沙門氏菌和志賀氏菌的檢測

關于沙門氏菌和志賀氏菌的檢測腸道感染細菌是通過糞-口傳播途徑進行傳播的一類細菌。主要包括腸桿菌科細菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、幽門螺桿菌等。腸桿菌科中與醫(yī)學有關的包括：埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、變形桿菌屬等。概述腸道感染細菌第2頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

腸桿菌科

共同特性

相似的形態(tài)染色簡單的培養(yǎng)條件活潑的生化反應

G-小桿菌，有鞭毛(痢疾桿菌外)

菌毛，某些有莢膜，無芽胞需氧或兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高

致病菌非致病菌

乳糖發(fā)酵實驗陰性陽性

SS瓊脂培養(yǎng)基（含膽鹽、乳糖、中性紅等）第3頁,共61頁，2024年2月25日，星期天4、抗原構造復雜

鞭毛抗原（H）IgG菌體抗原（O）IgMK或Vi抗原第4頁,共61頁，2024年2月25日，星期天溶原性轉換生化反應性變異通過耐藥性變異毒力性變異轉導接合5、抵抗力：不強6、易變異：通過引起第5頁,共61頁，2024年2月25日，星期天沙門菌檢測美國細菌學家Salmon與Smith于1885年分離出豬霍亂沙門菌。1990年為紀念Salmon，定名這類細菌為沙門菌屬。沙門菌是腸桿菌科的重要致病菌。包括傷寒、副傷寒甲、乙、丙型，腸炎，鼠傷寒等沙門菌，現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)2324個血清型。在世界各地的食物中毒中，沙門菌食物中毒常占首位或第二位。規(guī)定在藥品和食品中不得檢出沙門菌。美國每年報道病例45000個左右，實際數(shù)量可能多達200-300萬。傷寒每年400-500例。第6頁,共61頁，2024年2月25日，星期天生物學特性1.形態(tài)兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌，（0.4-0.9）μm×(1-3)μm，無芽孢，周生鞭毛，一般無莢膜，少數(shù)有包膜。光滑型的細菌大小均勻，粗糙型則大小不一，長短不一。第7頁,共61頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)和生化反應兼性厭氧，最適生長溫度35～37℃，最適生長PH為6.8～7.8.本菌屬對營養(yǎng)的要求不高，在普通營養(yǎng)瓊脂上生長的菌落為圓形、光滑、濕潤，半透明，邊緣整齊的菌落，有時可出現(xiàn)粗糙型的菌落。在腸道選擇性培養(yǎng)基上菌落小至中等，透明或半透明，乳糖不發(fā)酵，與志賀菌的菌落相似，有些能產生硫化氫的菌株，在SS瓊脂上形成中心黑色的菌落。第8頁,共61頁，2024年2月25日，星期天抗原構造菌體抗原（o）：不被乙醇、0.1%石炭酸所破壞。與特異性抗血清呈顆粒狀凝集，形成慢，不易搖散。現(xiàn)已知有50多種，多數(shù)沙門菌含有兩種以上的O抗原，有的O抗原是一種菌獨有的，有的是幾種菌共有的，凡含有共同特異性抗原成分的血清型歸為一個群，可將沙門菌化分為42群，按A-Z排列，Z以后的順序以O51-O67表示。引起人類沙門菌病的95%以上都在A-F6個群內。第9頁,共61頁，2024年2月25日，星期天H抗原：為不穩(wěn)定的蛋白質抗原，加熱或用乙醇處理均被破壞。沙門菌H抗原有兩個相,第一相特異性較高稱特異相,用小寫英文字母a、b、c表示，直至z，z以衙用z加阿拉伯數(shù)字表示，如z1、z2、z3等，第二相抗原為沙門菌共有，稱非特異相，直接用1、2、3表示。同時有第一相和第二相H抗原的細菌稱為雙相菌，僅有一相者稱單相菌。H抗原是定型的依據(jù)，其刺激機體產生的抗體以IgG為主，與相應的抗血清呈絮狀反應。第10頁,共61頁，2024年2月25日，星期天表面抗原：在沙門菌屬中已被證實的表面抗原有Vi抗原、M抗原、5抗原三種Vi抗原：是一種不耐熱的酸性多糖聚合物，加熱60℃30分鐘或經(jīng)石炭酸處理即被破壞，經(jīng)人工培養(yǎng)基傳代后也易失去。新分離的傷寒及副傷寒沙門菌常帶有此抗原。Vi抗原位于菌體的最表層，有抗吞噬及保護細菌免受相應抗體和補體的溶菌作用。Vi抗原存在時可阻止O抗原與相應抗體發(fā)生凝集，故在沙門血清學鑒定時應加以注意，需事先加熱破壞Vi抗原之后，O抗原才得以與相應的O抗血清發(fā)生凝集。帶Vi抗原的沙門菌亦可用Vi噬菌體進行分型，有助于流行病學調查和追蹤傳染源。第11頁,共61頁，2024年2月25日，星期天M抗原：粘液抗原，在菌型鑒定上無特殊意義。5抗原：第12頁,共61頁，2024年2月25日，星期天4.抵抗力不強，加熱60℃1h，或65℃15~20min即被殺死。在水中能存活2~3周，在糞便中可存活1~2月。對膽鹽和煌綠等染料有抵抗力。因此可用于制備沙門菌的選擇培養(yǎng)基。第13頁,共61頁，2024年2月25日，星期天5.變異性S-R變異:自臨床標本初次分離的菌株一般都是光滑型，經(jīng)人工培養(yǎng)，傳代后可逐漸變民粗糙型菌落。此時菌體表面的特異多糖抗原喪失，在生理鹽水中可出現(xiàn)自凝。H-O變異：是指有鞭毛的沙門菌失去鞭毛的變異位相變異：具有雙相H抗原的沙門菌變成只有其中某一相的單相菌，稱位相變異。在沙門菌血清學分型時，如遇到單相菌，特別是只有第Ⅱ相（非特異相）抗原時，需反復分離和誘導出第Ⅰ相（特異相）抗原方可作出鑒定。V-W變異：是指沙門菌失去Vi抗原的變異。初次分離得到的具有Vi抗原、O抗原不凝集的沙門菌稱V型菌；Vi抗原部分喪失，與O抗原血清發(fā)生凝集又可與Vi抗血清凝集者稱VW型菌。Vi抗原完全喪失，與O抗原血清發(fā)生凝集又與Vi抗血清不凝集者稱W型菌。V-W變異的過程是V型菌經(jīng)人工培養(yǎng)，逐漸喪失部分Vi抗原而成為VW型，進而喪失全部Vi抗原而成為W型菌。第14頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

