的擴(kuò)散－反應(yīng)方程對(duì)微膠囊的球殼作底物質(zhì)量衡算，在穩(wěn)態(tài)下有整理得到邊界條件為(6-9)(6-10)(6-11)第55頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述球形載體顆粒內(nèi)的擴(kuò)散－反應(yīng)方程底物利用的總速率為將式(6-10)、(6-11)無(wú)因次化，定義整理，并應(yīng)用Michaelis-Menten方程得到(6-12)(6-13)(6-14)(6-15)第56頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述球形載體顆粒內(nèi)的擴(kuò)散－反應(yīng)方程式(6-14)中的

和

分別定義為定義有效因子

：用無(wú)因次量表示為(6-16)(6-17)(6-18)第57頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述球形載體顆粒內(nèi)的擴(kuò)散－反應(yīng)方程對(duì)于固定化酶，米氏方程中的rmax

和Km

不一定知道，因此為避免計(jì)算困難，通過(guò)下述方法消去rmax：對(duì)式(6-19)中的可測(cè)量變量用

定義：由此可知，

只是

和

的函數(shù)，即(6-19)(6-20)(6-21)第58頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述對(duì)球形載體顆粒內(nèi)的擴(kuò)散－反應(yīng)方程的討論——情形1當(dāng)

很大（如

3）且符合Michaelis-Menten方程時(shí)，底物的擴(kuò)散速率要比反應(yīng)速率慢得多，總反應(yīng)速率受擴(kuò)散控制，式(6-10)中的一階導(dǎo)數(shù)項(xiàng)可以忽略，則式(6-10)變?yōu)楦膶憺?6-22)(6-23)第59頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述對(duì)球形載體顆粒內(nèi)的擴(kuò)散－反應(yīng)方程的討論——情形1對(duì)cS

積分可得由式(6-12)、(6-17)得到

的表達(dá)式為式(6-25)為

的解析解(6-24)(6-25)第60頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述對(duì)球形載體顆粒內(nèi)的擴(kuò)散－反應(yīng)方程的討論——情形2當(dāng)cS<<Km

時(shí)，Michaelis-Menten方程分母中的cS

可以忽略，因此轉(zhuǎn)化為一級(jí)動(dòng)力學(xué)：這時(shí)，擴(kuò)散反應(yīng)方程式(6-14)、(6-15)變?yōu)?6-26)(6-27)(6-28)第61頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述對(duì)球形載體顆粒內(nèi)的擴(kuò)散－反應(yīng)方程的討論——情形2方程(6-27)、(6-28)的解析解為由此可得根據(jù)

的定義，且當(dāng)

=0時(shí)，(6-29)(6-30)(6-31)第62頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述對(duì)球形載體顆粒內(nèi)的擴(kuò)散－反應(yīng)方程的討論——情形3當(dāng)cS>>Km

時(shí)，Michaelis-Menten方程轉(zhuǎn)化為零級(jí)動(dòng)力學(xué)：因此擴(kuò)散－反應(yīng)方程式(6-10)變?yōu)榻Y(jié)合邊界條件，方程(6-33)的解析解為式(6-34)滿足的條件為cS

0(6-32)(6-33)(6-34)第63頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)述對(duì)球形載體顆粒內(nèi)的擴(kuò)散－反應(yīng)方程的討論——情形3要保證cS

