檢測蛋白之間相互作用的方法

關(guān)于檢測蛋白之間相互作用的方法

實驗?zāi)康模后w外檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用。用于驗證兩個已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。第2頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

原理：酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核細胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。研究發(fā)現(xiàn)，許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個可以分開的、功能上相互獨立的結(jié)構(gòu)域(domain)組成的。第3頁,共15頁，2024年2月25日，星期天例如，酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端有一個由147個氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNAbindingdomainBD)，C端有一個由113個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionactivationdomainAD).

第4頁,共15頁，2024年2月25日，星期天GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。但是，單獨的DNA結(jié)合域不能激活基因轉(zhuǎn)錄，單獨的轉(zhuǎn)錄激活域也不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能。第5頁,共15頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共15頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共15頁，2024年2月25日，星期天1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合，構(gòu)建成文庫質(zhì)粒。3、將這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細胞中4、酵母細胞中，已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄；反之，則不能。利用4種報告基因的表達，便可捕捉到新的蛋白質(zhì)

第8頁,共15頁，2024年2月25日，星期天盡管該系統(tǒng)己被證實為一種非常有效的方法，但它也有自身的缺點和問題。1、它并非對所有蛋白質(zhì)都適用，這是由其原理所決定的。雙雜交系統(tǒng)要求兩種雜交體蛋白都是融合蛋白，都必須能進入細胞核內(nèi)。因為融合蛋白相互作用激活報告基因轉(zhuǎn)錄是在細胞核內(nèi)發(fā)生的。

第9頁,共15頁，2024年2月25日，星期天2、假陽性的發(fā)生較為頻繁。所謂假陽性，即指未能與誘餌蛋白發(fā)生作用而被誤認為是陽性反應(yīng)的蛋白。而且部分假陽性原因不清，可能與酵母中其他蛋白質(zhì)的作用有關(guān)。3、在酵母菌株中大量表達外源蛋白將產(chǎn)生毒性作用，從而影響菌株生長和報告基因的表達。第10頁,共15頁，2024年2月25日，星期天實驗原理：利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST（GlutathioneStransferase）融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結(jié)合。因此，當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復(fù)合物混合時就可被吸附而分離.第11頁,共15頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

1）GST融合蛋白先與下列蛋白溶液之一孵育（a,單一明確的重組蛋白；b，細胞裂解蛋白混合液；c,體外翻譯cDNA表達得到的未知蛋白）

2）混合液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠反應(yīng)4oC2h

3）離心棄上清

4）沉淀加入2×蛋白LoadingBuffer煮沸，離心

第13頁,共15頁，2024年2月25日，星期天5）取上清進行SDS電泳，

6）考馬氏亮蘭染色觀察特異沉降的蛋白帶，進一步做質(zhì)譜分析確定沉降的蛋白；電泳后的膠也可以做WesternBlot來確定沉降的蛋白中是否有目的蛋白

該實驗設(shè)立GST對照，反應(yīng)均在4oC