植物體細(xì)胞雜交的研究進(jìn)展

植物體細(xì)胞雜交的研究進(jìn)展1.本文概述簡(jiǎn)要介紹植物體細(xì)胞雜交的概念和重要性。植物體細(xì)胞雜交是一種將來(lái)自不同植物的體細(xì)胞融合在一起，形成新的雜種細(xì)胞的技術(shù)。這一技術(shù)對(duì)于植物遺傳學(xué)、育種學(xué)以及生物技術(shù)領(lǐng)域具有重要的意義，因?yàn)樗粌H有助于研究植物的遺傳特性，還能夠創(chuàng)造出具有新性狀的植物品種。概述植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的發(fā)展歷史。自20世紀(jì)60年代以來(lái)，隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，植物體細(xì)胞雜交技術(shù)得到了顯著的進(jìn)步。從最初的物理和化學(xué)誘導(dǎo)方法，到后來(lái)的電融合和激光誘導(dǎo)融合技術(shù)，科學(xué)家們不斷探索和優(yōu)化體細(xì)胞雜交的方法，以提高雜種細(xì)胞的生成效率和穩(wěn)定性。再次，強(qiáng)調(diào)當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和挑戰(zhàn)。盡管植物體細(xì)胞雜交技術(shù)已經(jīng)取得了一定的成果，但仍然面臨著許多挑戰(zhàn)，例如雜種細(xì)胞的存活率低、雜種植株的染色體穩(wěn)定性問(wèn)題以及雜交后的性狀表達(dá)不一致等。當(dāng)前的研究熱點(diǎn)主要集中在提高雜交效率、優(yōu)化雜交后的植株再生體系以及探索新的雜交誘導(dǎo)技術(shù)等方面。闡述本文的結(jié)構(gòu)和主要內(nèi)容。本文將首先回顧植物體細(xì)胞雜交的基本原理和方法，然后介紹近年來(lái)在該領(lǐng)域取得的重要進(jìn)展，包括新的誘導(dǎo)技術(shù)、雜種細(xì)胞的篩選和鑒定方法以及雜種植株的表型和遺傳特性分析。文章還將討論目前存在的主要問(wèn)題和未來(lái)的研究方向，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究者提供參考和啟示。2.體細(xì)胞雜交的技術(shù)方法體細(xì)胞雜交是一種重要的生物技術(shù)手段，它通過(guò)將兩個(gè)不同物種或品種的植物體細(xì)胞融合，產(chǎn)生具有雙親特性的雜種植物。這種方法在植物育種、基因工程以及基礎(chǔ)研究中具有重要意義。本節(jié)將詳細(xì)介紹體細(xì)胞雜交的技術(shù)方法，包括融合前處理、融合方法以及融合后的篩選和培養(yǎng)。原生質(zhì)體制備：通過(guò)酶解法（如纖維素酶和果膠酶）去除植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，獲得保持活性的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體純化：通過(guò)離心等方法去除酶解液和未酶解的細(xì)胞壁殘片，獲得純凈的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體活化：通過(guò)高滲溶液處理，使原生質(zhì)體恢復(fù)活性，提高融合效率?；瘜W(xué)融合：使用聚乙二醇（PEG）作為融合劑，在高滲環(huán)境下誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合。電融合：通過(guò)電脈沖誘導(dǎo)原生質(zhì)體膜破裂和融合。這種方法融合效率高，但對(duì)設(shè)備要求較高。培養(yǎng)：將篩選出的雜種細(xì)胞通過(guò)液體懸浮培養(yǎng)或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分化成植株。盡管體細(xì)胞雜交技術(shù)在植物育種中具有重要應(yīng)用，但仍面臨一些挑戰(zhàn)，如融合效率低、篩選困難以及再生植株的遺傳穩(wěn)定性問(wèn)題。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步優(yōu)化融合和培養(yǎng)條件，提高融合效率，同時(shí)發(fā)展更高效的篩選技術(shù)，確保獲得的雜種植株具有穩(wěn)定且有用的遺傳特性。體細(xì)胞雜交技術(shù)為植物育種和基因工程提供了強(qiáng)大的工具。通過(guò)不斷優(yōu)化融合前處理、融合方法和融合后的篩選培養(yǎng)技術(shù)，可以提高體細(xì)胞雜交的成功率和應(yīng)用價(jià)值。未來(lái)的研究有望克服現(xiàn)有挑戰(zhàn)，使體細(xì)胞雜交技術(shù)在植物科學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮更大的作用。