0，因此從r=R

向內(nèi)直至臨界半徑Rc(此時(shí)cS

=0)，式(6-34)均成立。臨界半徑有下式給出：此時(shí)的有效因子

表示為顯然，當(dāng)Rc=0時(shí)，

=1(6-35)(6-36)第64頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用在工業(yè)上，固定化酶主要用于手性合成、手性拆分等有機(jī)化合物的合成酶?jìng)鞲衅骷捌鋺?yīng)用環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床診斷等固定化酶在藥物控釋載體方面的應(yīng)用利用固定化酶穩(wěn)定性較好的特點(diǎn)延長(zhǎng)藥用酶的半衰期，增大藥用酶的生物利用度第65頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——工業(yè)應(yīng)用氨基?；福╝minoacylase，EC3.5.1.14）世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶1969年，日本田邊制藥公司用DEAE-葡聚糖凝膠通過(guò)離子結(jié)合法固定化氨基?；福梢源呋阴０被岬拿撘阴７磻?yīng)，用于拆分DL-乙酰氨基酸外消旋體：采用固定化氨基?；?，生產(chǎn)成本只有游離酶的60%第66頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——工業(yè)應(yīng)用DL-乙酰氨基酸的工業(yè)化連續(xù)拆分工藝第67頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——工業(yè)應(yīng)用葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphateisomerase,EC5.3.1.9)全世界生產(chǎn)規(guī)模最大的固定化酶，1973年即實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)將培養(yǎng)好的含葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的放線菌細(xì)胞60～65oC熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶催化葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)化生成果糖-6-磷酸，可用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿第68頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——工業(yè)應(yīng)用天冬氨酸酶（aspartase，EC4.3.1.1）1973年，日本用聚丙烯酰胺凝膠為載體，將具有高活性天冬氨酸酶的E.coli

菌體包埋制得固定化酶，將延胡索酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-天冬氨酸：1978年，改用角叉菜膠為載體制備固定化天冬氨酸酶第69頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——工業(yè)應(yīng)用青霉素?；福╬enicillinacylase，EC3.5.1.11）在醫(yī)藥工業(yè)上廣泛使用的一種酶，1973年已用于工業(yè)化生產(chǎn)，用于制造半合成青霉素和頭孢菌素第70頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——工業(yè)應(yīng)用延胡索酸酶（fumarase，EC4.2.1.2）用聚丙烯酰胺凝膠包埋含有延胡索酸酶的產(chǎn)氨短桿菌菌體，于1974年實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，從延胡索酸生產(chǎn)蘋果酸1977年以后，改用角叉菜膠包埋具有高活性延胡索酸酶的黃色短桿菌菌體，其L-蘋果酸產(chǎn)率比前者提高5倍第71頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——工業(yè)應(yīng)用其他酶的工業(yè)應(yīng)用實(shí)例

-半乳糖苷酶固定化

-半乳糖苷酶于1977年實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，催化乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，用于制造低乳糖乳品天冬氨酸-

