腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

關(guān)于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)12內(nèi)容綱要腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要性和應(yīng)用體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的特征腫瘤細(xì)胞系的建立癌細(xì)胞系的建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立癌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的鑒定第2頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天3一、腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要性和應(yīng)用腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測(cè)、腫瘤細(xì)胞和癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。第3頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天41、腫瘤病因和發(fā)病機(jī)制的研究體外試驗(yàn)證明了物理因素（如射線(xiàn)）、化學(xué)因素（化學(xué)致癌劑）及生物因素（致癌病毒、EB病毒、SV40和多發(fā)瘤病毒等），均能使正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，致使正常細(xì)胞永生化或惡性化，為癌的誘發(fā)因素和環(huán)境提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。環(huán)境因素或藥物的致畸、致突變研究也可為該環(huán)境條件或藥物的致癌性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，因此細(xì)胞培養(yǎng)是癌的發(fā)生和發(fā)展研究的理想實(shí)驗(yàn)研究手段。第4頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天52、抗癌藥物篩選方面的研究不同的癌細(xì)胞對(duì)不同的化療藥物具有不同的敏感性。采用癌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，既可研究某種藥物對(duì)不同癌細(xì)胞的敏感性，為藥物抗癌敏感譜提供依據(jù)；同時(shí)又可采用某種癌細(xì)胞開(kāi)展對(duì)不同藥物，不同劑量的敏感性研究，以篩選出對(duì)該腫瘤最敏感的化療藥物和使用劑量，供人體治療時(shí)參考。第5頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天63、癌基因和抑癌基因方面的研究實(shí)驗(yàn)證明癌的發(fā)生和發(fā)展與癌基因（原癌基因）和抑癌基因兩種基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。體外細(xì)胞培養(yǎng)既利于測(cè)定癌基因及癌基因表達(dá)產(chǎn)物，又可以測(cè)定抑癌基因的表達(dá)水平。癌細(xì)胞的體外培養(yǎng)是定量研究癌基因和抑癌基因表達(dá)調(diào)控的理想工具。第6頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天74、癌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和逆轉(zhuǎn)方面的研究血癌往往是由低分化的幼稚細(xì)胞的單克隆惡性增生所引起，若將血癌的體細(xì)胞通過(guò)體外誘導(dǎo)分化，促使向終未細(xì)胞分化成為功能性血液細(xì)胞，這就可使血癌患者獲得完全緩解或達(dá)到治愈的目的。這些試驗(yàn)只有采用細(xì)胞培養(yǎng)法才能在短期內(nèi)觀察到細(xì)胞的變化，動(dòng)物試驗(yàn)很難判定藥物的直接作用，因此細(xì)胞培養(yǎng)及癌的細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞工程是進(jìn)行抗癌研究、癌細(xì)胞的惡性逆轉(zhuǎn)研究理想的實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型。第7頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天85、癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)研究抗癌的間接效應(yīng)，往往是藥物作用于機(jī)體免疫系統(tǒng)促使免疫細(xì)胞發(fā)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性和非特異性的免疫應(yīng)答，如釋放免疫調(diào)節(jié)因子（如IFN、IL-2等）或細(xì)胞毒因子（LT、TNFα/β），以及激活殺傷腫瘤的淋巴細(xì)胞發(fā)揮殺腫瘤效應(yīng)。這種效應(yīng)均可通過(guò)體外殺腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)來(lái)證實(shí)，取同體淋巴細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，并加入IL-2/IFN-γ等，能明顯增強(qiáng)NK、TCL、LAK和TIL殺腫瘤活性。經(jīng)擴(kuò)增達(dá)一定數(shù)量后再回輸給病人，其療效明顯。第8頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天9二、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的特征

腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長(zhǎng)增殖、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。第9頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天10培養(yǎng)中癌細(xì)胞無(wú)光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核漿比例大。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則。1、形態(tài)第10頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天112、生長(zhǎng)增殖（不受控增殖性）失去接觸抑制，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。失去錨著依賴(lài)性，可在瓊脂、甲基纖維素等支撐物上生長(zhǎng)。低血清要求，不依賴(lài)生長(zhǎng)因子，因其可自分泌產(chǎn)生促增殖因子。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜?xì)胞強(qiáng)。第11頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天123、永生性永生性也稱(chēng)不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無(wú)限傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系（株）都表現(xiàn)有這種性狀。永生性和惡性（包括浸潤(rùn)性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控。從一些具有永生性而無(wú)惡性的細(xì)胞系，如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等細(xì)胞可以證明。第12頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天134、致瘤性細(xì)胞接種同種動(dòng)物或裸鼠后的致瘤性是客觀反映細(xì)胞惡性程度的指標(biāo)。具體做法是：