3.體細(xì)胞雜交的生物學(xué)基礎(chǔ)植物體細(xì)胞雜交（PlantSomaticHybridization）的生物學(xué)基礎(chǔ)主要涉及細(xì)胞融合、遺傳重組、細(xì)胞再生和分化等過(guò)程。這些基礎(chǔ)過(guò)程不僅揭示了植物細(xì)胞雜交的可行性，而且對(duì)于理解植物生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳改良以及生物多樣性具有重要意義。細(xì)胞融合是植物體細(xì)胞雜交的第一步，也是整個(gè)雜交過(guò)程的關(guān)鍵。它涉及到兩個(gè)不同植物細(xì)胞的質(zhì)膜和細(xì)胞壁的融合，從而形成一個(gè)新的雜交細(xì)胞。這一過(guò)程通常需要外部刺激，如電脈沖、化學(xué)物質(zhì)（如聚乙二醇）或病毒載體等。細(xì)胞融合的機(jī)理包括質(zhì)膜融合、細(xì)胞質(zhì)融合以及隨后發(fā)生的核融合。質(zhì)膜融合使兩個(gè)細(xì)胞的質(zhì)膜結(jié)合在一起，細(xì)胞質(zhì)融合使兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)混合，而核融合則將兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核融合為一個(gè)。細(xì)胞融合后，兩個(gè)不同來(lái)源的細(xì)胞核必須進(jìn)行遺傳重組，以形成穩(wěn)定的雜種細(xì)胞。遺傳重組涉及到DNA的交換和重組，這是通過(guò)同源重組、非同源末端連接和微同源介導(dǎo)的重組等機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。這些機(jī)制使得雜交細(xì)胞能夠整合來(lái)自兩個(gè)不同親本的遺傳信息，從而形成具有新遺傳特性的細(xì)胞。在遺傳重組之后，雜交細(xì)胞需要通過(guò)細(xì)胞再生和分化過(guò)程形成完整的植物個(gè)體。這一過(guò)程涉及到細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化和器官發(fā)生等生物學(xué)過(guò)程。細(xì)胞再生通常通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)，如愈傷組織的誘導(dǎo)和芽、根的形成。分化過(guò)程則涉及到細(xì)胞特化，形成各種不同的細(xì)胞類型和組織，最終形成具有新遺傳特性的植物個(gè)體。植物體細(xì)胞雜交不僅能夠產(chǎn)生新的遺傳組合，而且還能夠產(chǎn)生新的遺傳特性。這些特性可能包括對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性、對(duì)病蟲害的抗性、改良的產(chǎn)量和品質(zhì)等。這些新特性對(duì)于植物育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義?？偨Y(jié)起來(lái)，植物體細(xì)胞雜交的生物學(xué)基礎(chǔ)主要包括細(xì)胞融合、遺傳重組、細(xì)胞再生和分化等過(guò)程。這些過(guò)程不僅揭示了植物細(xì)胞雜交的可行性，而且對(duì)于理解植物生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳改良以及生物多樣性具有重要意義。4.體細(xì)胞雜交在植物育種中的應(yīng)用植物育種中，體細(xì)胞雜交技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。它克服了傳統(tǒng)有性雜交的局限性，如遠(yuǎn)緣雜交的不親和性、雙親花期不遇、雌雄不育等問(wèn)題。體細(xì)胞雜交技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)不同物種甚至不同屬之間的雜交，從而創(chuàng)造出新的植物品種。核質(zhì)替換：通過(guò)體細(xì)胞雜交技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的替換，從而獲得具有新性狀的植物品種。細(xì)胞質(zhì)雜種的獲得：體細(xì)胞雜交技術(shù)可以用于獲得具有不同細(xì)胞質(zhì)的雜種植物，這些雜種植物可能具有更好的抗病性、抗逆性等特性。遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)造新物種：通過(guò)體細(xì)胞雜交技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣植物之間的雜交，從而創(chuàng)造出新的植物物種。