金櫻子總有機酸的超聲提取工藝研究

金櫻子總有機酸的超聲提取工藝研究【摘要】目的：研究金櫻子總有機酸的最佳超聲提取工藝。方法：采用超聲提取法，以總有機酸提取率為指標(biāo)，考察超聲功率、超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)三個因素，并利用正交試驗法優(yōu)化得到最佳提取工藝。結(jié)果：金櫻子總有機酸的平均加樣回收率為100.58%，RSD為2.42%；最佳超聲提取工藝為超聲功率為450W、超聲時間60min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，在此條件下金櫻子總有機酸平均提取率為0.76%。結(jié)論：正交試驗法優(yōu)化得到的金櫻子總有機酸最佳超聲提取工藝穩(wěn)定，可行。【關(guān)鍵詞】金櫻子；總有機酸；超聲提取法；正交試驗法；提取工藝

StudyonUltrasonicExtractionTechnologyofTotalOrganicAcidsfromRosaLaevigata[Abstract]Objective:TostudytheoptimalultrasonicextractiontechnologyoftotalorganicacidsfromRosalaevigata.Methods:Theextractionrateoftotalorganicacidswastakenastheindexbyultrasonicextractionmethod.Theultrasonicpower,ultrasonictimeandethanolvolumefractionwereinvestigated,andtheoptimalextractionprocesswasobtainedbyorthogonaltest.Results:Theaveragerecoveryoftotalorganicacidswas100.58%,RSDwere2.42%.Theoptimalextractionconditionswereultrasonicpowerof450W,ultrasonictimeof60minandethanolvolumefractionof50%.Undertheseconditions,theaverageextractionrateoftotalorganicacidswas0.76%.Conclusion:TheoptimalultrasonicextractiontechnologyoftotalorganicacidsfromRosalaevigataisstableandfeasible.[Keywords]RosalaevigataTotalorganicacidUltrasonicextractionOrthogonaltestmethodExtractiontechnology目錄TOC\o"1-3"\h\u1前言 前言金櫻子是薔薇科植物金櫻子的干燥成熟果實，《雷公炮炙論》對金櫻子的記載，是眾多文獻(xiàn)記載里面最早的一個。金櫻子在不同的文獻(xiàn)記載中有著許多不同的別稱，如在《蜀本草》中記載，五代后蜀時期人們稱為“\o"中藥：刺榆"刺榆子”；在宋代的《開寶本草》中稱為“刺\o"中藥匯集：梨子"梨子”；在極具嶺南特色的地方本草書籍《生草藥性備要》中稱為“糖鶯子”，等等。我國中部地區(qū)、華南地區(qū)、華東地區(qū)等都有藥用植物金櫻子的分布，其生長環(huán)境多為荒山多石的地方，正是金櫻子分布地域廣，而不同地區(qū)的叫法又各不相同，導(dǎo)致其別名很多，但細(xì)究會發(fā)現(xiàn)眾多古籍都有對這味藥的記載。金櫻子功效有固崩止帶，澀腸止瀉，固精縮尿等，主治崩漏帶下，遺尿尿頻，遺精滑精，久瀉久痢REF_Ref19329\r\h[1]。在現(xiàn)代的研究報告中發(fā)現(xiàn)，金櫻子主要化學(xué)成分包含黃酮類、苯丙素類、有機酸類以及多糖類、鞣質(zhì)類等化合物。它的藥理作用十分廣泛，不僅具有收斂止瀉的作用、而且能增強及調(diào)節(jié)免疫機能、還能抗氧化、降血脂、抗炎抗菌抗病毒，對神經(jīng)、肝臟、腎臟也有保護(hù)作用REF_Ref19485\r\h[2]。