1）收集培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍；2）計(jì)數(shù)后將0.2ml含2×106～2×107個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液注射到動(dòng)物皮下。約一個(gè)月左右（最短在3天后），可見(jiàn)注射局部有腫瘤出現(xiàn)，甚至有轉(zhuǎn)移瘤形成。經(jīng)病理組織學(xué)檢查可以確定腫瘤是否由接種的細(xì)胞產(chǎn)生。也可接種到腹腔或通過(guò)鼠尾靜脈注射。第13頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天145、浸潤(rùn)性浸潤(rùn)性是腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能浸潤(rùn)入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長(zhǎng)的能力。第14頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天156、異質(zhì)性通過(guò)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及克隆分析發(fā)現(xiàn)，同一腫瘤是由具有不同生物學(xué)特征的細(xì)胞亞群構(gòu)成的。這些細(xì)胞亞群的浸潤(rùn)性、生長(zhǎng)率、轉(zhuǎn)移能力、核型、對(duì)激素的反應(yīng)、對(duì)抗癌藥物的敏感性均不同，這種特性被稱(chēng)為腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性（heterogeneity）。第15頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天16同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別，有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱(chēng)腫瘤干細(xì)胞。只有腫瘤干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分。第16頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天177、細(xì)胞遺傳

大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。第17頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天18體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的三個(gè)顯著基本特征：永生性不受控增殖性致瘤性第18頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天19三、腫瘤細(xì)胞系的建立惡性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)建立細(xì)胞系，包括從人或動(dòng)物惡性腫瘤取材建立癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞在體外經(jīng)理化、生物因素誘發(fā)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系可以是惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞和一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞兩種。第19頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天20惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和癌細(xì)胞系一樣具有永生性和惡性表型，對(duì)此兩種來(lái)源的細(xì)胞系鑒定也是相似的，為研究惡性腫瘤提供了有用模型。一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞系只具有無(wú)限生長(zhǎng)能力，不具有惡性細(xì)胞的表型，此種細(xì)胞系可相似于正常細(xì)胞的模型而被應(yīng)用。第20頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天21癌細(xì)胞培養(yǎng)的最主要的問(wèn)題是從體內(nèi)到體外環(huán)境的改變。培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，有些腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)，但在體外卻難以生長(zhǎng)。癌細(xì)胞系的建立

第21頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天22①依賴(lài)性：腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長(zhǎng)力，但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存，二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴(lài)。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會(huì)同時(shí)消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的活性。腫瘤細(xì)胞在體外不易生長(zhǎng)的可能原因：

癌細(xì)胞系的建立

第22頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天23②腫瘤細(xì)胞的自分泌也會(huì)因分散培養(yǎng)而被稀釋?zhuān)_(dá)不到腫瘤生長(zhǎng)的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖力。③并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長(zhǎng)活力和長(zhǎng)的生命周期，只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長(zhǎng)能力，但這些細(xì)胞數(shù)量很少。④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。癌細(xì)胞系的建立

第23頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天24（一）癌細(xì)胞原代培養(yǎng)癌細(xì)胞建系的方法和程序相似于正常細(xì)胞，包括標(biāo)本收集和處理、原代培養(yǎng)、傳代、換液、凍存、復(fù)蘇等過(guò)程。培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。癌細(xì)胞系的建立

第24頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天251、取材

人腫瘤細(xì)胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時(shí)盡量避免，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是很好的培養(yǎng)材料。癌細(xì)胞系的建立

第25頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天26取材后盡快將癌組織進(jìn)行培養(yǎng)，一般4小時(shí)內(nèi)細(xì)胞存活最好。標(biāo)本在4℃存放，不宜超過(guò)24小時(shí)。癌細(xì)胞系的建立

第26頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天27人癌細(xì)胞建系必須要有完整的記錄，包括組織來(lái)源、病人姓名、住院號(hào)、年齡、性別、臨床診斷、病理診斷（應(yīng)明確分類(lèi)分期）、術(shù)前放化療情況，為細(xì)胞建系的重要材料。為了鑒定建立的細(xì)胞系來(lái)源和生物學(xué)特性，最好留有病人正常組織和血標(biāo)本。癌細(xì)胞系的建立