細(xì)胞器的互作研究：體細(xì)胞雜交技術(shù)還可以用于研究植物細(xì)胞器之間的相互作用，從而為植物育種提供新的思路和方法。一個(gè)典型的例子是馬鈴薯和番茄的體細(xì)胞雜交，通過(guò)這種技術(shù)，地上可以結(jié)番茄，地下可以長(zhǎng)馬鈴薯，實(shí)現(xiàn)了兩種作物的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。體細(xì)胞雜交技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用前景廣闊，有望為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)新的突破。5.體細(xì)胞雜交面臨的挑戰(zhàn)與問(wèn)題a.雜交效率低下：討論影響植物體細(xì)胞雜交成功率的技術(shù)因素，如細(xì)胞融合和再生技術(shù)的不穩(wěn)定性。b.細(xì)胞融合的選擇性：分析如何提高特定細(xì)胞融合的選擇性，以及現(xiàn)有技術(shù)的局限性。c.再生能力限制：探討不同植物種類在再生能力上的差異，以及這些差異如何影響雜交結(jié)果。a.基因組兼容性：討論植物基因組間的兼容性問(wèn)題，以及如何克服這些障礙以實(shí)現(xiàn)成功的雜交。b.遺傳穩(wěn)定性：分析雜交植物在遺傳上的穩(wěn)定性，以及如何確保雜交后代的遺傳穩(wěn)定性。c.功能基因組表達(dá)：探討雜交植物中功能基因組表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及其對(duì)植物性能的影響。a.商業(yè)化應(yīng)用：討論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)在商業(yè)化應(yīng)用中的限制和挑戰(zhàn)。b.環(huán)境和倫理問(wèn)題：分析植物體細(xì)胞雜交技術(shù)對(duì)環(huán)境可能產(chǎn)生的影響，以及相關(guān)的倫理問(wèn)題。c.法規(guī)和政策限制：探討不同國(guó)家和地區(qū)在植物體細(xì)胞雜交技術(shù)方面的法規(guī)和政策限制。a.技術(shù)創(chuàng)新：提出技術(shù)上的創(chuàng)新方向，以提高雜交效率和成功率。b.基礎(chǔ)研究：強(qiáng)調(diào)加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，以更好地理解植物體細(xì)胞雜交的生物學(xué)機(jī)制。c.應(yīng)用拓展：討論如何拓展植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的應(yīng)用范圍，以解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際問(wèn)題。通過(guò)這個(gè)大綱，可以確保文章的這一部分內(nèi)容全面、深入，并且具有邏輯性和條理性。每個(gè)小節(jié)都可以擴(kuò)展成一段或幾段，詳細(xì)闡述相關(guān)挑戰(zhàn)和問(wèn)題，以及可能的解決方案或未來(lái)研究方向。6.未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)與展望技術(shù)的進(jìn)一步創(chuàng)新與優(yōu)化：隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，植物體細(xì)胞雜交技術(shù)有望得到進(jìn)一步的優(yōu)化。例如，通過(guò)基因編輯技術(shù)精確調(diào)控參與細(xì)胞融合的基因，提高雜交效率。利用合成生物學(xué)方法，設(shè)計(jì)新型的融合系統(tǒng)，可能為植物體細(xì)胞雜交帶來(lái)革命性的變化。拓寬雜交親本的種類和范圍：目前植物體細(xì)胞雜交主要在近緣物種間進(jìn)行。未來(lái)，通過(guò)改進(jìn)雜交技術(shù)和理解雜交障礙的分子機(jī)制，有望實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣物種甚至不同界植物之間的雜交，這將極大地?cái)U(kuò)展植物遺傳資源的利用范圍。功能基因組學(xué)在雜交中的應(yīng)用：隨著基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將雜交過(guò)程中的基因表達(dá)變化與雜交結(jié)果相關(guān)聯(lián)，可以更深入地理解雜交的分子機(jī)制。這種理解對(duì)于提高雜交成功率、改善雜交后代的表現(xiàn)具有重要意義。