-脫羧酶將含此酶的假單孢菌菌體用凝膠包埋法制得固定化酶，催化L-天冬氨酸脫羧基生成L-丙氨酸脂肪酶已有多種脂肪酶用于工業(yè)化生產(chǎn)，可催化甘油三酯水解以及轉(zhuǎn)酯反應(yīng)、酯化反應(yīng)、多肽合成、手性拆分等多種反應(yīng)，用途廣泛第72頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——酶?jìng)鞲衅髅競(jìng)鞲衅鳎河晒潭ɑ概c能量轉(zhuǎn)換器組合而成的傳感裝置，屬于生物傳感器的一種酶電極——最常見的酶?jìng)鞲衅饔晒潭ɑ概c各種電極密切結(jié)合的傳感裝置1962年Clark和Lyons提出酶電極模型1967年Updike和Hicks首先制得酶電極，用于葡萄糖的定量分析第73頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——酶?jìng)鞲衅魃飩鞲衅鳎╞iosensor）概述用生物活性材料（酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜等）與物理、化學(xué)傳感器有機(jī)結(jié)合，是一種先進(jìn)的檢測(cè)方法與監(jiān)控手段，也是物質(zhì)分子水平的快速、微量分析方法我國(guó)的生物傳感器的研究起步于70年代末期，早期研究普遍采取氧電極作生物反應(yīng)中的換能器，以葡萄糖氧化酶為活性材料第74頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——酶?jìng)鞲衅魃飩鞲衅鞯膽?yīng)用第75頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——酶?jìng)鞲衅魃飩鞲衅鞯慕M成和工作原理傳感器能將一種被測(cè)信號(hào)（參量）轉(zhuǎn)換成一種可輸出信號(hào)，由感受器、換能器、電子線路組成選擇測(cè)定的基礎(chǔ)——以分子識(shí)別部分去識(shí)別被測(cè)目標(biāo)，是可以引起某種物理變化或化學(xué)變化的主要功能元件這些分子識(shí)別功能物質(zhì)通過(guò)識(shí)別過(guò)程可與被測(cè)目標(biāo)結(jié)合成復(fù)合物（如抗體和抗原的結(jié)合，酶與底物的結(jié)合等）在設(shè)計(jì)生物傳感器時(shí)，選擇適合于測(cè)定對(duì)象的識(shí)別功能物質(zhì)，要考慮到所產(chǎn)生的復(fù)合物的特性根據(jù)分子識(shí)別功能物質(zhì)制備的敏感元件所引起的化學(xué)變化或物理變化，選擇合適的換能器第76頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——酶?jìng)鞲衅骼浩咸烟茄趸鸽姌O用聚丙烯酰胺凝膠包埋葡萄糖氧化酶，制成厚度為20～50m的酶膜，再與氧電極及聚四氟乙烯高分子薄膜緊密結(jié)合，組成葡萄糖氧化酶電極使用時(shí)，使酶電極進(jìn)入樣品溶液中，樣品中的葡萄糖擴(kuò)散到酶膜中，在氧氣的存在下被酶催化氧化生成葡萄糖酸內(nèi)酯，由氧電極測(cè)得的氧濃度變化，可知葡萄糖濃度第77頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——酶?jìng)鞲衅骼呵嗝顾兀；┟鸽姌O利用固定化青霉素?；傅拿改づcpH電極結(jié)合而成將青霉素?；腹潭ㄔ诰郾０纺z或光交聯(lián)樹脂膜內(nèi)，然后緊貼在玻璃電極上制成酶電極浸入含青霉素的溶液中時(shí)，青霉素?；复呋嗝顾厮馍砂被嗝雇樗?，導(dǎo)致溶液中H+