第27頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天282、分離

單純的機(jī)械方法分離如吹打和過(guò)濾對(duì)癌細(xì)胞損傷小。有些腫瘤如人卵巢癌、某些神經(jīng)膠質(zhì)瘤可采用。癌組織多為較堅(jiān)實(shí)的實(shí)體，腫瘤細(xì)胞包埋在大量的纖維基質(zhì)中，難以進(jìn)行機(jī)械分離。因此酶消化法是分散癌細(xì)胞的好方法。癌細(xì)胞系的建立

第28頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天29胰蛋白酶是分離細(xì)胞最常應(yīng)用的酶，但它對(duì)結(jié)締組織的消化能力有限，適合含結(jié)締組織較少的腫瘤，并且對(duì)細(xì)胞膜有損害作用，影響細(xì)胞存活。膠原蛋白酶僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大，適于分離纖維性組織、上皮及癌組織。癌細(xì)胞系的建立

常用酶：第29頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天30膠原酶的消化方法：0.5mg／ml膠原酶處理，可在顯微鏡下觀察，纖維細(xì)胞逐漸被除去為止。用Hanks液或培養(yǎng)基洗滌，除去附著細(xì)胞的酶，再進(jìn)行接種和培養(yǎng)。癌細(xì)胞系的建立

第30頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天31注意：當(dāng)腫瘤組織標(biāo)本很小，不能用酶消化獲取癌細(xì)胞時(shí)，可以用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)。癌組織中不可避免有已耗竭和壞死的細(xì)胞，在酶消化前，應(yīng)盡可能清除，以免接種后很快溶解破壞，釋放出影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)的有害物。癌細(xì)胞系的建立

第31頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天323、接種細(xì)胞

消化后制備的癌細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)有足夠的細(xì)胞密度，通常接種細(xì)胞濃度為5×105／ml，37℃培養(yǎng)。癌細(xì)胞系的建立

第32頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天334、成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)的去除

常采用機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法和密度梯度離心法等。用選擇培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層等方法可以克服其過(guò)度生長(zhǎng)。癌細(xì)胞系的建立

第33頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天34

將玻璃吸管前端在火焰上燒彎曲，用作除去成纖維細(xì)胞的工具?？稍陲@微鏡下直接刮除生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞，也可事先在顯微鏡下對(duì)有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的單層培養(yǎng)瓶上做出標(biāo)記，然后按標(biāo)記刮除。刮除后，用培養(yǎng)液洗1~2次后，加入新培養(yǎng)液培養(yǎng)。如需要可多次刮除。（1）機(jī)械刮除法癌細(xì)胞系的建立

第34頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天35根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類(lèi)細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類(lèi)細(xì)胞相互分離。（2）反復(fù)貼壁法癌細(xì)胞系的建立

第35頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天36待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后用胰酶消化，Hanks沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；取編號(hào)為A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B瓶中；向A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶?jī)深?lèi)細(xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次。癌細(xì)胞系的建立

第36頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天37（3）消化排除法先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下觀察和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化；把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶?jī)?nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。癌細(xì)胞系的建立

第37頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天38（4）膠原酶消化法

本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇?？捎?.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化；用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。癌細(xì)胞系的建立

第38頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天39（5）其它方法聚丙烯酰胺抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)密度梯度離心等癌細(xì)胞系的建立

第39頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天405、選擇性培養(yǎng)基

選擇性培養(yǎng)基是針對(duì)特殊細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求設(shè)計(jì)的。在癌細(xì)胞建系中，選擇性培養(yǎng)基的應(yīng)用是提高癌細(xì)胞體外存活、抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵技術(shù)改進(jìn)。癌細(xì)胞系的建立

第40頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天41HITES選擇培養(yǎng)基是一種改良RPMI-1640培養(yǎng)基，含有氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、雌激素、硒等成分。HITES培養(yǎng)基適合用于人小細(xì)胞肺癌建系。癌細(xì)胞系的建立

第41頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天42為了抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，在培養(yǎng)基中加入成纖維細(xì)胞的抗體或成纖維細(xì)胞代謝抑制成分，也可提高癌細(xì)胞系建系率。血清對(duì)上皮細(xì)胞有抑制作用有利于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。因此用低或無(wú)血清培養(yǎng)基為好。癌細(xì)胞系的建立