雜交技術(shù)在農(nóng)業(yè)和生物工程中的應(yīng)用：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)在作物改良、生物制藥、生態(tài)環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。未來(lái)，通過(guò)雜交技術(shù)培育出的新作物品種，可能具有更好的抗病性、適應(yīng)性以及更高的產(chǎn)量和品質(zhì)。倫理與環(huán)境保護(hù)的考量：隨著植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的發(fā)展，其可能帶來(lái)的生態(tài)安全和倫理問(wèn)題也需要被重視。例如，雜交植物可能對(duì)自然環(huán)境造成影響，雜交過(guò)程中的基因流動(dòng)也可能帶來(lái)不可預(yù)見(jiàn)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。未來(lái)雜交技術(shù)的發(fā)展應(yīng)兼顧環(huán)境保護(hù)和倫理考量。植物體細(xì)胞雜交作為一種充滿潛力的生物技術(shù)，其未來(lái)的發(fā)展前景是廣闊的。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和對(duì)雜交機(jī)制更深入的理解，我們有理由相信，植物體細(xì)胞雜交將在未來(lái)的農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。這一過(guò)程也伴隨著倫理和環(huán)境挑戰(zhàn)，需要在科學(xué)研究和技術(shù)應(yīng)用中予以充分考慮。參考資料：體細(xì)胞雜交又稱體細(xì)胞融合，指將兩個(gè)原生質(zhì)體不同的體細(xì)胞融合成一個(gè)體細(xì)胞的過(guò)程。融合形成的雜種細(xì)胞，兼有兩個(gè)細(xì)胞的染色體。體細(xì)胞是生物體除生殖細(xì)胞外的所有細(xì)胞。將從身體分離的體細(xì)胞做組織培養(yǎng)進(jìn)行遺傳學(xué)研究的學(xué)科稱為體細(xì)胞遺傳學(xué)（somaticgenetics）。體外培養(yǎng)細(xì)胞可人為控制或改變環(huán)境條件，并可建立細(xì)胞株，長(zhǎng)期保存，進(jìn)行各種正常和病理研究。與基因定位有關(guān)的是體細(xì)胞雜交（somaticcellhybridization）。細(xì)胞雜交又稱細(xì)胞融合（cellfusion），是將來(lái)源不同的兩種細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞。大多數(shù)體細(xì)胞雜交是用人的細(xì)胞與小鼠、大鼠或倉(cāng)鼠的體細(xì)胞（hybridcell）進(jìn)行雜交。細(xì)胞融合后，要進(jìn)行異核體的篩選。所用方法是：①根據(jù)雙親細(xì)胞的形態(tài)特征，用不同熒光染料標(biāo)記，人工挑選或用熒光激活細(xì)胞分揀機(jī)分離?；蛲ㄟ^(guò)顯微操作直接挑選。②在合適的選擇壓下，只允許雜種細(xì)胞生長(zhǎng)，淘汰雙親和同源融合細(xì)胞。如生長(zhǎng)激素自主選擇、代謝互補(bǔ)選擇、白化互補(bǔ)選擇、營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)選擇、藥物抗性互補(bǔ)選擇等。融合后的雜種細(xì)胞的異核體，多數(shù)情況下在第一次有絲分裂期即發(fā)生兩個(gè)親本核的融合，如果兩個(gè)核在雜種細(xì)胞中位置較近，也可能在有絲分裂前就發(fā)生融合。如果兩個(gè)核不融合，有可能發(fā)育成嵌合體。如果兩核既相互輔助又相互排斥，從而導(dǎo)致染色體丟失，經(jīng)常還會(huì)伴隨著染色體重排、染色體碎片、染色體環(huán)、染色體橋等形成。融合后的兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)，可能均勻混合，細(xì)胞器也均勻分布，因此雙方的葉綠體及線粒體基因都得到遺傳。也有人認(rèn)為在兩個(gè)原生質(zhì)體融合時(shí)，質(zhì)體會(huì)隨機(jī)丟失。融合后的細(xì)胞是否為雜種，多用染色體形態(tài)比較法和同工酶分析法來(lái)鑒定，也有用花器官的形態(tài)顏色來(lái)檢測(cè)的。一般來(lái)說(shuō)，植物有性雜交只能在同種或在系統(tǒng)分類上相近種的親本間進(jìn)行，核性狀按孟德爾遺傳規(guī)律分離，而核外基因則大多數(shù)為母性遺傳。體細(xì)胞雜交能克服有性雜交的配子不親合性，獲得一些含有另一親本非整倍體的雜種或胞質(zhì)雜種。它們的遺傳變異范圍極廣，大大豐富了育種的原始材料，從而創(chuàng)造出自然界中沒(méi)有的新物種。如馬鈴薯與番茄融合得到的薯番茄和番茄薯。