有機酸類化合物是中藥中的一類重要活性成分，但在過去的研究中，有機酸類物質(zhì)并不受科研人員的重視，有關(guān)于有機酸類的課題和文獻(xiàn)較少，專家和科學(xué)技術(shù)人員們更多偏向于研究黃酮類、萜類、生物堿類等活性成分，正是隨著天然藥物學(xué)和藥理學(xué)這些新興學(xué)科的設(shè)立和發(fā)展，較為小眾化的有機酸類化合物及其藥理活性才受到關(guān)注，并越發(fā)得到重視和研究，發(fā)掘它的作用功效和藥理作用機制以及研究其臨床綜合應(yīng)用等。報道中特別常見的包括沒食子酸、綠原酸、熊果酸、齊墩果酸、枸櫞酸等等REF_Ref19528\r\h[3]。隨著深入研究，有機酸諸多潛在的藥理作用被挖掘，例如，阿魏酸具有對抗血小板聚集的功效；琥珀酸、水楊酸、丁香酸等有助于冠心病的防治；三萜類有機酸則被發(fā)現(xiàn)具有拮抗皰疹病毒的活性REF_Ref19580\r\h[4]；有的熊果酸還是潛在的抗炎和抗關(guān)節(jié)炎成分REF_Ref19613\r\h[5]。所以，有機酸的研究是大勢所趨，而有機酸的提取是首要工作，鑒于薔薇科植物金櫻子的果實酸味較重，且目前對金櫻子總有機酸提取工藝的研究少之又少，因此可以對此展開深入的探究。隨著時代的發(fā)展，提取有機酸的方法技術(shù)愈發(fā)先進(jìn)。傳統(tǒng)的方法有煎煮、滲漉、回流提取、水蒸汽蒸餾法等等。雖然傳統(tǒng)溶劑萃取技術(shù)具有介質(zhì)成本低、設(shè)備簡單、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，但存在耗時長、藥材量消耗大、耗能多、勞動強度較大、收率不高、長時間高溫下會損壞熱敏元件和殘留有害物質(zhì)等諸多不足的地方?，F(xiàn)如今，高新提取技術(shù)也在不斷的發(fā)展和創(chuàng)新，超聲波提取技術(shù)、超臨界流體萃取技術(shù)、微波萃取技術(shù)、酶解技術(shù)、聯(lián)用技術(shù)、半仿生提取技術(shù)等各有優(yōu)勢REF_Ref19668\r\h[6]。例如，植物細(xì)胞存在細(xì)胞壁，細(xì)胞內(nèi)有效成分被包裹于植物細(xì)胞壁內(nèi)，乙醇很難滲透使之脫離溶解出來，而超聲提取法中，超聲波具有超強的穿透力，在超聲波高速和強烈振動的作用下，大量的金櫻子肉細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂，加快了提取溶劑滲入藥材細(xì)胞內(nèi)部的速率，有效成分充分溶解于提取溶劑中，極大地增強了中藥材的提取效果REF_Ref19724\r\h[7]，除此之外，超聲提取一般在常溫左右下進(jìn)行，避免了有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)被高溫破壞。但是在提取不同藥物的特定有效成分時，并不是說使用高新提取技術(shù)就一定比傳統(tǒng)的提取工藝要好，在實際生產(chǎn)中需要根據(jù)每種有機酸獨特的理化性質(zhì)來選擇合適的提取工藝。例如，超聲波提取技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)相比確實能加快提取效率，但超聲波會助推一些氧化還原反應(yīng)向正方向進(jìn)行，也能降解和解聚一些大分子化合物，或形成更復(fù)雜的化合物，影響我們特定成分的提取率。因此，在采用超聲提取技術(shù)時，應(yīng)探究超聲功率、提取溶劑、提取時間等因素相互影響后的最優(yōu)提取條件，致力于將所需有效成分提取率提升至最高。通過查閱文獻(xiàn)可知，測定中藥材中總有機酸的方法有很多，如直接電位法測定提取物的pH值、電位滴定法REF_Ref19825\r\h[8，REF_Ref19831\r\h9]、紫外光譜法REF_Ref19933\r\h[10，REF_Ref19939\r\h11]、近紅外光譜法REF_Ref20044\r\h[12]等。而電位滴定法準(zhǔn)確度較高、操作相對便捷，受到科研和技術(shù)人員的青睞，是應(yīng)用相對較多的一種。雖然酸堿滴定法也有被用來測定中藥材總有機酸的含量，但多數(shù)的中藥提取物溶液的顏色較深，難以通過觀察顏色的變化來確定滴定終點，這會對滴定終點的準(zhǔn)確性有所影響甚至無法得出實驗結(jié)果。