二、致病性與免疫性

致病物質：

1.侵襲力：菌毛幫助細菌黏附腸粘膜上皮細胞

Vi抗原可阻斷相應抗體和補體的作用，抵抗吞噬細胞的吞噬作用。內毒素：可激活補體系統(tǒng)、吸引白細胞，引起腸道炎癥，吸收入血可引起全身中毒，發(fā)熱、白細胞減少、中毒性休克。腸毒素：類似于大腸桿菌腸毒素。第15頁,共61頁，2024年2月25日，星期天2.所致疾病

1)腸熱癥（傷寒和副傷寒）：由傷寒沙門菌、甲、乙、丙型副傷寒沙門菌引起。

2）食物中毒（急性胃腸炎）：由鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、腸炎沙門菌引起，有發(fā)熱、惡心嘔吐、水樣瀉，嚴重者致脫水、休克、腎衰而死亡（主見于嬰兒、老人等），但，大多2~3天自愈。

3）敗血癥：常由豬霍亂沙門菌、丙型副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等引起。有高熱、寒戰(zhàn)、貧血等嚴重癥狀。多見于兒童及免疫力低下者。

免疫性：主要依靠細胞免疫，牢固。

第16頁,共61頁，2024年2月25日，星期天二、微生物學檢查標本采集

根據(jù)疾病的類型、病情和病程的不同分別采集不同的標本。分離培養(yǎng)原則上于發(fā)病第1周采血，第2周取糞便或尿液，全程均可作骨髓培養(yǎng)。血清學診斷應在病程的不同時期分別采集2～3份標本。第17頁,共61頁，2024年2月25日，星期天血液、骨髓糞、尿、可疑食物增菌培養(yǎng)（膽鹽葡萄糖肉湯）分離培養(yǎng)（SS、EMB、MAC、血平板）增菌培養(yǎng)(SF、CN、TT)37℃18~24h可疑菌落初步鑒定（涂染檢、KIA、MIU、IMViC等生化反應、A-F多價血清凝集）

