westernblot基礎(chǔ)知識詳解

westernblot基礎(chǔ)知識詳解垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置電泳槽玻璃板、梳子、加樣校準(zhǔn)架等電轉(zhuǎn)移槽切膠板、黑白夾板、海綿墊等電泳儀

用途：用于生物學(xué)實驗中對特定目的蛋白質(zhì)的分離，定性及定量的檢測分析，是Western-blot（蛋白免疫印跡）實驗中非常重要的部分。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體（一抗）起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。Westernblot實驗原理抗原一抗生物素標(biāo)記的二抗ECL發(fā)光試劑Westernblot檢測蛋白表達(dá)實驗流程SDS電泳的基本原理聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠是在PAGE凝膠中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉，含有大量帶負(fù)電荷的SO32-），SDS能破壞蛋白質(zhì)分子的二級、三級結(jié)構(gòu)，在含有強還原劑的溶液中可與蛋白質(zhì)形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了，從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用，蛋白質(zhì)在SDS膠中的遷移率主要取決于其分子量的大小。PAGE：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強，具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過硫酸胺或核黃素（AP）；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基(freeradicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（AP—TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素——TMTED）體系。一

配分離膠準(zhǔn)備物品：玻璃板洗衣粉灌膠架移液槍兩個燒杯（1ml200ul20ul）30%Acrylamide1M（4度冰箱），Tris-HCL溶液（PH=8.8），

ddH2O10%AP

（-20冰箱）

，

TEMD（4度），SDS（常溫）1清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用ddH2O沖洗干凈后立在通風(fēng)處或烘箱中2配制分離膠：玻璃板對齊后放入夾中加緊，注意使兩玻璃板對齊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。先配制分離膠。配方如下：

具體情況依照說明書

灌分離膠：用1ml的移液槍吸取1ml膠沿玻璃放出，溶液緩慢加入到裝配好的玻璃板中至凝膠高度為6cm左右，預(yù)留1.5cm高度配制濃縮膠。用1ml的移液槍吸取1ml左右的異丙醇，壓平。沿玻璃放出，注意速度要慢，否則膠會被沖變形。溫箱放置0.5-1h左右至聚合完全。注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速灌膠，

灌膠速度須緩慢，避免產(chǎn)生氣泡

灌膠之上輕輕加一層異丙醇，用來壓平灌制分離膠隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:<8%異丁醇：>8%二配制濃縮膠準(zhǔn)備物品：移液槍燒杯（1ml200ul20ul）Tips：30%Acrylamide1M（4度冰箱），Tris-HCL溶液（PH=6.8），

ddH2O10%AP（-20冰箱）

，TEMD（4度），SDS（常溫）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已經(jīng)凝了。傾倒掉膠上層的異丙醇，后用吸水紙吸干。

注意吸水紙不要觸碰分離膠10%的分離膠配合6%的濃縮膠使用。配制濃縮膠，配方如下：6%的濃縮膠4mlddH2O2.39ml30%Acrylamide0.544ml1MTris-HCL溶液（PH=6.8）1.02ml10%APS40.82ulTEMD2.04ul配膠方法同上，各種溶液加入到燒杯中，后震蕩。灌濃縮膠：用1ml的移液槍將玻璃板中的剩余空間灌滿濃縮膠，灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。

灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。冰箱過夜待濃縮膠凝固后，取保險膜鋪平于桌上，另取兩張草紙鋪于保鮮膜上。用ddH2O浸濕草紙。取玻璃板放于草紙上，包好。放入4℃冰箱過夜。濃縮膠的濃度比較低（5%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺），里面的孔徑也比較大，所有的蛋白都能夠在進(jìn)入分離膠之前在同一水平線上（因為在你加樣的時候蛋白是分布在加樣孔中的，不在同一水平線上。）

分離膠的膠濃度比較大（>10%），里面膠孔徑也比較小，這樣施加電壓的時候小的蛋白可以穿過孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可能被攔住，就跑的慢。通過這種方式以分子量大小的區(qū)別來分離蛋白質(zhì)插梳子三電泳：固定：將玻璃板等裝置固定在電泳槽內(nèi)上樣：上所需要的蛋白質(zhì)樣品電泳3·1固定①用ddH2O水沖洗一下玻璃板，將其放入電泳槽中。注意，小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。②向電泳槽中加入1x電泳液③拔掉梳子，注意動作輕柔。5X電泳液緩沖液Tris（MW121.14）15.1g甘氨酸（MW75.07）94gSDS5.00g蒸餾水至1000ml3·2上樣

