細菌的生化試驗

關(guān)于細菌的生化試驗第2頁,共42頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共42頁，2024年2月25日，星期天細菌的基本鑒定技術(shù)生化反應鑒定：通過觀察細菌利用酶和降解糖類、醇類、脂類、蛋白質(zhì)和氨基酸的能力可以了解其生化活性，從而識別和鑒定細菌。免疫學鑒定（血清學鑒定）編碼鑒定第4頁,共42頁，2024年2月25日，星期天第一碳水化合物代謝試驗一、糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗：

原理：各種細菌含有發(fā)酵不同糖類的酶，分糖類的能力各不相同，且不同細菌分解同一種糖的代謝產(chǎn)物也不一定相同。第5頁,共42頁，2024年2月25日，星期天糖發(fā)酵試驗結(jié)果判斷反應現(xiàn)象結(jié)果描述酸性變色、有氣泡分解××糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣酸性變色、無氣泡分解××糖產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣培養(yǎng)基不變色不分解××糖第6頁,共42頁，2024年2月25日，星期天1．原理：細菌在分解葡萄糖的代謝過程中根據(jù)對氧分子參加的需要，分成三種類型：需要分子氧參加的為氧化型；能進行無氧降解的為發(fā)酵型，發(fā)酵型細菌無論在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖。在有氧和厭氧環(huán)境中都不能分解葡萄糖的細菌為產(chǎn)堿型或不活動型細菌。

二．葡萄糖的氧化/發(fā)酵試驗：第7頁,共42頁，2024年2月25日，星期天2．結(jié)果：發(fā)酵特征試管顏色不變而氧化特征試管顏色變黃，表明試驗細菌的葡萄糖分解代謝為氧化型；兩管顏色均變黃色為發(fā)酵型；兩支培養(yǎng)管顏色均不變?yōu)楫a(chǎn)堿型或不活動型。O管F管O管F管第8頁,共42頁，2024年2月25日，星期天糖發(fā)酵試驗第9頁,共42頁，2024年2月25日，星期天原理：細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等，使培養(yǎng)pH下降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑呈現(xiàn)紅色。如細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)(如醇、酮、醛、氣體和水)，培養(yǎng)基pH在5.4以上，甲基紅(MR)試驗呈橘黃色。三．甲基紅試驗：第10頁,共42頁，2024年2月25日，星期天2．結(jié)果：呈現(xiàn)紅色者為陽性；橘黃色為陰性；橘紅色為弱陽性。MR陰性MR陽性第11頁,共42頁，2024年2月25日，星期天某些細菌分解葡萄糖后生成丙酮酸，丙酮酸的分解產(chǎn)物則因細菌種類不同而有差別，如產(chǎn)氣腸桿菌能使丙酮酸脫羧產(chǎn)生中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰，在α-奈酚的催化作用下與培養(yǎng)基中氨基酸如精氨酸中的胍基化合物絡(luò)合形成紅色的化合物，即V-P試驗陽性。四．V-P試驗：第12頁,共42頁，2024年2月25日，星期天VP陰性VP陽性第13頁,共42頁，2024年2月25日，星期天五．β—半乳糖苷酶試驗(ONPG試驗)：遲緩分解乳糖的細菌可產(chǎn)生β—半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚-β-半乳糖苷(ONPG)而釋放出黃色的鄰硝基酚。故此試驗又稱為ONPG試驗。細菌分解乳糖需二種酶半乳糖苷滲透酶β—半乳糖苷第14頁,共42頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共42頁，2024年2月25日，星期天六．七葉苷水解試驗：1．原理：七葉苷可被細菌水解，生成葡萄糖和七葉素。七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反應生成黑色的化合物，使培養(yǎng)基變黑。2．結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏邽殛栃?，不變色者為陰性。?6頁,共42頁，2024年2月25日，星期天第二蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗有些細菌具有色氨酸酶，能分解培養(yǎng)基中的色氨酸，生成吲哚。吲哚與試劑對位二甲氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈紅色。一．吲哚試驗(靛基質(zhì)試驗)I陰性I陽性第17頁,共42頁，2024年2月25日，星期天二．尿素酶試驗：某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基變堿，使酚紅指示劑變紅色。U陽性U陰性第18頁,共42頁，2024年2月25日，星期天四．苯丙氨酸脫氨酶試驗：細菌分解氨基酸，可通過脫氨基或羧基生成反應物，這些反應由酶反應進行的，試驗應選擇合適底物。有些細菌能產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸氧化脫氨后生成苯丙酮酸，與三氯化鐵試劑產(chǎn)生深綠色反應。苯丙氨酸脫氨酶試驗陰性陽性第19頁,共42頁，2024年2月25日，星期天第三碳源利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗C陰性C陽性在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基中，細菌能利用的碳源只有枸櫞酸鹽，分解后生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性，pH指示劑溴麝香草酚藍由淡綠色變?yōu)樯钏{色。能利用枸櫞酸鹽作為碳源的細菌也可利用氮源。第20頁,共42頁，2024年2月25日，星期天第四呼吸酶類試驗硝酸鹽還原試驗硝酸鹽還原反應包括兩個過程：即細菌在合成代謝過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細胞內(nèi)其它含氮化合物；細菌在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。硝酸鹽還原的過程可因細菌不同而產(chǎn)物各異，有的細菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；有的細菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細菌還能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮；有的細菌還可以將其還原產(chǎn)物在合成代謝中完全利用。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果還原生成氣體的終末產(chǎn)物，如氮和氧化氮，稱為脫硝化作用。第21頁,共42頁，2024年2月25日，星期天硝酸鹽還原試驗是測定還原過程中生成的亞硝酸。硝酸鹽還原試驗陰性陽性第22頁,共42頁，2024年2月25日，星期天氧化酶試驗【原理】氧化酶又稱細胞色素氧化酶，能將還原型細胞色素C氧化形成水和氧化型細胞色素C，氧化型細胞色素C再使四甲基對苯二胺氧化，形成顯色反應。第23頁,共42頁，2024年2月25日，星期天氧化酶試驗【試劑與器材】1．菌種大腸埃希菌、銅綠假單胞菌2．試劑氧化酶試劑（1%四甲基對苯二胺）3．器材2cm×2cm濾紙片、污物缸第24頁,共42頁，2024年2月25日，星期天氧化酶試驗【操作步驟】1．將濾紙片疊成四方塊狀。2．用濾紙片的中心尖角小心刮取大腸埃希菌菌落，注意不可碰到培養(yǎng)基。3．輕輕展開濾紙片，刮取的菌落正好在濾紙片中心，滴加一滴1%四甲基對苯二胺。4．立刻觀察菌落顏色的變化。5．同法做銅綠假單胞菌的氧化酶試驗。第25頁,共42頁，2024年2月25日，星期天氧化酶試驗【結(jié)果】滴加氧化酶試劑后銅綠假單胞菌立刻變?yōu)樽仙?，為氧化酶陽性。大腸埃希菌不變色，為氧化酶陰性。