最終鑒定腸道桿菌系統(tǒng)生化反應單價因子血清定血清型37℃18~24h37℃18~24h37℃18~24h檢驗程序第18頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共61頁，2024年2月25日，星期天檢驗方法直接檢測將病人標本或肉湯增菌培養(yǎng)物直接用商品乳膠凝集試劑進行試驗，可快速檢出沙門菌和志賀菌。第20頁,共61頁，2024年2月25日，星期天檢驗方法分離培養(yǎng)常規(guī)的腸道選擇鑒別培養(yǎng)基能有效地分離沙門菌。常用腸道鑒別培養(yǎng)基（MAC或EMB）和選擇培養(yǎng)基（SS等），強選擇性培養(yǎng)基（孔雀綠和亞硫酸鉍等）僅適用范圍于暴發(fā)流行時。第21頁,共61頁，2024年2月25日，星期天分離培養(yǎng)（1）血液和骨髓：血液5ml或骨髓液0.5ml膽汁葡萄糖肉湯或胰化蛋白大豆肉湯中，35-37℃孵育，若有生長（多在2~4日內出現(xiàn)）則移種至血瓊脂平板和SS培養(yǎng)基中。（2）糞便或肛拭：最好作床邊接種，或用卡-布（Cary-Blair）運送培養(yǎng)基。（3）尿液和體液：無菌采集的中段尿、膽汁、腦脊液、胸腹水等經(jīng)3000r/min離心沉淀后接種于增菌液、血瓊脂和腸道選擇培養(yǎng)基。（4）食物等固體物質：磨碎后加10ml無菌生理鹽水混勻，接種于增菌液和腸道選擇培養(yǎng)基。第22頁,共61頁，2024年2月25日，星期天鑒定與分型——生化鑒定

疑為沙門菌的可疑菌落可用手工或商品生化反應進行生化鑒定，常用三糖鐵(TSI)瓊脂和賴氨酸瓊脂來初步鑒定。本菌在TSI上典型的生化模式為：堿/酸，葡萄糖產氣，硫化氫陽性（K/A++）。少數(shù)菌株為乳糖發(fā)酵型，呈（A/A），這些菌株的硫化氫往往陰性。在賴氨酸鐵瓊脂上的典型生化模式為K/K和硫化氫陽性，但亦存在賴氨酸和硫化氫陰性的菌株（副傷寒A沙門菌）。初步反應疑為沙門菌的菌株必須經(jīng)全面生化反應證實和血清學分型后才能發(fā)出報告。第23頁,共61頁，2024年2月25日，星期天乳糖:蔗糖:葡萄糖=10:10:1以酚紅作指示劑當待檢菌發(fā)酵乳糖或蔗糖時，產酸量多，使整個培養(yǎng)基均呈黃色；如僅發(fā)酵葡萄糖，則產酸少，斜面由于細菌生長分解蛋白胨而釋放氨，酚紅顯堿性紅色、而底層黃色細菌對培養(yǎng)基中硫代硫酸鈉或硫酸鈉、亞硫酸鈉的還原作用，生成硫化氫。硫化氫遇硫酸亞鐵或檸檬酸鐵銨產生不溶性黑色硫化亞鐵。生化反應初步鑒別：三糖鐵瓊脂第24頁,共61頁，2024年2月25日，星期天斜面紅色、底層黃色，出現(xiàn)部分黑色或全部黑色斜面紅色、底層黃色，無黑色斜面、底層均黃色，出現(xiàn)部分黑色或全部黑色

除沙門菌外，變形桿菌、檸檬酸鹽菌、志賀菌等也可出現(xiàn)上述反應。吲哚試驗：陰性第25頁,共61頁，2024年2月25日，星期天志賀氏菌都能分解葡萄糖，產酸不產氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產生H2S。

大腸桿菌，能分解葡萄糖產酸產氣，大多數(shù)能分解乳糖，不產生H2S。

沙門氏菌，能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖、蔗糖，大多數(shù)產生H2S，多數(shù)產氣。

下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌？第26頁,共61頁，2024年2月25日，星期天沙門菌屬細菌的初步鑒定MIU觸酶

氧化酶硝酸鹽還原診斷血清凝集KIA斜面底層產氣H2S甲型副傷寒KA+-/++--+—+A~F多價+A群+乙型副傷寒KA++++--+—+A~F多價+B群+丙型副傷寒KA++++--+—+A~F多價+C群+vi+豬霍亂沙門菌KA+-/++--+—+A~F多價+C群+傷寒沙門菌KA--+/-