沒(méi)有壁的裸露細(xì)胞，有利遺傳操作，轉(zhuǎn)移部分基因或基因組，已成功的如胡蘿卜一S歐芹融合。因此體細(xì)胞雜交在物種改良上有著廣闊前景。另外甘藍(lán)與白菜融合，人工合成的甘藍(lán)型歐洲油菜，在實(shí)驗(yàn)室中短時(shí)間內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)了自然界的進(jìn)化過(guò)程，使蕓苔屬的三角進(jìn)化關(guān)系又一次得到驗(yàn)證。體細(xì)胞雜交技術(shù)也為細(xì)胞生物學(xué)研究及遺傳學(xué)分析提供了一個(gè)新的研究途徑。新產(chǎn)生的融合細(xì)胞稱為雜種細(xì)胞（hybridcell），含有雙親不同的染色體。雜種細(xì)胞有一個(gè)重要的特點(diǎn)是在其繁殖傳代過(guò)程中出現(xiàn)保留嚙齒類一方染色體而人類染色體則逐漸丟失，最后只剩一條或幾條，其原因至今不明。這種僅保留少數(shù)甚至一條人染色體的雜種細(xì)胞正是進(jìn)行基因連鎖分析和基因定位的有用材料。由于人和鼠類細(xì)胞都有各自不同的生化和免疫學(xué)特征，Miller等運(yùn)用體細(xì)胞雜交并結(jié)合雜種細(xì)胞的特征，證明雜種細(xì)胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17號(hào)染色體的雜種細(xì)胞都因有TK活性而存活，反之則死亡。從而推斷TK基因定位于第17號(hào)染色體上。這是首例用細(xì)胞雜交法進(jìn)行的基因定位。由此可見(jiàn)，研究基因定位時(shí)，由于有雜種細(xì)胞這一工具，只需要集中精力于某一條染色體上，就可找到某一基因座位。輻射性雜交(radiationhybridRH)制圖技術(shù)是1975年由Goss和Harris創(chuàng)立的一種體細(xì)胞雜交技術(shù)，適用于構(gòu)建人類基因組長(zhǎng)范圍內(nèi)的高分辨率連續(xù)物理圖譜。成熟的輻射性雜交制圖技術(shù)是由CoxVR等人于1990年建立的。利用高劑量的射線將候選染色體打斷成若干片段，含有這種片段的細(xì)胞可與倉(cāng)鼠細(xì)胞形成雜交克隆。在這種雜交中，人類染色體片段被插入到倉(cāng)鼠染色體的中間部分，因此大部分克隆片段在進(jìn)行有絲分裂時(shí)處于穩(wěn)定的狀態(tài)。利用類似于遺傳重組原理和最大似然性的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)計(jì)算存在于DNA片段上的多態(tài)性或非多態(tài)性標(biāo)記之間的斷點(diǎn)頻率，以此估計(jì)標(biāo)記之間的距離，并建立人類基因組拷貝庫(kù)---體細(xì)胞雜交系統(tǒng)?？筛鶕?jù)不同要求構(gòu)建出斷裂程度不同的多套拷貝，從而得到不同分辨率的放射雜交圖。輻射性雜交是建立在受到射線照射的供體細(xì)胞與非放射線處理的受體細(xì)胞融合基礎(chǔ)上的一種體細(xì)胞遺傳學(xué)方法，是利用兩個(gè)標(biāo)記之間被射線打斷的概率來(lái)計(jì)算標(biāo)記之間距離，通過(guò)類似于減數(shù)分裂連鎖制圖的方法來(lái)確定標(biāo)記之間的順序。G3嵌板的產(chǎn)生→確定STSs→PCR體系及反應(yīng)條件→構(gòu)建RH圖譜.熒光原位雜交(FISH)法和輻射雜種細(xì)胞系(RH)技術(shù)是國(guó)際上最常用的基因定位的兩種方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)。FISH可以定位基因組中多個(gè)同源位點(diǎn)，結(jié)果直觀、可靠，而RH法則很困難。但是FISH法檢測(cè)步驟繁雜，尤其受探針大小的影響較大，2kb以下的cDNA序列很難定位，而且結(jié)果需要有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞遺傳學(xué)家進(jìn)行分析。RH法簡(jiǎn)單易行，定位精度高，適合小于lkb--2kb以下的序列，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可直接定位。其結(jié)果也便于不同實(shí)驗(yàn)室間比較。和其他作圖法相比，RH作圖法是依賴于輻射引起的斷點(diǎn)而不是靠減數(shù)分裂重組得到的斷點(diǎn)，是一種完全獨(dú)立的方法，所以是一個(gè)互補(bǔ)的作圖方法，可利用所有不同的STSs，具有巨大的DNA補(bǔ)充潛力，從而有利于整合不同的遺傳和轉(zhuǎn)錄圖以及所有基因組位標(biāo)(無(wú)名序列、中心粒和端粒)。缺點(diǎn)但是RH法也受到某些自身?xiàng)l件的限制，RH嵌板中每個(gè)雜交克隆均包括倉(cāng)鼠和人的基因組DNA，可以看作是在倉(cāng)鼠基因組DNA背景下相區(qū)別。