濃度增加，可通過(guò)pH電極檢測(cè)第78頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——藥物控釋載體藥物在臨床上應(yīng)用不順利的原因藥物在體內(nèi)被降解，如口服蛋白類藥物被胃酸或消化道的蛋白酶所分解藥物易被肝和血液中的酶系統(tǒng)清除，需反復(fù)注射給藥藥物使用引起機(jī)體本身毒副作用某些藥物親水性強(qiáng)，難以透過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)類藥物容易引起免疫反應(yīng)很多藥物穩(wěn)定性差，不易儲(chǔ)存解決：開發(fā)藥物新劑型，開發(fā)新型的藥物控釋載體第79頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——藥物控釋載體將藥物（藥用酶）與聚合物載體偶聯(lián)或固定于某種聚合物載體上，成為載體藥物聚合物修飾如：羧甲基殼聚糖修飾修飾天冬酰胺酶凝膠包埋用生物相容性好的高分子聚合物與藥物混合制成含有藥物的凝膠，植入體內(nèi)特定部位，達(dá)到緩釋的效果例：將能夠表達(dá)促紅細(xì)胞生成素（EPO）的工程細(xì)胞株包埋后植入組織中，達(dá)到緩釋EPO的效果第80頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化酶的固定化固定化酶的應(yīng)用——藥物控釋載體載體藥物微球制劑用聚合物微球包埋或化學(xué)偶聯(lián)藥物制成微球制劑，與靶細(xì)胞接觸，通過(guò)胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)例如，以生物可降解材料包埋人生長(zhǎng)激素，注射后不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)脂質(zhì)體磷脂雙分子層在水溶液中自發(fā)形成的超微型中空小泡，和細(xì)胞質(zhì)膜具有類似的“雙層膜”結(jié)構(gòu)第81頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化固定化細(xì)胞的概念固定在載體上，并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞稱為“固定化細(xì)胞”固定化細(xì)胞是活的細(xì)胞，具有所有的細(xì)胞生理活動(dòng)特征細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞均可制成固定化細(xì)胞通過(guò)各種方法，將細(xì)胞固定在水不溶性載體上，制備固定化細(xì)胞的過(guò)程稱為“細(xì)胞固定化”第82頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化固定化細(xì)胞的主要特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)可增殖，可獲得高度密集的工程菌集合體，細(xì)胞密度大發(fā)酵穩(wěn)定性好，可長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)連續(xù)使用，可采用反應(yīng)柱連續(xù)生產(chǎn)保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境，更穩(wěn)定，對(duì)多步催化轉(zhuǎn)化優(yōu)勢(shì)更加明顯，無(wú)需輔酶再生缺點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)多酶的存在會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體等都存在擴(kuò)散限制作用載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性第83頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化固定化細(xì)胞的分類第84頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化細(xì)胞固定化方法固定化酶和固定化細(xì)胞都是以酶的應(yīng)用為目的，其制備方法和應(yīng)用方法也基本相同但應(yīng)用于酶固定化的某些方法通常不用于細(xì)胞的固定化，如化學(xué)交聯(lián)法等細(xì)胞固定化的常用方法吸附法包埋法其他方法——自凝集法第85頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化細(xì)胞固定化方法——吸附法吸附劑：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、金屬絲網(wǎng)、微載體和中空纖維等吸附法是制備固定化動(dòng)物細(xì)胞的主要方法很多動(dòng)物細(xì)胞具有貼壁依賴性，能夠很好地附著在容器壁、微載體等載體表面，黏附較牢固很多微生物細(xì)胞在載體表面不能牢固結(jié)合，容易脫落利用中空纖維制備固定化植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞，具有較好的應(yīng)用前景，但成本較高第86頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化細(xì)胞固定化方法——吸附法吸附法固定化細(xì)胞實(shí)例細(xì)胞載體用途備注酵母多孔陶瓷或塑料酒精、啤酒生產(chǎn)pH3～5條件下吸附活性污泥硅藻土、多孔玻璃、陶瓷或塑料有機(jī)廢水處理沉積吸附霉菌多孔塑料、金屬絲網(wǎng)有機(jī)酸和酶生產(chǎn)菌絲體植物細(xì)胞中空纖維、泡沫塑料生產(chǎn)色素、香精、藥物和酶等動(dòng)物細(xì)胞容器壁、微載體或中空纖維外壁生產(chǎn)藥用蛋白貼壁依賴型細(xì)胞第87頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化細(xì)胞固定化方法——包埋法凝膠包埋法是應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞固定化方法，適用于各種細(xì)胞（微生物、植物、動(dòng)物）細(xì)胞被包埋后，被限制在凝膠微孔內(nèi)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖和代謝凝膠載體天然材料——瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠合成材料——聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂……第88頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化細(xì)胞固定化方法——包埋法載體操作過(guò)程成型條件特點(diǎn)或注意事項(xiàng)瓊脂瓊脂水溶液冷卻至48~55oC加入細(xì)胞懸浮液迅速混勻趁熱分散在預(yù)冷的甲苯或四氯乙烯液中機(jī)械強(qiáng)度較差、氧氣、底物、產(chǎn)物擴(kuò)散較困難海藻酸鈣海藻酸鈉水溶液滅菌冷卻后與細(xì)胞或孢子懸浮液混勻用注射器或滴管滴入CaCl2