+--+—+A~F多價+D群+vi+其他沙門菌KA++

+--+—+A~F多價+腸炎+第27頁,共61頁，2024年2月25日，星期天鑒定與分型——血清學分型2.血清學分型用抗血清對所分離菌種的O抗原、表面Vi抗原，第一相和第二相H抗原進行凝集試驗（O：Vi：第一相H：第二相H）。多數(shù)實驗室先用多價O抗血清（A-F）對沙門菌分離株進行分群。95%以上的沙門菌臨床分離株都屬A-F群，多價抗血清凝集后再用分別代表每一個O血清群的單價因子血清定群。O分群之后再用H因子血清檢查第一相和第二相H抗原，綜合O、H及Vi因子血清的檢查結果，判斷血清型。第28頁,共61頁，2024年2月25日，星期天鑒定與分型——血清型分型注意：試驗時與多價血清不凝集時，可在玻璃試管內用生理鹽水將細菌制成嘗菌液，放入沸水中15~30min，冷卻后再次做凝集試驗。因Vi抗原能阻斷O凝集反應，而煮沸處理能破壞菌體表面的Vi抗原。僅出現(xiàn)單相H抗原（第一相或第二相）時，需用位相分離的方法誘導出另一相抗原后再進行檢查。第29頁,共61頁，2024年2月25日，星期天鑒定與分型——Vi噬菌體分型

標準的Vi噬菌體共有33型，該法可用于流行病學調查和追蹤傳染源，常在一些特殊的參考實驗室內進行，一般醫(yī)院的微生物實驗室不列為常規(guī)檢查項目。第30頁,共61頁，2024年2月25日，星期天血清學診斷用已知傷寒、副傷寒的O、H抗原，檢測受檢血清中有無相應的抗體的半定量試管內凝集試驗，稱為肥達反應。方法將受檢血清用生理鹽水作倍比稀釋，每個稀釋度需作出努力個復管，分別加入等量的傷寒沙門菌O、H抗原及副傷寒沙門菌甲、乙、丙的H抗原進行試管內凝集，凡血清最高稀釋度出現(xiàn)明顯凝集者為凝集將價。第31頁,共61頁，2024年2月25日，星期天1）正常凝集價正常人由于隱性感染或預防接種，血清中通?？珊幸欢ㄋ降哪贵w，正常的凝集價可因不同地區(qū)而有差異一般情況下，傷寒沙門菌O抗體的凝集價應在1∶80以上，H抗體凝集價在1∶160以上，引起副傷寒沙門菌H抗體凝集價在1∶80以上才有診斷意義2）動態(tài)觀察有時單次效價不能定論，可在病程中逐周檢查。若效價逐次增加或恢復期效價比初次≥4倍者有意義第32頁,共61頁，2024年2月25日，星期天O與H抗體的診斷意義：

O抗體出現(xiàn)較早，為IgM，持續(xù)時間短（約半年），消退后不易受非特異性病原刺激而重現(xiàn)。H抗體出現(xiàn)較晚，為IgG，持續(xù)時間長達數(shù)年，消退后易受非特異性病原刺激而重現(xiàn)。①O、H凝集價均超過正常值，則腸熱癥的可能性大：②若兩者均底，腸熱癥的可能性?。孩廴鬙不高H高，可能是預防接種或非特異性反應；④若O高H不高，則可能為傷寒早期，或與其他沙門菌有交叉反應。

第33頁,共61頁，2024年2月25日，星期天結果判斷及報告（1）生化試驗符合沙門菌屬反應，沙門菌屬A-F多價O血清凝集試驗陽性反應，做出檢出沙門菌報告。（2）生化試驗不符合沙門菌屬反應，沙門菌屬A-F多價O血清凝集試驗陰性反應，做出未檢出沙門菌報告。（3）生化試驗符合沙門菌屬反應，沙門菌屬A-F多價O血清凝集試驗陰性反應；或生化試驗不符合沙門菌屬反應，沙門菌屬A-F多價O血清凝集試驗陽性反應；均應進一步鑒定后再做結論報告。第34頁,共61頁，2024年2月25日，星期天對于疑似菌株或須進一步鑒定的菌株，根據(jù)待檢菌已測試的特性，可選擇增添一些必要的生化試驗。糖醇發(fā)酵試驗明膠液化試驗硝酸鹽還原試驗甲基紅試驗VP試驗檸檬酸鹽利用試驗半乳糖苷酶試驗苯丙氨酸脫氨酶試驗丙二酸鈉試驗有機酸鹽利用試驗甘油品紅試驗第35頁,共61頁，2024年2月25日，星期天注意事項培養(yǎng)基對照挑取菌落純培養(yǎng)嚴格按照規(guī)定進行避免對環(huán)境造成污染第36頁,共61頁，2024年2月25日，星期天志賀菌屬檢測