氧化酶試驗（左側(cè)為銅綠假單胞菌、右側(cè)為大腸埃希菌）第26頁,共42頁，2024年2月25日，星期天氧化酶試驗【注意事項】1．實驗中的菌種要求新培養(yǎng)的，不宜用陳舊的培養(yǎng)物。2．刮取細菌時不可碰到培養(yǎng)基，不可用接種環(huán)等金屬物品取菌。3．氧化酶試劑要新鮮配制，一般裝在棕色瓶中，放在冰箱中可保存一周，時間長了易被空氣氧化變色。4．結(jié)果要立刻觀察，1min內(nèi)變色者為陽性，超過1min變色的為陰性。5．在濾紙片上滴加試劑時不要過多，以剛潤濕紙片為宜，如濾紙片過濕，可能妨礙空氣與細菌接觸，延長反應時間，造成假陰性。第27頁,共42頁，2024年2月25日，星期天過氧化氫酶試驗【原理】過氧化氫酶試驗又稱觸酶試驗。部分細菌含有黃素蛋白，在代謝過程中與空氣中的氧發(fā)生反應，形成過氧化氫，過氧化氫對細菌有毒害作用，會破壞細胞組分，因此，細菌為保護自己，通常具有過氧化氫酶，可以催化裂解過氧化氫，形成水和氧氣。第28頁,共42頁，2024年2月25日，星期天過氧化氫酶試驗【試劑與器材】1、菌種金黃色葡萄球菌2、試劑3%過氧化氫3、器材載玻片、無菌移液器吸頭、酒精燈、火柴、超凈工作臺第29頁,共42頁，2024年2月25日，星期天過氧化氫酶試驗【操作步驟】1、在載玻片中央滴加一滴3%過氧化氫。2、用無菌移液器吸頭蘸取少量細菌，在3%過氧化氫中混勻?！窘Y(jié)果】觀察氣泡的產(chǎn)生情況?？梢钥匆娫谖^上金黃色葡萄球菌菌苔周圍，產(chǎn)生大量氣泡，為過氧化氫酶陽性。如果菌苔周圍無氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶陰性。第30頁,共42頁，2024年2月25日，星期天過氧化氫酶試驗【注意事項】1、普通金屬接種環(huán)可能與過氧化氫反應，形成氣泡，造成假陽性，因此必須使用鉑絲接種環(huán)或塑料、玻璃材質(zhì)的工具。2、從血液瓊脂平板上挑取菌落時千萬小心，不要碰到培養(yǎng)基，因紅細胞中有過氧化氫酶，即使一點點也會造成假陽性。3、過氧化氫試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。第31頁,共42頁，2024年2月25日，星期天第五復合生化試驗一．KIA試驗：