溶液操作簡(jiǎn)便，條件溫和對(duì)細(xì)胞無(wú)毒；磷酸鹽會(huì)破壞凝膠結(jié)構(gòu)角叉菜膠水溶液滅菌冷卻至35~50oC與細(xì)胞懸浮液混勻趁熱滴到預(yù)冷的KCl溶液中具備一定機(jī)械強(qiáng)度，操作簡(jiǎn)便，通透性能較好，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害第89頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化細(xì)胞固定化方法——包埋法載體操作過(guò)程成型條件特點(diǎn)或注意事項(xiàng)明膠明膠懸浮液加熱溶化、滅菌，冷卻至35oC以上，與細(xì)胞懸浮液混勻冷卻凝集后做成所需的形狀機(jī)械強(qiáng)度不夠時(shí)用戊二醛交聯(lián)劑交聯(lián)丙烯酰胺+甲叉丙烯酰胺兩種單體與細(xì)胞懸浮液混勻加入過(guò)硫酸銨和TEMED混合后靜置聚合機(jī)械強(qiáng)度高；丙烯酰胺單體對(duì)細(xì)胞有一定毒害，盡量縮短聚合時(shí)間光交聯(lián)樹脂預(yù)聚物+光敏劑+水加熱至50oC溶解與細(xì)胞懸浮液混勻攤成薄片，UV照射3min左右，無(wú)菌條件下切成塊機(jī)械強(qiáng)度高，固定化快，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等無(wú)明顯影響第90頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化細(xì)胞固定化方法——自凝集法自凝集法是依靠細(xì)胞自身的絮凝作用制備固定化細(xì)胞，是細(xì)胞特有的固定化方法（尤其是絲狀微生物），也稱“無(wú)載體法”某些放線菌和絲狀真菌在液體培養(yǎng)時(shí)，由于振蕩，自身菌絲體間容易相互纏繞而發(fā)生自凝集，形成（微）球狀菌落有時(shí)需要加入助凝劑例如：含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌細(xì)胞經(jīng)檸檬酸處理，再加絮凝劑脫乙酰甲殼素，獲得的菌體干燥后即得固定化細(xì)胞第91頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化微生物細(xì)胞固定化——特點(diǎn)固定化微生物細(xì)胞保持了細(xì)胞完整結(jié)構(gòu)和天然狀態(tài)，可以進(jìn)行正常的生長(zhǎng)繁殖固定化微生物細(xì)胞完整地保持著細(xì)胞內(nèi)原有的酶系、輔酶體系和代謝調(diào)控系統(tǒng)，可以按照原有的代謝途徑進(jìn)行所需產(chǎn)物的合成與調(diào)控穩(wěn)定性好，可反復(fù)使用有效地提高細(xì)胞密度由于有載體的保護(hù)，基因工程菌的穩(wěn)定性得到較大提高第92頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化微生物細(xì)胞固定化——應(yīng)用生化產(chǎn)品的生產(chǎn)：能分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物含酒精的產(chǎn)品：各種酒的制造氨基酸：Glu、Lys、Arg、Trp、Ile等有機(jī)酸：蘋果酸、檸檬酸、乳酸、葡萄糖酸等酶：主要是水解酶類，如淀粉酶、蛋白酶等輔酶：輔酶A、NADH、NADPH、ATP等抗生素（種類繁多）其他工業(yè)應(yīng)用甾體藥物生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化廢水處理……第93頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化微生物細(xì)胞固定化——應(yīng)用微生物傳感器由固定化微生物細(xì)胞與各種能量轉(zhuǎn)換器密切結(jié)合而成的傳感裝置呼吸活性測(cè)定型利用固定在高分子膜上的微生物細(xì)胞的呼吸作用，通過(guò)測(cè)定測(cè)定O2