志賀菌屬是人類細菌性痢疾最常見的病原菌，通稱痢疾桿菌。根據(jù)生化反應與血清學試驗該屬細菌分為痢疾、福氏、鮑氏和宋內志賀菌四群。CDC分類系統(tǒng)（1989）將生化性狀相近的A、B、C群歸為一群，統(tǒng)稱為A、B、C血清群，將鳥氨酸脫羧酶和β-半乳糖苷酶均陽性的宋內志賀菌單列出來。我國以福氏和宋內志賀菌引起的菌痢-最為常見。細菌性痢疾是一種常見病，主要流行于發(fā)展中國家，全世界年病例數(shù)超過2億，其中500萬例需住院治療，年死亡病例達65萬。第37頁,共61頁，2024年2月25日，星期天生物學性狀——形態(tài)結構和染色革蘭陰性桿菌，菌體短小，無芽胞，無莢膜，無鞭毛，有菌毛。。第38頁,共61頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)特性兼性厭氧、營養(yǎng)要求不高在腸道選擇培養(yǎng)基上呈無色半透明S型菌落菌落

SS平板－－無色菌落

Mac平板－－無色菌落

EMB平板－－無色菌落宋內志賀菌多呈扁平、R型菌落，個別菌株可遲分解乳糖

第39頁,共61頁，2024年2月25日，星期天生化反應氧化酶試驗（－）分解葡萄糖、不分解乳糖，（個別菌株遲分解乳糖或不分解乳糖）KIA：KA－－MIU：－＋/－－IMViC：－/＋＋－－除A群外，均能發(fā)酵甘露醇第40頁,共61頁，2024年2月25日，星期天抗原結構只有O、K抗原，無H抗原K抗原可阻斷O抗原與相應抗體的凝集根據(jù)O抗原分4群和44型第41頁,共61頁，2024年2月25日，星期天志賀菌抗原分類第42頁,共61頁，2024年2月25日，星期天抵抗力對理化因素抵抗力弱尤其對酸敏感對消毒劑敏感易產生耐藥性第43頁,共61頁，2024年2月25日，星期天變異性S-R變異宋內志賀的菌落由光滑型變?yōu)榇植谛蜑镾-R變異,此外尚伴有生化特征、抗原構造及致病性的變異，而出現(xiàn)不典型菌株。耐藥性變異志賀菌于50年代首先出現(xiàn)對磺胺的耐藥性，后發(fā)展成多重耐藥性，在70年代和80年代分別出現(xiàn)對四環(huán)素和氨芐青霉素的耐藥性，最近又出現(xiàn)對SMZ-TMP的耐藥性。志賀菌的多重耐藥性的問題已成為一個嚴重的醫(yī)學問題第44頁,共61頁，2024年2月25日，星期天臨床意義致病物質：

◆侵襲力：菌毛、大質粒

◆內毒素：

◆志賀毒素：屬外毒素，由A群志賀菌產生，具有腸毒、細胞毒、神經(jīng)毒作用第45頁,共61頁，2024年2月25日，星期天急性菌痢發(fā)熱、腹痛、里急后重、膿血粘液便。急性中毒性菌痢休克為主要表現(xiàn)的全身中毒癥狀；小兒多見，為內毒素在特殊情況下的反應。慢性菌痢病程超過2個月，反復發(fā)作或遷延不愈。攜帶者

恢復期帶菌、慢性帶菌、健康帶菌所致疾病第46頁,共61頁，2024年2月25日，星期天免疫性

志賀菌感染局限與腸粘膜，一般不入血，SIgA為主，病后免疫力短暫。第47頁,共61頁，2024年2月25日，星期天致病性與免疫性

1、侵襲力：菌毛—有利于菌粘附回結腸粘膜2、毒素：加重局部和全身癥狀內毒素作用于腸壁通透性增加粘膜炎癥、潰瘍局部全身內毒素血癥外毒素（A群1型）與內毒素協(xié)同作用

致病物質肛門括約肌第48頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

臨床表現(xiàn)急性細菌性痢疾急性典型：發(fā)熱、腹痛、膿血粘液便非急性典型：小兒—中毒型成人—易誤漏診慢性細菌性痢疾：病程遷移二月以上傳染源:患者與帶菌者

所致疾病免疫力:SIgA第49頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

中毒性痢疾病人第50頁,共61頁，2024年2月25日，星期天微生物學檢驗標本采集◆糞便或肛拭◆新鮮膿血便◆立即送檢或床邊接種◆保存于30％甘油鹽水或卡-布培養(yǎng)基第51頁,共61頁，2024年2月25日，星期天及時送/暫用3%甘油緩沖水保存SS平板（無色透明小菌落）血清學反應（玻片凝集）

檢測報告分離培養(yǎng)新鮮膿血便/肛拭雙糖培養(yǎng)基（生化反應）快速診斷熒光菌球試驗協(xié)同凝集試驗三、微生物學檢查PCR、基因探針第52頁,共61頁，2024年2月25日，星期天檢驗方法將待檢標本接種腸道選擇平板，35℃培養(yǎng)18～24