《西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病苗期復(fù)合鑒定技術(shù)規(guī)程》征求意見稿

3T/JWMA007—2024西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病苗期復(fù)合鑒定技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了西瓜甜瓜品種（系）苗期對(duì)枯萎病、蔓枯病抗性鑒定及抗性評(píng)價(jià)的病原菌準(zhǔn)備、西瓜甜瓜苗期管理、病原菌接種、病情分級(jí)、調(diào)查、抗性分級(jí)等聯(lián)合抗性快速評(píng)價(jià)技術(shù)要求內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)適用于西瓜甜瓜等瓜類品種（系）對(duì)枯萎病、蔓枯病抗性鑒定及抗性評(píng)價(jià)工作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB32/T1189-2008西瓜穴盤育苗技術(shù)規(guī)程DB32∕T1994-2012甜瓜春提早穴盤育苗技術(shù)規(guī)程GB/T8321（所有部分）農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則GB16715.1瓜菜作物種子第1部分：瓜類3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1病情分級(jí)diseasegrade根據(jù)植株或離體葉片接種病原菌后植株發(fā)病程度或者葉片病斑大小而進(jìn)行定量化描述。3.2發(fā)病率rateofinfected（RI）西瓜甜瓜發(fā)病植株數(shù)占總調(diào)查植株數(shù)的百分比.發(fā)病率以Ri表示，數(shù)值以%計(jì)，按公式(1)計(jì)算。3.3病情指數(shù)diseaseindex(DI)是全面考慮發(fā)病率與嚴(yán)重度兩者的綜合指標(biāo)。以離體葉片為單位，當(dāng)嚴(yán)重度用分級(jí)代表值表示時(shí)，病情指數(shù)按公式(2)計(jì)算。4注意事項(xiàng)（1）注意用于蔓枯病病菌產(chǎn)生分生孢子的黃瓜材料需要選擇新鮮采摘的黃瓜果實(shí)。（2）用馬鈴薯液體培養(yǎng)液制備培養(yǎng)枯萎病菌孢子過程中，建議在培養(yǎng)液中加入鏈霉素等抗生素，防止細(xì)菌污染。（3）枯萎病接種鑒定過程主要需注意控制溫度、濕度條件，粗放的環(huán)境條件下，建議避開夏季高溫和冬季低溫，環(huán)境溫度宜控制在26±2℃,氣溫過高或過低都不利于枯萎病發(fā)病。（4）注意接種后每天都要定期觀察發(fā)病情況。5苗期聯(lián)合抗性鑒定方法5.1對(duì)照品種（系）4T/JWMA007—2024聯(lián)合抗性鑒定中需選用一個(gè)感病對(duì)照和一個(gè)抗病對(duì)照。西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病抗病感病對(duì)照可按表1選擇。表1對(duì)照品種列表5.2待鑒定品種（系）育苗及管理西瓜育苗管理按照DB32/T1189-2008執(zhí)行，甜瓜育苗管理按照DB32∕T1994-2012執(zhí)行。待出苗后長至3-5片真葉，備用?；铙w接種枯萎病菌后的西瓜甜瓜植株，定植于裝有滅菌育苗基質(zhì)的直徑為10cm的營養(yǎng)缽中，置于26±2℃的溫室培養(yǎng)管理，待后續(xù)觀察病情。5.3接種病原菌選擇尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.niveum(E.F.Smith)Snyder&Hansen），西瓜枯萎病菌以生理小種1為優(yōu)勢小種，為此宜選用1號(hào)生理小種Race1。甜瓜枯萎病菌株用尖孢鐮刀菌甜瓜專化型（Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.melonis(Leachetcurrence)SnyderetHansen）。蔓枯病菌株（Stagonosporopsiscitrulli.DBJSSY2）采用從病田收集、分離、純化，并經(jīng)致病性鑒定后所得的致病性強(qiáng)且穩(wěn)定的株系。5.4病原菌孢子繁殖準(zhǔn)備枯萎病菌孢子懸浮液準(zhǔn)備：取西瓜枯萎病菌接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基（葡萄糖20g，馬鈴薯200g，瓊脂15g,水1000mL），26±2℃培養(yǎng)5天，再將培養(yǎng)好的枯萎病菌絲塊接種于馬鈴薯培養(yǎng)液（葡萄糖20g，馬鈴薯200g，水1000mL），26±2℃,150r/min暗培養(yǎng)5-7天，4層紗布過濾后，加無菌蒸餾水稀釋，用血小球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成濃度為5×105個(gè)孢子·mL-1的孢子懸浮液備用。蔓枯病菌孢子懸浮液準(zhǔn)備：取蔓枯病病菌接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基（葡萄糖20g，馬鈴薯200g，瓊脂15g,水1000mL），26±2℃,16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)5-7天。