如有些基因無(wú)法定位的原因即在于它的序列包括閱讀框架以及3，UTR區(qū)域與倉(cāng)鼠的相似性高達(dá)90%以上。做ESTs或全長(zhǎng)cDNA定位的引物為cDNA序列，而RH法是在基因組DNA上擴(kuò)增出相應(yīng)的片斷，由于內(nèi)含子序列的存在，擴(kuò)增結(jié)果與引物設(shè)計(jì)的部位直接有關(guān)，一般應(yīng)選用3，UTR部位的序列。還應(yīng)指出，用RH法能否成功定位，依賴于該基因所在染色體區(qū)域上合適位標(biāo)的存在。如果現(xiàn)有的RH圖中此區(qū)域分布的合適位標(biāo)過(guò)少，可改用位標(biāo)位點(diǎn)多的嵌板。因此隨著今后RH圖精度的提高，越來(lái)越多的STSs被放置于染色體上，有望彌補(bǔ)這個(gè)缺陷。輻射性雜交技術(shù)是繼熒光原位雜交后新近建立的染色體定位方法，RH作圖法提供了一種聯(lián)系物理圖和遺傳圖的方法，已成為當(dāng)今構(gòu)建人類基因組大尺度、高密度、連續(xù)的染色體圖的常用方法之一。其用途主要有：EST定位、基因克隆、基因組作圖、測(cè)定距離、尋找新基因等。植物體細(xì)胞雜交是在原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，借用動(dòng)物細(xì)胞融合方法發(fā)展起來(lái)的一門新型生物技術(shù)。植物體細(xì)胞雜交的過(guò)程包括原生質(zhì)體的制備，原生質(zhì)體融合的誘導(dǎo)，雜種細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)，以及雜種植株的再生與鑒定等環(huán)節(jié)。下面以煙草和大豆的體細(xì)胞雜交為例，簡(jiǎn)要介紹植物體細(xì)胞雜交的過(guò)程。原生質(zhì)體制備選取煙草植株上的幼嫩葉片和培養(yǎng)好的大豆細(xì)胞，用酶解法制備原生質(zhì)體。煙草的原生質(zhì)體呈綠色，大豆的無(wú)色，在顯微鏡下很容易將二者區(qū)別開來(lái)。原生質(zhì)體融合取等量的煙草和大豆的原生質(zhì)體混合后，加入聚乙二醇溶液。在顯微鏡下觀察，可以看到原生質(zhì)體相互黏集在一起。隔一段時(shí)間后，加入高鈣、高pH的溶液，這時(shí)原生質(zhì)體才開始融合。原生質(zhì)體融合包括膜融合和核融合兩個(gè)過(guò)程。誘導(dǎo)融合只能誘導(dǎo)細(xì)胞膜的融合，兩個(gè)核的融合是在雜種細(xì)胞第一次有絲分裂時(shí)進(jìn)行的。雜種細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)煙草與大豆的原生質(zhì)體融合后，將原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)，使原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁。這時(shí)，在細(xì)胞混合物中，不僅有煙草—大豆雜種細(xì)胞，還有煙草細(xì)胞、大豆細(xì)胞、煙草—煙草細(xì)胞、大豆—大豆細(xì)胞。雜種細(xì)胞的篩選，可以用機(jī)械方法，也可以用生理學(xué)或遺傳學(xué)的方法。以機(jī)械方法為例，根據(jù)兩種親本細(xì)胞在形態(tài)、色澤上的差異，將細(xì)胞分別接種在帶有小格的培養(yǎng)皿中，每個(gè)小格中約放1～3個(gè)細(xì)胞。在顯微鏡下找出雜種細(xì)胞，并且標(biāo)定位置。等雜種細(xì)胞分裂成細(xì)胞團(tuán)時(shí)，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)成愈傷組織。雜種植株的再生與鑒定雜種植株的再生是指從愈傷組織培養(yǎng)出雜種植株的過(guò)程。由于煙草和大豆分別屬于茄科和豆科，二者的原生質(zhì)體融合后，至今只能長(zhǎng)成雜種愈傷組織，還不能分化，因此談不上雜種植株的再生和鑒定。對(duì)于能夠再生出雜種植株的，如煙草—海島煙草、白菜—甘藍(lán)、胡蘿卜—羊角芹等，長(zhǎng)出的植株究竟是不是雜種，還需要經(jīng)過(guò)鑒定才能確定下來(lái)。雜種植株的鑒定方法有形態(tài)學(xué)方法、生化方法(如電泳)、細(xì)胞學(xué)方法(如染色體組型分析)、分子生物學(xué)方法(如分子雜交)等了解用聚乙二醇PEG方法誘異同種植物原生質(zhì)體融合的技術(shù)，并能根據(jù)新本原生質(zhì)體的形態(tài)樗來(lái)鑒別雜種細(xì)胞。不同種植物的原生質(zhì)體可在人工誘導(dǎo)條件下融合，所產(chǎn)生的雜種細(xì)胞，即異核體經(jīng)過(guò)培養(yǎng)可再生新壁，分裂形成愈傷組織，進(jìn)而分化產(chǎn)生雜種植株。