第42頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天436、飼養(yǎng)層

在培養(yǎng)器皿底部接種能形成接觸性抑制的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，可以有利于癌細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制癌組織中正常成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。如人胎小腸細(xì)胞（FHs74Int）、小鼠3T3細(xì)胞或STO鼠胚成纖維細(xì)胞。癌細(xì)胞系的建立

第43頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天44（二）癌細(xì)胞原代培養(yǎng)的換液和傳代癌細(xì)胞系的建立

1、換液通常細(xì)胞產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)上清呈黃色時(shí)，需要及時(shí)換液，癌細(xì)胞在對(duì)數(shù)期增殖迅速，每天均需換液，倍增時(shí)間較長(zhǎng)的細(xì)胞可以隔日換一次。第44頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天452、傳代原代培養(yǎng)的癌細(xì)胞應(yīng)掌握合適的第二代傳代時(shí)間。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)不同，表現(xiàn)為重疊生長(zhǎng)。當(dāng)在顯微鏡下觀察到上皮樣細(xì)胞匯合達(dá)50%左右，可見(jiàn)細(xì)胞層上堆積有圓形的細(xì)胞，指示細(xì)胞增殖活躍時(shí)就可以傳代。癌細(xì)胞系的建立

第45頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天46常規(guī)傳代：原代培養(yǎng)物第一次傳代后，需要常規(guī)傳代維持細(xì)胞在體外正常生長(zhǎng)。每種細(xì)胞系傳代時(shí)間有所不同。通常在細(xì)胞接種后5天左右傳代一次。一瓶癌細(xì)胞傳到1~5瓶。如果計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，每瓶可接種2~4×105細(xì)胞。為建成永久性細(xì)胞系需長(zhǎng)期傳代達(dá)50次以上。癌細(xì)胞系的建立

第46頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天473、凍存和復(fù)蘇

建系過(guò)程需要不斷凍存細(xì)胞以防止細(xì)胞系中斷。從第一代傳代后，就應(yīng)盡早地凍存培養(yǎng)物。且凍存不同傳代次數(shù)的細(xì)胞。凍存細(xì)胞和復(fù)蘇方法與正常細(xì)胞相同，可參照正常細(xì)胞。癌細(xì)胞系的建立

第47頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天48（三）癌細(xì)胞系建立注意事項(xiàng)取材應(yīng)選擇活力較好的部位，盡快培養(yǎng)且要防止污染。及時(shí)去除生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞。掌握好傳代時(shí)間，細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)到足夠量時(shí)不要急于傳代。早期應(yīng)先以高濃度接種，再逐漸降低。對(duì)于增殖能力低的細(xì)胞，應(yīng)放入飼養(yǎng)層中培養(yǎng)，并加入一些促生長(zhǎng)物質(zhì)。精心傳代、換液、避免污染，需經(jīng)半年以上的細(xì)胞培養(yǎng)，方能夠達(dá)到建立細(xì)胞系的目的。癌細(xì)胞系的建立

第48頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天49轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是指細(xì)胞發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的遺傳改變而引起恒定的表型改變?？捎杉?xì)胞本身基因不穩(wěn)定（嚙齒類(lèi)）在傳代中自發(fā)發(fā)生，也可用放射、致突變劑、病毒以及外源基因等因素處理，引起細(xì)胞產(chǎn)生遺傳改變。第49頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天50轉(zhuǎn)化的表型變化主要有3類(lèi)：

有限分裂的細(xì)胞變?yōu)闊o(wú)限增殖的細(xì)胞，獲得不死性，成為永久性細(xì)胞系。細(xì)胞不正常自主性生長(zhǎng)，喪失接觸抑制、過(guò)飽和密度、無(wú)停泊依賴(lài)等生長(zhǎng)特點(diǎn)。致瘤性，細(xì)胞可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)浸潤(rùn)生長(zhǎng)，形成腫瘤。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第50頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天51致瘤性是判斷惡性轉(zhuǎn)化或一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞系最主要的指標(biāo)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第51頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天52（一）誘變轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法1、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇可從原代培養(yǎng)的正常細(xì)胞、傳代的正常細(xì)胞選擇。成纖維細(xì)胞易于轉(zhuǎn)化，上皮細(xì)胞較難。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第52頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天53化學(xué)致突變劑：常用的甲基硝基亞硝基胍（N-methy-N-nitro-Nnitrosoguanidine，MNNG）；物理方法：射線(xiàn)照射；病毒轉(zhuǎn)化：用EB病毒感染淋巴細(xì)胞引起轉(zhuǎn)化，SV40病毒轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞成為惡性細(xì)胞；用外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，包括癌基因如ras、mye，病毒基因如SV40LT抗原基因和端粒酶基因等。2、轉(zhuǎn)化因素轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第53頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天54（二）外源基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞程序：