選取新鮮無傷口的黃瓜經(jīng)流動(dòng)水沖洗干凈后，75%酒精擦拭表面，晾干后，在黃瓜表面輕微削去小塊表皮，培養(yǎng)好的菌株用直徑0.7cm的滅菌打孔器打取菌絲塊，菌絲塊倒置于黃瓜傷口上，培養(yǎng)箱中26±2℃暗培養(yǎng)，5-7天后根據(jù)分生孢子產(chǎn)生情況，用刀片刮取，研磨，4層紗布過濾后，加無菌蒸餾水稀釋，用血小球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成5×105個(gè)孢子·mL-1的孢子懸浮液備用。5.5離體葉片準(zhǔn)備取直徑9cm的培養(yǎng)皿，底部鋪設(shè)用苯并咪唑植物保鮮水溶液（11.8mg/L）浸濕的濾紙，然后從之前準(zhǔn)備的未接種枯萎病的健康植株上每株取下第二節(jié)位真葉，放置于濾紙上，以備蔓枯病菌接種用。5.6枯萎病苗期活體和蔓枯病離體葉片復(fù)合接種方法5T/JWMA007—2024枯萎病苗期活體接種：將前期在穴盤中長至3-5片真葉的待用植株小心取出，將根部用清水洗凈，吸水紙吸去水分，再浸在枯萎病菌孢子懸浮液中，5min后將幼苗移栽于裝有滅菌基質(zhì)，直徑為10cm的營養(yǎng)缽中，置于26±2℃溫室培養(yǎng)，接種3天后開始觀察并統(tǒng)計(jì)病情。蔓枯病離體葉片接種：使用噴壺（霧化率98%）將蔓枯菌孢子懸浮液（添加1%Tween80）均勻噴到準(zhǔn)備好的同批次離體葉片上，每個(gè)葉片噴霧至有明顯水滴，然后把培養(yǎng)皿放在光照培養(yǎng)箱中保存，培養(yǎng)條件為：溫度26±2℃,光照周期24h黑暗，相對(duì)濕度約90%，3天后觀察病情并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。6病害分級(jí)與鑒定6.1枯萎病分級(jí)枯萎病調(diào)查分級(jí)：病情分級(jí)按6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查記載,即：0級(jí)：無病癥；1級(jí)：子葉萎蔫或部分子葉與真葉輕微萎蔫：2級(jí)：1個(gè)真葉萎蔫或子葉較重萎蔫；3級(jí)：子葉及60%以上真葉萎蔫；4級(jí)：整株輕度萎蔫，60%以上枯死，但心葉仍成活；5級(jí)：整株嚴(yán)重萎蔫并枯死；其中，2級(jí)以下為抗病植株，3級(jí)以上為感病植株；統(tǒng)計(jì)接種后3d葉片，根據(jù)發(fā)病率進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，按公式（1）計(jì)算發(fā)病率，計(jì)算結(jié)果分成四個(gè)抗性等級(jí)，在感病對(duì)照發(fā)病率達(dá)80%以上,判定為鑒定有效，應(yīng)全面調(diào)查，對(duì)植株發(fā)病數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算發(fā)病率。6.2蔓枯病分級(jí)蔓枯病調(diào)查分級(jí)：根據(jù)離體葉片上病斑的大小進(jìn)行分級(jí)，各病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：葉片沒有病斑；1級(jí)：葉片病斑面積≤25%；2級(jí)：25%﹤?cè)~片病斑面積≤50%；3級(jí)：50%﹤?cè)~片病斑面積≤75%；4級(jí)：75%﹤?cè)~片病斑面積≤100%。蔓枯病接種3d后開始發(fā)病，離體葉片出現(xiàn)病斑，在感病對(duì)照病情指數(shù)達(dá)60.0以上時(shí)，判定為鑒定有效，應(yīng)全面調(diào)查。調(diào)查結(jié)果按公式（1）計(jì)算發(fā)病率和公式（2）計(jì)算病情指數(shù)。根據(jù)計(jì)算結(jié)果分為6個(gè)等級(jí)。6.3鑒定結(jié)果對(duì)照分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)6.3.1枯萎病抗性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)鑒定品種（系）的發(fā)病率的大小評(píng)定各品種對(duì)枯萎病抗性級(jí)別，各級(jí)別評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表2：表2西瓜甜瓜品種（系）枯萎病抗性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)6T/JWMA007—2024S根據(jù)鑒定品種（系）的病情指數(shù)大小評(píng)定各品種對(duì)蔓枯病抗性級(jí)別，各級(jí)別評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表3：表3西瓜甜瓜品種（系）蔓枯病抗性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)RS6.4鑒定記載表格西瓜甜瓜苗期抗枯萎病、蔓枯病性鑒定原始記錄及結(jié)果記載表見表4，抗性鑒定記錄保存2年以上。公式（1）…………（1）式中:Ri——發(fā)病率；ni——發(fā)病植株數(shù)；nt——總調(diào)查植株數(shù)。公式（2）…………………（2）式中:DI——鑒定品種病情指數(shù)；dc——相應(yīng)病級(jí)；nc——各病級(jí)病葉數(shù)；nt——總?cè)~片數(shù)。amax——最高病情分級(jí)值。1T/JWMA007—2024表4西瓜甜瓜枯萎病、蔓