蛋白質(zhì)樣品的提取與制備蛋白濃度的測定計算上樣量用微量注射器吸取蛋白加入到上樣孔中。一般蛋白MARK的上樣孔在兩邊。3·1·1蛋白樣品制備

（1）單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?、倒掉培養(yǎng)液，將瓶倒扣在吸水紙使其吸干培養(yǎng)液。

2、向培養(yǎng)皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，搖床20min3、用勺子刮下細(xì)胞，并吸出液體至1.5ml離心管中，勺

子在處理不同樣本前清水洗凈、擦干（注意冰上操作）4、于4℃下12000rpm離心5min。

5、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒1.5min的離心管中放于-80℃保存。

（2）組織中總蛋白的提取：

1.將200mg組織塊剪碎，置于1ml裂解液中（5ml離心管）。

2.勻漿器進(jìn)行勻漿，注意冰上操作，勻漿后置于冰上。

3.10，000g,4℃,10min,（5ml管）離心

4.取上清至1.5ml管，12，000g,4℃,60min,

離心

5.取上清至新1.5ml管,-80℃儲存3·1·2蛋白樣品濃度的測定方法定氮法雙縮脲法Folin-酚試劑法紫外吸收法考馬斯亮藍(lán)法BCA法1.Bradford法簡介原理：考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（插入表格）檢測樣品蛋白含量：取一管考馬斯亮藍(lán)+95

l0.15mol/LNaClNaCl溶液+5

l待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入比色杯中測試。2.BCA法簡介實驗試劑:BCA試劑，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液試驗方法:根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。實驗操作:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線原理：BCA(bicinchonininc

acid二辛可寧酸)與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，一個Cu+螯合二個BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，最大光吸收強度與蛋白質(zhì)濃度成正比。3·1·3蛋白上樣量的計算

取含有提取好的蛋白的EP管，放在冰上融化，計算上樣量。可計算含50-100ug蛋白的溶液體積即為上樣量（根據(jù)自己的實驗需要進(jìn)行選擇，沒有固定的量）取出樣品至EP管中，加入1×上樣緩沖液至相同的上樣體積（上樣總體積一般不超過30μl）。上樣前要將樣品于沸水中煮5-10min使蛋白變性。4X上樣緩沖液

1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）2mlSDS0.8g溴酚藍(lán)0.04g甘油4ml去離子水定容至10ml?；靹蚝?，分裝于1.5ml離心管中，4℃保存。使用時稀釋成1X。3·1·4上樣上樣(注意：最外兩泳道易跑歪，盡量不用。)

Marker6μl（Marker加在最邊上的加樣孔中）

樣本20-30μl

實驗所用Marker電泳后出現(xiàn)10條帶：10，15，25，35，40，55，70，100，130，170KDa根據(jù)分子量的大小確定電壓和時間，marker跑開后變壓，一般溴酚藍(lán)離膠下１cm停止電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（一般要讓目的條帶跑過分離膠的1/3比較好）主要目的是確定靶蛋白的分子量大??；使用預(yù)染的Marker還可以實時檢測電泳分離情況，并可以轉(zhuǎn)移到膜上。蛋白質(zhì)MarkerPrestainedproteinladdersUnstainedproteinladdersFermentas上樣緩沖液Loadingbuffer顯示電泳進(jìn)程其中甘油可以增大樣品密度，使樣品沉降到點樣孔上，防止樣品漂出上樣Anode-內(nèi)槽緩沖液帶有負(fù)電荷，與凝膠頂部接觸外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸Cathode+帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從上到下運動（負(fù)極到正極），分開電泳進(jìn)程可以根據(jù)前沿指示劑來確定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止電泳小分子量蛋白跑的比較快.蛋白根據(jù)分子量大小分開蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷，因此電泳時可以從負(fù)極向正極移動標(biāo)本加入到上樣孔中四轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備物品：轉(zhuǎn)移槽黑紅夾子NC膜濾紙海綿墊轉(zhuǎn)膜緩沖液（1）轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張濾紙和1張NC膜。切濾紙和膜時一定要戴手套。將切好的NC膜和濾紙置于1X轉(zhuǎn)模緩沖液浸濕。10X轉(zhuǎn)膜緩沖液甘氨酸（MW75.07）151.1gTris（MW121.14）30.3g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存,用時稀釋10倍，并加入甲醇至20%