的消耗和CO2

的生成，從而確定被測(cè)物質(zhì)的量由固定化微生物膜和氧電極/CO2

電極結(jié)合而成電極活性測(cè)定型利用固定在膜上的微生物細(xì)胞的新陳代謝作用，通過(guò)測(cè)定電極活性物質(zhì)的量的變化，從而確定樣品中欲測(cè)物質(zhì)的含量由固定化微生物膜與生物燃料電池、離子選擇電極和氣體電極等組成第94頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化微生物細(xì)胞固定化——應(yīng)用微生物電極及其特性（表1）被檢測(cè)物微生物種類電極檢測(cè)范圍(mg·mL-1)感應(yīng)時(shí)間(min)葡萄糖熒光假單孢桿菌氧電極3×10-3～2×10-210糖乳酸發(fā)酵短桿菌氧電極2×10-2～10-110乙酸腌菜絲孢酵母氧電極10-2～2×10-115氨硝化細(xì)菌氧電極3×10-3～5×10-25甲醇（未鑒定）氧電極3×10-3～10-215乙醇腌菜絲孢酵母氧電極3×10-3～10-215制霉菌素啤酒酵母氧電極8×10-3～10-160致癌物枯草芽孢桿菌氧電極10-3～10-260BOD多孢絲孢酵母氧電極3×10-3～10-210甲烷甲基單孢菌氧電極2×10-4～10-10.5第95頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化微生物細(xì)胞固定化——應(yīng)用微生物電極及其特性（表2）被檢測(cè)物微生物種類電極檢測(cè)范圍(mg·mL-1)感應(yīng)時(shí)間(min)細(xì)胞群體/燃料電池10-3～10815維生素B1發(fā)酵乳桿菌燃料電池10-6～10-5(mL-1)360甲酸丁酸羧菌燃料電池10-2～210頭孢菌素弗氏檸檬酸桿菌pH電極6×10-2～5×10-110煙酸阿拉伯糖乳桿菌pH電極5×10-3～10-160精氨酸屎鏈球菌氨電極10-2～2×10-110天冬氨酸短桿菌氨電極5×10-4～10-15賴氨酸大腸桿菌CO2

電極10-2～10-15谷氨酸大腸桿菌CO2

電極8×10-3～10-15谷氨酰胺黃色疊球菌氨電極2×10-2～15第96頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化植物細(xì)胞固定化植物細(xì)胞固定化技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)天然產(chǎn)物提供了新的途徑1979年，海藻酸鈣固定化毛地黃細(xì)胞和長(zhǎng)春花細(xì)胞成功植物細(xì)胞體積大，對(duì)剪切力較敏感，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，易聚集成團(tuán)，發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性較差，產(chǎn)率不高，對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行固定化之后，可以改進(jìn)上述問(wèn)題植物細(xì)胞固定化之后，可以采用連續(xù)培養(yǎng)的操作方式，能夠連續(xù)地生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物第97頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化植物細(xì)胞固定化——中空纖維固定化將植物細(xì)胞置于中空纖維的外壁與外殼容器的內(nèi)壁之間，讓細(xì)胞吸附在中空纖維外壁上培養(yǎng)液及O2

可在中空纖維的管內(nèi)流動(dòng)，并透過(guò)半透膜管壁傳遞給外壁上的細(xì)胞經(jīng)植物細(xì)胞代謝后的產(chǎn)物又通過(guò)中空纖維膜進(jìn)入管內(nèi)，隨培養(yǎng)液流出優(yōu)點(diǎn)近乎于植物體內(nèi)物質(zhì)的傳遞與交換方式，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝的進(jìn)行缺點(diǎn)有時(shí)纖維管會(huì)因阻塞而影響傳質(zhì)成本較高，難以大規(guī)模應(yīng)用第98頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化植物細(xì)胞固定化——應(yīng)用（表1）植物細(xì)胞固定化方法產(chǎn)物罌粟藻酸鹽可待因酮

可待因澳洲茄聚苯氧化物甾類糖苷生物堿海巴戟藻酸鹽蒽醌辣椒泡沫塑料辣椒素薰衣草藻酸鹽藍(lán)色素甜菜尼龍片

-花青素大豆中空纖維酚類唐松草藻酸鹽小檗堿甘草藻酸鹽反查爾酮煙草Xanthan/聚丙烯酰胺生物堿藻酸鹽煙堿第99頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化植物細(xì)胞固定化——應(yīng)用（表2）植物細(xì)胞固定化方法產(chǎn)物長(zhǎng)春花瓊脂糖Cathenamine

