瓊脂糖凝膠電泳

關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)第2頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第4頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共52頁，2024年2月25日，星期天按有無固體支持物分類第6頁,共52頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)電泳支持介質(zhì)的不同，常分為瓊脂糖凝膠電泳(agarosegel)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）第7頁,共52頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖（agarose）是從海藻中提取的長鏈狀多聚物，當加熱至90℃左右時，形成清亮、透明的液體，冷卻至45℃以下時，即可固化形成凝膠。第8頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共52頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳原理DNA分子帶負電荷，來源于其磷酸骨架。因電荷密度均一，DNA分子所帶電荷與分子量成正比。在無支持物的自由電場中，平均質(zhì)量的牽引力相同，因此DNA分子無論大小都具有相同的遷移率，DNA由陰極端泳向陽極端。在凝膠電泳中，DNA分子的移動不再是自由的，受到凝膠支架的阻礙，凝膠孔隙起著分子篩的作用。第10頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

小分子顆粒小可從較小的孔中穿行，而大分子則必須饒道經(jīng)大孔隙通過，因而遷移速度減慢。調(diào)節(jié)凝膠的濃度，便可將不同大小的DNA分子分離開。電泳是分離、鑒定、純化DNA片段的簡便而快速的方法。第12頁,共52頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖電泳的用途判斷擴增片斷的大小回收擴增片斷用于轉(zhuǎn)印進行Southern印跡第13頁,共52頁，2024年2月25日，星期天問題

如何獲得清晰的瓊脂糖電泳照片呢？第14頁,共52頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖電泳結(jié)果的影響因素凝膠電泳液電壓檢測手段第15頁,共52頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠濃度的選擇在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數(shù)成反比。不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。第16頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共52頁，2024年2月25日，星期天電泳緩沖液DNA的泳動受到電泳緩沖液和離子濃度的影響。缺乏離子，電導(dǎo)率嚴重降低，電泳遷移率很慢；離子強度過高，電導(dǎo)率升高，極易產(chǎn)生大量的熱能，最嚴重的結(jié)果是凝膠熔化，DNA變性。常用的電泳緩沖液有TAE，TPE和TBE,其中TAE的緩沖容量最低，長時間電泳將被消耗。第19頁,共52頁，2024年2月25日，星期天電泳緩沖液比較緩沖液緩沖容量遷移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高復(fù)雜DNA；超螺旋DNATBE很高較慢低分子量高價格昂貴，不常用TPE第20頁,共52頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠中DNA的檢測凝膠中核酸染色方法：

溴化乙錠(EB)染色法染料存在時，線狀DNA電泳遷移率降低約15％在凝膠中沒有EB時，DNA條帶更為清晰，當需要知道DNA片斷的準確大小時，可以在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后用EB染色染色方法：將凝膠浸入含有EB(0.5ug/ml)的電泳液中，室溫下30-45min。第21頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共52頁，2024年2月25日，星期天電壓瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結(jié)果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降。對于大分子DAN片斷，電場強度不宜高于5V/cm。但對于小片斷的DNA可以5-20V/cm電壓電泳第24頁,共52頁，2024年2月25日，星期天凝膠制備的注意事項1、配膠和電泳需要使用同一批次的緩沖液2、瓊脂糖要徹底熔化，時間不宜過長3、EB含量要適當4、凝膠應(yīng)存放在陰涼處，再次用時加入少量電泳液，5、檢查梳子6、拔取梳子時應(yīng)均勻用力，檢查凝膠孔的整齊度7、凝膠稍厚些，避免樣品溢出第25頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共52頁，2024年2月25日，星期天電泳時間PCR產(chǎn)物，應(yīng)該在24h之內(nèi)電泳電泳時間不易過長，對于長片斷影響不大，但對小片斷DNA影響明顯電泳期間，EB向陰極遷移，與DNA遷移方向相反，長時間電泳將導(dǎo)致凝膠中EB含量顯著較少，小片斷DNA檢測發(fā)生困難第44頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共52頁，2024年2月25日，星期天電泳上樣量中號梳子：8—10ul小號梳子：6—8ul上樣注意事項：

1、加樣時應(yīng)懸空

2、加樣盡可能快

3、不必每一個樣品用一個吸頭

4、上樣量中DNA含量過高，容易產(chǎn)生“彎月亮”第46頁,共52頁，2024年2月25日，星期天凝膠拍照曝光時間：6--10s拍照尺寸的選?。哼x用大的尺寸拍攝可獲得清晰的電泳圖片一般拍攝兩次才可以得到清晰的照片第47頁,共52頁，2024年2月25日，星期天小結(jié)電泳圖片的影響因素：凝膠，電泳液，EB，上樣操作，拍照好的電泳圖片不一定一次就可以獲得第48頁,共52頁，2024