（2）夾子黑的一面：海綿-3張濾紙-膠-NC膜-3張濾紙-海綿①將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊。在墊子上墊三層濾紙，固定濾紙,搟去其中的氣泡。

②刮去玻璃板上的濃縮膠，小心剝下下層膠，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將NC膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。膜蓋下后不可再移動。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在1X轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。③將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用100V轉(zhuǎn)移1.5h。實際上應(yīng)該根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉(zhuǎn)膜時間④不同的轉(zhuǎn)膜裝置，轉(zhuǎn)移效率是不一樣的，所以換用轉(zhuǎn)膜裝置，最好再摸個條件；

轉(zhuǎn)膜時電極方向注意是膜正膠負(fù)。五封閉準(zhǔn)備物品：封閉液BSA（5%脫脂牛奶)搖床1x洗膜液1轉(zhuǎn)完膜后，關(guān)閉電源。取出轉(zhuǎn)膜槽，拿出夾子，取膜。2取已經(jīng)配制好的封閉液（5%脫脂牛奶)，加入到容器中。用鑷子將膜的一角夾起，放入到封閉液（5%脫脂牛奶)，注意使轉(zhuǎn)有蛋白的一面朝上。放置在搖床上封閉2-3h或過夜。根據(jù)蛋白Marker的標(biāo)記，切出目的蛋白的條帶和內(nèi)參蛋白的條帶。1XTBST緩沖液10XTBS緩沖液100ml

蒸餾水

900mlTween-201ml因Tween-20比較粘稠，應(yīng)緩慢吸取并可把槍頭剪掉一塊，即可防止產(chǎn)生氣泡。溶解后室溫保存。封閉液BSA（5%脫脂牛奶)：

1XTBST緩沖液95-100ml

脫脂奶粉/BSA

5g溶解后4℃保存，可于一周內(nèi)使用。六抗體的孵育一抗的孵育準(zhǔn)備物品：目的蛋白一抗內(nèi)參蛋白（GAPDH，beta-actin或beta-tubulin）一抗搖床①將一抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度（目的蛋白GluT31:300,actin1:2000）；將膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗體②放在搖床上室溫下孵育1-2h或過夜（目的蛋白GluT31.5h,actin1h）③洗膜

TBST洗膜放在搖床上震蕩10min，棄去洗膜液，如此反復(fù)3次。。二抗的孵育②根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋二抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個稀釋比例進(jìn)行摸索最佳稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時或過夜③洗膜

TBST洗膜放在搖床上震蕩10min，棄去洗膜液，如此反復(fù)3次。準(zhǔn)備物品：目的蛋白二抗內(nèi)參蛋白（GAPDH，beta-actin或beta-tubulin）二抗容器4℃冰箱搖床①從-20℃冰箱中取出已經(jīng)稀釋好的二抗溶液，室溫下融化。二抗的選擇根據(jù)一抗的種屬來源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗體，則二抗應(yīng)選擇山羊或其他來源抗兔的抗體，而且二抗要標(biāo)記有同位素或酶。

七ECL化學(xué)發(fā)光檢測（顯影）

準(zhǔn)備物品及儀器：Imagequant儀器

顯影液（A+B）移液槍

Tips

玻璃板

EP管淺盤1洗膜后，將膜放于草紙上，將洗膜液吸凈2進(jìn)入曝光室后，關(guān)閉電源，注意避光。3根據(jù)膜的大小來估計加入顯影液的量。將等量A液和B液加入到EP管中混勻后，用移液槍吸取均勻點于膜上。4放入機器中，點擊fouces按鈕，觀察膜的位置是否放正。5點擊Start按鈕，選擇auto進(jìn)行曝光。然后進(jìn)行圖片保存，注意，有兩種圖片保存格式。7根據(jù)曝光后條帶顯影的強弱選擇手動曝光的時間。手動曝光①將A和B兩種試劑等量（常用各500μl）在5ml離心管中等體積混合；

打開X-光片夾，鋪上保鮮膜，將NC膜面朝上放于保鮮膜上，滴加此混合液1-3min后（見到熒光）②將顯影液和定影液分別到入盤中；在紅燈下，取出X－光片，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，開始計時；根據(jù)信號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，一般為1min到5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達(dá)最佳效果；③曝光完成后，將X-光片迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影結(jié)束后，再放到定影液中進(jìn)行定影。定影時間一般為5～10min，以膠片透明為止SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