選擇合適的外源基因，如SV40LT抗原基因轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞有效。構(gòu)建外源基因表達(dá)載體（質(zhì)粒），含有合適的標(biāo)記基因作為陽(yáng)性傳染細(xì)胞的選擇（質(zhì)粒上有新霉素耐受基因，可用G418選擇）。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第54頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天55選擇合適的轉(zhuǎn)基因方法：化學(xué)方法最常用磷酸鈣、脂質(zhì)體、基因槍、電轉(zhuǎn)移等。選擇合適的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，易培養(yǎng)和傳代，無(wú)自發(fā)轉(zhuǎn)化能力。用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲陽(yáng)性集落。證明外源基因有無(wú)表達(dá)。證明轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表型是否改變和有無(wú)致瘤性。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第55頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天561、SV40LT抗原基因轉(zhuǎn)化人的成纖維細(xì)胞

雖然鼠來(lái)源的成纖維細(xì)胞可以經(jīng)培養(yǎng)后成為長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞系，但人的成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)很難成為永久細(xì)胞系。用SV40LT抗原基因轉(zhuǎn)化人的成纖維細(xì)胞是最成功的方法。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第56頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天572、轉(zhuǎn)染端粒酶基因端粒酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，抵消細(xì)胞分裂所致端?？s短，是細(xì)胞獲得不死性的重要分子機(jī)制。轉(zhuǎn)染外源端粒酶基因于有限期傳代的正常細(xì)胞系，包括人上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，均可誘導(dǎo)產(chǎn)生永久性細(xì)胞系，并證明了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中端粒酶表達(dá)和端?？s短受到了控制。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第57頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天58SV40誘導(dǎo)的不死性細(xì)胞，伴有細(xì)胞不正常分化和核型不穩(wěn)定，表現(xiàn)出對(duì)動(dòng)物一定程度的致瘤性。而端粒酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞很少有核型的改變和上皮細(xì)胞分化的特點(diǎn)，保持更多正常細(xì)胞的表型。說(shuō)明SV40LT多引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而端粒酶基因主要誘導(dǎo)細(xì)胞獲得不死性。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第58頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天593、轉(zhuǎn)基因小鼠