成分：KIA主要用糖是葡萄糖與乳糖，比例為1：10，指示劑為酚紅。內(nèi)還含有蛋白質(zhì)4種衍生物：牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨和胨，硫代硫酸鈉，鐵鹽等，無抑制物。KIA第32頁,共42頁，2024年2月25日，星期天連續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時后，在細菌和氧的作用下，培養(yǎng)基斜面部分所含氨基酸發(fā)生降解，釋放胺類，產(chǎn)即中和斜面部分酸，經(jīng)18～24小時后，整個斜面轉(zhuǎn)變?yōu)閴A性，又復原以紅色。

原理：如某菌只分解葡萄糖，不能分解乳糖，它分解葡萄糖產(chǎn)少量酸，在最初培育的8～12小時內(nèi)，這少量的酸也足以使深層和斜面酚紅指示劑變黃。第33頁,共42頁，2024年2月25日，星期天如某菌既分解葡萄糖，又分解乳糖，那在KIA上產(chǎn)生大量酸（因乳糖含量多），超過斜面上形成的堿，成長整管培養(yǎng)基呈黃色。培養(yǎng)基深層的氨基酸降解作用不足以中和細菌分解葡萄糖所產(chǎn)生的少量酸，故深層仍呈黃色。第34頁,共42頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基中的硫代硫酸鈉可供給細菌產(chǎn)生H2S所需要的硫，鐵鹽-硫酸亞鐵和枸櫞酸銨鐵分別與H2S起反應，產(chǎn)生不溶性的黑色FeS沉淀。由于細菌產(chǎn)生H2S需要在酸性環(huán)境中，所以KIA只限于瓊脂深層變黑。第35頁,共42頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果：堿性（K），酸性（A）

K/K：不發(fā)酵碳水化合物，為不發(fā)酵菌特征。

K/A：葡萄糖發(fā)酵，乳糖不發(fā)酵，如志賀菌。

K/A（黑色）：葡萄糖發(fā)酵，乳糖不發(fā)酵并產(chǎn)生硫化氫，如沙門菌。

A/A：葡萄糖和乳糖發(fā)酵，如大腸埃希菌和克雷伯菌屬。第36頁,共42頁，2024年2月25日，星期天二．動力靛基質(zhì)尿素試驗（MIU）

成分：MIU主要含尿素的半固體培養(yǎng)基，指示劑為酚紅，內(nèi)還有蛋白胨，蛋白胨中含有色氨酸。MIU第37頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

原理：當細菌在內(nèi)生長，通過半固體培養(yǎng)基可觀察其動力，另如果細菌能產(chǎn)生色氨酸酶，它可水解色氨酸形成靛基質(zhì)，當加入對-二甲氨基苯甲醛（靛基質(zhì)試劑）時可形成玫瑰色吲哚，玫瑰色吲哚為紅色。如該菌又能產(chǎn)生尿素酶利用培養(yǎng)基中的尿素產(chǎn)堿，加酚紅指示劑后顯桃紅色。因此MIU可以觀察細菌動力、靛基質(zhì)的產(chǎn)生和細菌分解尿素的活性。有動力無動力第38頁,共42頁，2024年2月25日，星期天A管：MIU＋－－B管：MIU＋＋＋第39頁,共42頁，2024年2月25日，星期天明膠水解實驗某些細菌能分泌明膠酶分解明膠，產(chǎn)生小分子物質(zhì)。如果細菌具有分解明膠的能力，則平板培養(yǎng)基中的明膠被分解成小分子的物質(zhì)，在平板上加上蛋白凝