阿嗎堿異構(gòu)物瓊脂或明膠色氨酸

阿嗎堿藻酸鹽色氨酸

阿嗎堿蛇根堿藻酸鹽/聚丙烯酰胺阿嗎堿Xanthan/聚丙烯酰胺蛇根堿毛地黃藻酸鹽毛地黃毒苷

地高辛甲基毛地黃毒苷

甲基地高辛胡蘿卜藻酸鹽毛地黃毒苷配基

杠柳毒苷配基芰毒配質(zhì)

5

-羥基芰毒配基薄荷聚丙烯酰胺薄荷酮

新薄荷醇長(zhǎng)葉薄荷酮

異薄荷酮第100頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化動(dòng)物細(xì)胞固定化應(yīng)用生物制藥：多肽類激素、細(xì)胞因子、疫苗、藥用蛋白的生產(chǎn)組織工程：人造皮膚、軟骨，以及其他組織和器官動(dòng)物細(xì)胞游離培養(yǎng)存在的問(wèn)題動(dòng)物細(xì)胞體積大，沒(méi)有細(xì)胞壁保護(hù)，培養(yǎng)過(guò)程易受剪切力等外界因素影響生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)基組分復(fù)雜、昂貴，產(chǎn)率不高解決方法——?jiǎng)游锛?xì)胞固定化貼壁依賴型細(xì)胞：細(xì)胞容易附著在載體表面生長(zhǎng)，形成細(xì)胞集落，傳代培養(yǎng)時(shí)需用蛋白酶消化懸浮細(xì)胞：非貼壁依賴型，一般無(wú)附著特性第101頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞的固定化動(dòng)物細(xì)胞固定化——貼壁依賴型細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶法玻璃或塑料材質(zhì)，內(nèi)表面經(jīng)處理后帶電荷，增強(qiáng)細(xì)胞的黏附能力比表面積較小，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖受到限制；可在轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)加進(jìn)列管或多層平板，增大黏附面積微載體由帶負(fù)電表面電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等制成，直徑一般為10～200m比表面積大，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和物質(zhì)傳遞有利中空纖維操作方式同植物細(xì)胞固定化酶和細(xì)胞的固定化第102頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化細(xì)胞的固定化動(dòng)物細(xì)胞固定化——懸浮細(xì)胞凝膠包埋瓊脂糖凝膠包埋：瓊脂糖加熱融化，冷卻后與動(dòng)物細(xì)胞混合，分散在石蠟油中，降溫至10oC左右，得到微球狀固定化細(xì)胞海藻酸鈣凝膠包埋：動(dòng)物細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合，用注射器將其滴到CaCl2

溶液中，形成固定化細(xì)胞血纖維蛋白包埋：動(dòng)物細(xì)胞與血纖維蛋白原混合，加入凝血酶，使血纖維素蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的血纖維蛋白半透膜包埋海藻酸鈣/聚賴氨酸（ALG-PLL）包埋：動(dòng)物細(xì)胞用海藻酸鈣凝膠包埋后，用聚賴氨酸處理，在膠囊外層包覆聚賴氨酸膜，而后浸泡在檸檬酸鈉溶液中，使海藻酸鈣凝膠溶解第103頁(yè),共113頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和細(xì)胞的固定化原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體固定化的意義固定化原生質(zhì)體固定在載體上，并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行新陳代謝的原生質(zhì)體固定化細(xì)胞的缺陷：細(xì)胞壁對(duì)傳質(zhì)的阻礙只能夠生產(chǎn)胞外酶和其它能夠分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物由于載體的影響，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和產(chǎn)物的擴(kuò)散受到一定的限制