利用轉(zhuǎn)基因小鼠可以建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，基本方法是設(shè)計(jì)有某種基因突變、缺失、嵌入的病毒基因DNA，植入小鼠的卵母細(xì)胞。發(fā)育的轉(zhuǎn)基因小鼠將攜帶有表達(dá)某種基因的組織，從小鼠組織取材，可以獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。因此，利用轉(zhuǎn)基因小鼠是建立細(xì)胞系快速有效的方法。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第59頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天60（三）EB病毒感染B細(xì)胞EB病毒感染人外周血B淋巴細(xì)胞后，B細(xì)胞便能夠被轉(zhuǎn)化，并在體外傳代生長(zhǎng)，建立細(xì)胞系，長(zhǎng)期儲(chǔ)存在液氮，解決研究中大量細(xì)胞的來(lái)源。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第60頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天61（四）轉(zhuǎn)化細(xì)胞系建立注意事項(xiàng)建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，通常用已建成的正常細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所以不存在上述癌細(xì)胞建系原代培養(yǎng)所存在的問(wèn)題。能否建成轉(zhuǎn)化細(xì)胞，除要選擇合適的細(xì)胞系外（遺傳形狀過(guò)于穩(wěn)定的細(xì)胞不易轉(zhuǎn)化）對(duì)轉(zhuǎn)化方法的選擇也很關(guān)鍵。從轉(zhuǎn)基因小鼠組織取材建立細(xì)胞系在國(guó)外已有一些報(bào)告，該方法的應(yīng)用，不僅提高了建系率，而且使那些常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法不能建立的細(xì)胞系，通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以建立攜帶某種靶基因的細(xì)胞系，為細(xì)胞培養(yǎng)和建立細(xì)胞系開(kāi)拓了新的局面。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立第61頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天62四、癌細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的鑒定癌細(xì)胞系的鑒定主要包括細(xì)胞組織來(lái)源和惡性特征。轉(zhuǎn)化細(xì)胞如果是正常細(xì)胞系轉(zhuǎn)化而來(lái)，不需再進(jìn)行組織來(lái)源鑒定，僅明確是否已獲得了不死性，經(jīng)確定是惡性轉(zhuǎn)化或一般轉(zhuǎn)化。第62頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天631、光鏡直接檢查2、細(xì)胞染色檢查3、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的檢查（一）細(xì)胞形態(tài)學(xué)第63頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天641、光鏡直接檢查呈多邊形上皮樣細(xì)胞；癌細(xì)胞失去接觸性抑制，呈現(xiàn)重疊生長(zhǎng)?？梢?jiàn)細(xì)胞重疊層上有折光度強(qiáng)的圓形細(xì)胞。這些特點(diǎn)可與正常上皮細(xì)胞區(qū)分，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可出現(xiàn)與癌細(xì)胞重疊生長(zhǎng)相似的特點(diǎn)。第64頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天652、細(xì)胞染色檢查見(jiàn)正常細(xì)胞鑒定，除Giemsa染色外，可用瑞氏結(jié)晶紫等染色癌細(xì)胞呈多邊形，排列不規(guī)則，細(xì)胞重疊。細(xì)胞核大，核漿比例增大，深染突出、不規(guī)則，可見(jiàn)異常分裂象。有的上皮樣轉(zhuǎn)化細(xì)胞有相同特點(diǎn)。第65頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天663、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的檢查細(xì)胞核大，不規(guī)則。胞漿內(nèi)如觀察到橋粒、張力原纖維等為上皮細(xì)胞的特點(diǎn)，觀察到分泌顆粒是腺細(xì)胞特點(diǎn)，如有神經(jīng)分泌顆粒是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特點(diǎn)。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查對(duì)于鑒定細(xì)胞系的組織來(lái)源和細(xì)胞惡性特點(diǎn)有重要意義。第66頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天67（二）染色體異常癌細(xì)胞是異倍體，存在染色體缺失、重排和移位等異常。染色體顯帶技術(shù)可用于檢查和鑒別正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞染色體差異。此技術(shù)是用特殊技術(shù)將染色單體上著色出深淺帶（band），顯示染色體的結(jié)構(gòu)。第67頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天68（三）體外生長(zhǎng)異常癌細(xì)胞（或轉(zhuǎn)化細(xì)胞）體內(nèi)外無(wú)控制增殖是惡性細(xì)胞的特征。癌細(xì)胞喪失正常細(xì)胞接觸性抑制、停泊依賴(lài)等生長(zhǎng)特點(diǎn)，表現(xiàn)為增殖加速，生長(zhǎng)呈過(guò)飽和密度，在軟瓊脂上形成集落等不正常生長(zhǎng)特點(diǎn)。通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)，對(duì)于鑒定惡性生長(zhǎng)有重要意義。第68頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天691、生長(zhǎng)曲線(xiàn)和倍增時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)歷一代（從上一代傳代到下一次傳代的時(shí)間），包括潛伏期、對(duì)數(shù)期、平坦期三個(gè)階段。通過(guò)計(jì)數(shù)7天細(xì)胞，可以記錄出生長(zhǎng)階段，繪制出生長(zhǎng)曲線(xiàn)，計(jì)算出細(xì)胞倍增時(shí)間?？设b定癌細(xì)胞和正常細(xì)胞群體生長(zhǎng)增殖速度的差異。第69頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天70癌細(xì)胞潛伏期短，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)明顯，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與轉(zhuǎn)化前細(xì)胞相比較，可見(jiàn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速度明顯增加。依據(jù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)，可計(jì)算出細(xì)胞倍增時(shí)間。倍增時(shí)間短，反映了細(xì)胞惡性生長(zhǎng)。第70頁(yè),共80頁(yè)，2024年2月25日，星期天712、克隆效應(yīng)（cloningefficiency）克隆效應(yīng)也可稱(chēng)為集落形成率（rateovcolohyformation），是檢測(cè)群體細(xì)胞中增殖細(xì)胞的比率，可反應(yīng)細(xì)胞系的增殖能力，因此是鑒別腫瘤細(xì)胞（或轉(zhuǎn)化細(xì)胞）與正常細(xì)胞的增殖能力的指標(biāo)。第71頁(yè),共80頁(yè)，2