附件2：兩面針5種成分含量測定 高效液相色譜一測多評法（征求意見稿）

Q/LB.□XXXXX-XXXXII前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園提出、歸口并宣貫。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)藥用植物園、廣西廣林正山藥業(yè)有限公司、深圳市中藥制造業(yè)創(chuàng)新中心有限公司、華潤三九醫(yī)藥股份有限公司。本文件主要起草人：朱艷霞、喬麗婭、胡鳳云、彭玉德、夏祥華、付金娥、張洪勝、馬慶、陳劍洪、劉光快、陸日文、唐真郎、李浩通。引言兩面針，為蕓香科植物兩面針（Zanthoxylumnididum(Roxb.)DC.）的干燥根，是廣西大宗道地藥材。兩面針中含有生物堿類、黃酮類、香豆素類、倍半萜類、木脂素類等多種化學成分，具有抗炎、抗菌、抗癌、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性。一測多評法是利用中藥有效成分內(nèi)在的函數(shù)關系和比例關系，通過測定其中一種成分而實現(xiàn)多種成分的同步測定，具有成本低、方法簡便等特點，在中藥材多指標質量評價中具有廣泛的應用前景?，F(xiàn)行兩面針質量標準僅以氯化兩面針堿為指標性成分，難以全面評價其質量。針對這一現(xiàn)狀，項目組研究制定了兩面針中5種成分的高效液相色譜一測多評測定方法，以保障兩面針藥材質量和安全性。兩面針5種成分含量測定高效液相色譜一測多評法范圍本標準規(guī)定了一測多評法測定兩面針中木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿等5種化學成分的含量的原理、試劑、儀器、色譜條件、測定步驟、結果計算和精密度。本文件適用于兩面針藥材中木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿含量的測定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。術語和定義下列術語和文件適用于本文件。一測多評法Quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker通過中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關系和比例關系,通過測定中藥中某個代表性成分的含量，依據(jù)相對校正因子可計算出該中藥中其他多種待測成分的含量，使其計算值與實測值符合定量方法學要求的一種多指標同步質量控制方法。相對校正因子Relativecorrectionfactor是一種修正因子，它的主要作用是修正測量值，以獲得更準確的實驗數(shù)據(jù)，提高研究質量，它的計算公式為某組分的絕對校正因子與標準物質的絕對校正因子之比。原理在同時測定兩面針多個指標質量成分的含量時，以兩面針中典型成分氯化兩面針堿做內(nèi)參物，分別求出內(nèi)參物與木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿等其它4個待測成分間的相對校正因子，并把相對校正因子作為一個常數(shù)用于相應成分的含量測定。試劑氯化兩面針堿：分析標準品，HPLC≥98%，化學式C21H18ClNO4，分子量383.83。甲醇：色譜純。乙腈：色譜純。儀器高效液相色譜儀：含四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器、柱溫箱和程序升溫控制系統(tǒng)。分析天平：精度0.1mg。超聲波清洗儀：功率≥500W。色譜條件AgilentEclipseC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相20%乙腈-0.1%甲酸（三乙胺調節(jié)pH至4.5）；體積流量1.0mL/min；柱溫30℃；檢測波長273、284nm；進樣量10μL。測定步驟制備樣品溶液精密稱定兩面針藥材粉末（粒徑≤0.5mm）1.0g，置于具塞錐形瓶中，加6mL的70%甲醇置于超聲波清洗儀中超聲提取30min，重復3次，合并提取液，用70%甲醇定容至50mL量瓶中，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試樣品溶液。制備標準品溶液用分析天平精密稱取氯化兩面針堿標準品適量，用70%甲醇溶解并定容至25mL，制備成0.05mg/mL的對照品貯備液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ缓髲馁A備液中分別精確量取5、2、1、0.4mL，用70%甲醇定容至10mL，即得0.025、0.01、0.005、0.002mg/mL的標準品溶液。繪制標準曲線分別吸取10μL濃度為0.05、0.025、0.01、0.005、0.002mg/mL的氯化兩面針堿標準品溶液依次注入高效液相色譜儀，按“7”的色譜條件，測定氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的峰面積As、A1、A2、A3和A4，以氯化兩面針堿峰面積（As）為縱坐標，對照品濃度（Cs）為橫坐標，繪制標準曲線。結果計算測定氯化兩面針堿含量吸取10μL樣品溶液注入高效液相色譜儀，按第“7”點的色譜條件，測定氯化兩面針堿的峰面積（As），根據(jù)標準曲線計算出氯化兩面針堿濃度（Cs）。計算木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的含量根據(jù)一測多評法確定木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的相對校正因子f1、f2、f3、f4分別為0.376、0.210、0.825、1.301。根據(jù)公式計算木蘭花堿濃度（C1）：C1=f1×Cs×A1/As。根據(jù)公式計算橙皮苷濃度（C2）：C