激光共聚焦技術(shù)

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LSM510META激光共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)激光光源冷卻系統(tǒng)掃描器光學(xué)裝置熒光顯微鏡系統(tǒng)圖象存儲(chǔ)與處理及控制系統(tǒng)針孔光欄分光鏡發(fā)射熒光單色器檢測(cè)器第2頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM）是當(dāng)今世界上最先進(jìn)的分子生物學(xué)分析儀器之一。它是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使用紫外光或激光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化或生理功能的改變。成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)和遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新的有力研究工具。第3頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天激光共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中的應(yīng)用原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子、觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測(cè)核酸檢測(cè)蛋白質(zhì)細(xì)胞定位檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞器的觀察及測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞融合觀察細(xì)胞骨架檢測(cè)細(xì)胞間縫隙連接通訊檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化測(cè)定細(xì)胞內(nèi)pH變化檢測(cè)膜電位變化檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生檢測(cè)藥物等跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞過(guò)程及其定位檢測(cè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)熒光漂白恢復(fù)第4頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光顯微鏡系統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同，但又有其特點(diǎn)。需與掃描器連接。使激光能進(jìn)入顯微鏡物鏡照射樣品，并使樣品發(fā)射的熒光到達(dá)檢測(cè)器。需有光路轉(zhuǎn)換裝置。即汞燈與激光轉(zhuǎn)換，同時(shí)汞燈光線強(qiáng)度可調(diào)。熒光鏡座要有防震動(dòng)裝置。第5頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天激光共聚焦顯微鏡工作原理示意圖激光經(jīng)放大、分光后由物鏡聚焦于焦平面上，同時(shí)，焦平面上被激光掃描的點(diǎn)F所發(fā)出的一定波長(zhǎng)的熒光通過(guò)檢測(cè)針孔光欄達(dá)到檢測(cè)器，并成像于顯示器上，得到相應(yīng)的熒光圖象。第6頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天激光共聚焦顯微鏡基本操作獲取共焦圖像的步驟在VIS模式中觀察樣品

裝入LSM配置

掃描圖像

保存圖像第7頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同厚度光切圖像第8頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天

Z軸掃描時(shí)間系列掃描Z軸掃描＋時(shí)間系列掃描Z軸掃描、時(shí)間系列掃描第9頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天組織和細(xì)胞樣品中熒光的來(lái)源自發(fā)熒光熒光染色免疫熒光－熒光抗體法產(chǎn)生熒光外源性熒光物質(zhì)進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光酶致熒光第10頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光樣品的制備要求熒光標(biāo)記反應(yīng)的特異性強(qiáng)、熒光定位準(zhǔn)確保持樣品應(yīng)有的結(jié)構(gòu)形態(tài)完整性熒光信號(hào)的響應(yīng)準(zhǔn)確、靈敏、具有可重復(fù)性熒光強(qiáng)度適宜熒光穩(wěn)定性好樣品的熒光分布均勻兩種及兩種以上的熒光信號(hào)之間熒光光譜交叉可以消除圖象背景干凈、干擾雜質(zhì)少第11頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光探針的種類及應(yīng)用原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子、觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測(cè)蛋白質(zhì)、抗體及其他分子：熒光蛋白（GFP、YFP等）活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化：fluo-3/AM，fura-2第12頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光探針標(biāo)記樣品的過(guò)程樣品預(yù)處理給藥、切片或細(xì)胞標(biāo)本的制備熒光探針標(biāo)記樣品第13頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天百合花粉管鈣離子濃度梯度檢測(cè)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)百合花粉觀察花粉管生長(zhǎng)情況，長(zhǎng)度大概為花粉粒直徑的2－5倍，過(guò)長(zhǎng)的花粉管會(huì)彎曲扭轉(zhuǎn)不利于觀察。第14頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光探針Fluo-3（/AM）屬于單波長(zhǎng)染料，用于測(cè)定鈣離子的相對(duì)濃度。Fluo-3/AM是fluo-3的一種乙酸甲酯衍生物，fluo3/AM是脂溶性物質(zhì)，能跨膜進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)胞漿中被水解脫掉AM后，變成游離的fluo-3，因其不具備跨過(guò)完整細(xì)胞膜的特性因此停留在細(xì)胞內(nèi)。游離配體形式的fluo-3是非熒光性的，但是當(dāng)它與Ca2＋結(jié)合后，形成具有熒光的fluo-3-Ca，是細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加40至80倍，而且其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)[Ca2＋]呈正相關(guān)，因此可以得到Ca2＋濃度。另外Fluo3對(duì)于紫外光照射下可裂解的螯合鈣或其它形式的鈣也有作用。第15頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天save

“projection”

Projection第16頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天圖7～10.

7.連續(xù)降溫下生成Ca2+熒光隨時(shí)間變化的曲線同時(shí)記錄的熒光圖像,顯示冬小麥胞內(nèi)熒光有相同的變化趨勢(shì)。8.連續(xù)降溫下生成Ca2+熒光隨時(shí)間變化的曲線同時(shí)記錄的熒光圖像,顯示春小麥胞內(nèi)熒光有相同的變化趨勢(shì)。9.Fluo-3/AM染色后,靜息態(tài)下冬小麥原生質(zhì)體的三維重組圖像。10.Fluo-3/AM染色后,靜息態(tài)下春小麥原生質(zhì)體的三維重組圖像。劉煒等，低溫處理對(duì)冬、春小麥細(xì)胞Ca2+時(shí)空變化的影響，植物學(xué)報(bào)，2001，43(12):1218－1223第17頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天第18頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天目的蛋白細(xì)胞器定位觀察含有熒光蛋白的載體pA7-GFP目的基因洋蔥表皮第19頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天XbaI,SmaI,BamHI目的蛋白細(xì)胞器定位觀察含有熒光蛋白的載體pA7-GFPCaMV35SPromoterXhoI,NcoI,SalI,SpeIGFP目的基因第20頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天目的蛋白細(xì)胞器定位觀察對(duì)提取的質(zhì)粒，用目的基因的引物進(jìn)行PCR鑒定，出現(xiàn)了目的片段。根據(jù)pA7-GFPVector上提供的酶切位點(diǎn)，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切后進(jìn)行電泳分析，也出現(xiàn)了目的片段，表明目的片段已經(jīng)和質(zhì)粒DNA重組。

圖3-9pA7-TTG1重組質(zhì)粒酶切鑒定及PCR鑒定酶切：重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；M：MarkerDL2000；PCR：重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物第21頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天目的蛋白細(xì)胞器定位觀察含TTG1的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞將提取好的的含有目的基因的瞬時(shí)表達(dá)載體以及pA7-GFP載體約20μL分別加入1.5mL離心管中，分別加入500μL的蒸餾水，兩管分別標(biāo)號(hào)P1，P2。(2)分別取4片約1.5cm*1.5cm大小的洋蔥表皮放入P1，P2。(3)將P1，P2管管蓋打開(kāi)，用封口膜將其封上，扎兩到三個(gè)小孔。(4)將P1，P2管進(jìn)行抽真空，抽到剛剛沸騰為止，一共抽三次。(5)取MS培養(yǎng)基并在其上鋪上一層濾紙。(6)取出P1，P2管中的洋蔥表皮，將其鋪在MS培養(yǎng)基的濾紙上，加少量的水培養(yǎng)16小時(shí)。第22頁(yè),共23頁(yè)，2024年2月25日，星期天目的蛋白細(xì)胞器定位觀察

BrightGFP Merged

TTG1在津田蕪菁洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)A-C：G