由于進(jìn)行融合的原生質(zhì)體來(lái)自體細(xì)胞，故該項(xiàng)技術(shù)也叫體細(xì)胞雜交。原生質(zhì)體融合能使有性雜交不親合的植物種間進(jìn)行廣泛的遺傳重組，因而在農(nóng)業(yè)育種上具有巨大的潛力。在植物遺傳操作研究中也是關(guān)鍵技術(shù)之一。人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合可使用物理學(xué)方法，如運(yùn)用細(xì)胞融合儀，在電場(chǎng)誘因?qū)聦?shí)現(xiàn)融合，然而至今廣為使用的仍是聚乙二醇（PEG）溶液引起原生質(zhì)體的聚集和粘連，然后用高pH鈣溶液相處理的化學(xué)方法（Kao等，1974）。該法應(yīng)用分子量至為1500~6000的聚乙二醇（PEG）溶液引起原生質(zhì)體的聚集和粘連，然后用高pH的鈣溶液稀釋時(shí)，就產(chǎn)生了高頻率的融合，融合的頻率和省略常與所有PEG的分子量、濃度，作用時(shí)間，原生質(zhì)體的生理狀態(tài)與密度以及操作者的細(xì)心程度有關(guān)。2．將收集的兩種不同材料的原生質(zhì)體分別懸浮在16mol/L的CaCl2·2H2O（pH8~2）原生質(zhì)體密度調(diào)整為2×105/ml左右（用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體密度）。4．用刻度吸管將混合的原生質(zhì)體懸液滴在直徑為60mm的平皿中，每皿滴7~8滴，每滴約1ml。然后靜置10in，使原生質(zhì)體巾在皿底上，形成一薄層。（應(yīng)有3~5個(gè)平皿的重復(fù)）。5．用吸管將等量的PEG溶液緩慢地加在原生質(zhì)體液滴上，再靜置10~15min。此時(shí)可取一個(gè)平皿在倒置顯微鏡上觀察原生質(zhì)體間的粘連。6．用刻度吸管向原生質(zhì)體液滴慢慢地加入高pH、商鈣稀液。第一次加5ml，第2次1ml，第4次各2ml，每次之間間隔5min。將平皿稍微傾斜，吸去上清液，再緩緩加入4ml稀釋液。5min后，再傾斜平皿，吸去上清液注意吸去上清液時(shí)勿使原生質(zhì)體漂浮起來(lái)。用蠟?zāi)っ芊馄矫?。?60下進(jìn)行24h暗培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)到弱光條件下培養(yǎng)。1．在倒置顯微鏡下觀察異源融合。在培養(yǎng)3天以內(nèi)，可根據(jù)雙新原生質(zhì)體的形態(tài)特征來(lái)鑒別異核體。因?yàn)閬?lái)自葉肉組織的原生質(zhì)體具有明顯綠色葉綠粒，而來(lái)自培養(yǎng)細(xì)胞的原生質(zhì)體無(wú)色，但具濃密原生質(zhì)絲，并可看到顯示的核區(qū)。植物體細(xì)胞雜交（plantsomatichybridization）,又稱原生質(zhì)體融合（Protoplastfusion）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質(zhì)體通過(guò)人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，未脫壁的兩個(gè)細(xì)胞是很難融合的，植物細(xì)胞只有在脫去細(xì)胞壁成為原生質(zhì)體后才能融合，所以植物的細(xì)胞融合也稱為原生質(zhì)體融合。1960年，Cocking用酶法制備高等植物原生質(zhì)體首次獲得成功；1970年，Power首次用硝酸鈉進(jìn)行為誘導(dǎo)劑進(jìn)行了較大規(guī)模的原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合；1971年，Nagata和Takebe首次從離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得再生完整植株；1972年，Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種，這也是第一個(gè)植物細(xì)胞雜種；1974年，Kao將聚乙二醇誘導(dǎo)融合法應(yīng)用于植物細(xì)胞融合并建立了相應(yīng)的融合技術(shù)；1978年，Melchers獲得了第一個(gè)屬間細(xì)胞雜種（番茄+馬鈴薯）；1981年，Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念；1991年，R.Wiegand和R.W.Steubing等利用光鑷將大鼠的B-淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞對(duì)接，形成預(yù)雜種，再利用UV激光微束照射，使膜消失并完全融合，形成雜交細(xì)胞。對(duì)稱融合（symmetricfusion）－即兩個(gè)完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。非對(duì)稱融合（asymmetricfusion）－利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合，它可以分為幾種：物理方法常采用射線處理，如射線、射線等，它們能使細(xì)胞核失活；還有離心，振動(dòng)，電激等?；瘜W(xué)處理常用的試劑有聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活－羅丹明（一種能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過(guò)程而達(dá)到失活作用的親脂染料）將植物細(xì)胞A與植物細(xì)胞B用纖維素酶和果膠酶處理，得到不含細(xì)胞壁的原生質(zhì)體A和原生質(zhì)體B，運(yùn)用物理方法或是化學(xué)方法誘導(dǎo)融合，形成雜種細(xì)胞，再利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將雜種細(xì)胞培養(yǎng)成雜種植物體。①雜交時(shí)間：植物細(xì)胞雜交是從細(xì)胞融合開始，到培育成的新植物體結(jié)束。b.原生質(zhì)體融合：膜融合（高鈣、高pH誘導(dǎo)融合）、核融合（雜種細(xì)胞第一次有絲分裂時(shí)融合）PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。其缺點(diǎn)是融合過(guò)程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。PEG的作用機(jī)理：Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合；PEG能增加類脂膜的流動(dòng)稀釋液：A液（g/100ml）pH0B液（g/100ml）pH5與PEG融合比較起來(lái)，電融合有三大優(yōu)點(diǎn)：一是不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問(wèn)題；二是融合效細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通電后，電流即通過(guò)原生質(zhì)體而不是通過(guò)溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而關(guān)于融合參數(shù)：電融合中的主要參數(shù)包括交流電壓、交變電場(chǎng)的振幅頻率、交變電場(chǎng)的原生質(zhì)體質(zhì)量對(duì)細(xì)胞的融合起著至關(guān)重要的作用，高質(zhì)量的原生質(zhì)體是細(xì)胞融合如果細(xì)胞分裂而核不發(fā)生融合，在以后的發(fā)育過(guò)程中就會(huì)有兩種結(jié)果，一是細(xì)胞分裂幾次以后即停止生長(zhǎng)從而導(dǎo)致死亡；二是在發(fā)育過(guò)程中某一親本的細(xì)胞核部分或全部丟失。如果這樣就會(huì)產(chǎn)生幾種情況：A細(xì)胞+B細(xì)胞質(zhì)；A細(xì)胞+B細(xì)胞質(zhì)和部分染色體或基因。由于染色體的部分丟失，常常使某個(gè)親本的部分或個(gè)別基因與另一親本的染色體發(fā)生整合，其結(jié)果是實(shí)現(xiàn)了親本間的基因轉(zhuǎn)移?；蜣D(zhuǎn)移通常是在后代中某些性狀得以表達(dá)，有體細(xì)胞雜種后代在遺傳上常常不穩(wěn)定，這可能涉及到多方面的因素，如親緣關(guān)系的遠(yuǎn)②優(yōu)點(diǎn)：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，擴(kuò)大雜交親本范圍，培育新優(yōu)良品種。③舉例：“白菜-甘藍(lán)”同白菜相比，具有生長(zhǎng)期短，耐熱性強(qiáng)，和易儲(chǔ)藏等優(yōu)點(diǎn)。植物體細(xì)胞胚發(fā)生是植物發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題。它涉及到從一個(gè)單一的植物細(xì)胞如何發(fā)展成為一個(gè)完整的胚胎的過(guò)程，這一過(guò)程涉及到復(fù)雜的細(xì)胞分裂、分化和基因表達(dá)調(diào)控。本文將概述植物體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)胞生物學(xué)研究進(jìn)展，并討論未來(lái)可能的挑戰(zhàn)和研究方向。植物體細(xì)胞胚發(fā)生涉及一系列復(fù)雜的分子和生化過(guò)程。近年來(lái)，利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，科學(xué)家們已經(jīng)鑒定出許多