相比之下，選擇利用電動勢的變化來判定滴定終點的電位滴定法測定中藥材總有機酸的含量，可以彌補酸堿滴定法的不足，用此方法來測定金櫻子總有機酸的含量更為可靠REF_Ref20089\r\h[13]。本實驗基于薔薇科植物的果實類藥材金櫻子含有多種有機酸成分，且藥用植物金櫻子分布廣泛，獲取中藥材原料的途徑便捷容易，以此為對象開展有機酸提取工作，具有應(yīng)用價值和可行意義。通過采用超聲提取法，以金櫻子總有機酸提取率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素分析，并利用正交試驗法優(yōu)化得到金櫻子總有機酸最佳超聲提取工藝。2材料與儀器2.1材料金櫻子藥材（批號：201101301、220700981，產(chǎn)地：廣東，生產(chǎn)廠家：康美藥業(yè)股份有限公司），枸櫞酸對照品（批號：200107-190301，純度：99%，生產(chǎn)廠家：江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司），其余試劑見表1。表SEQ表\*ARABIC1主要試劑名稱規(guī)格生產(chǎn)廠家氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1002mol/L廣州臻萃質(zhì)檢技術(shù)服務(wù)有限公司磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液PH=6.86廣檢（廣州）檢測科技有限公司鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液PH=4.00廣檢（廣州）檢測科技有限公司四硼酸鈉標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液PH=9.18廣檢（廣州）檢測科技有限公司95%乙醇分析純廣東廣式試劑科技有限公司2.2儀器表SEQ表\*ARABIC2主要實驗儀器設(shè)備儀器名稱型號生產(chǎn)廠家數(shù)控超聲波清洗器KH-500DE昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司酸度計PHS-3C上海佑科儀器儀表有限公司萬分之一電子天平BSA224S賽多利斯科學(xué)儀器公司六兩裝高速萬能粉碎機QE-300浙江屹立工貿(mào)有限公司超薄磁力攪拌器labdiscwhite德國IKA集團

3方法與結(jié)果3.1對照品溶液制備精密稱取枸櫞酸對照品25mg，放入50mL容量瓶，以70%乙醇定容，得到枸櫞酸對照品溶液（0.5mg/mL），并將其放在4℃的環(huán)境下冷藏備用。3.2供試品溶液制備精密稱取金櫻子粉末2.0g，放入100mL具塞錐形瓶，加入70%乙醇100mL，設(shè)置超聲功率為400W，溫度為40℃，提取時間為30min，過濾得到供試品溶液。3.3電位滴定法的測定精密稱取金櫻子粉末2.0g，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液30mL置于100mL燒杯中，加入10mL的蒸餾水，再加入攪拌子，用0.01002mol/L濃度的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線圖。圖中D2pH/D2V等于0的點所對應(yīng)的體積即為滴定終點所消耗NaOH的體積。3.4電位滴定的可行性研究3.4.1枸櫞酸對照品溶液突躍范圍試驗精密吸取10mL枸櫞酸對照品溶液，置于100mL燒杯，加入蒸餾水20mL，按“3.3”項下方法用0.01002mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線，見圖1。結(jié)果顯示，枸櫞酸對照品溶液二階導(dǎo)數(shù)曲線突躍明顯，D2pH/D2V等于0的點便是滴定終點，實際消耗7.75mLNaOH滴定液，與理論所需消耗NaOH體積（7.7969mL）的相對偏差為0.43%。圖SEQ圖\*ARABIC1枸櫞酸對照品溶液的D2pH/D2V滴定曲線3.4.2金櫻子供試品溶液突躍范圍試驗精密稱取金櫻子粉末2.0g，放入100mL具塞錐形瓶，加入70%乙醇100mL，按“3.2”項下方法制備金櫻子供試品溶液。精密吸取供試品溶液30mL放入100mL燒杯中，加入10mL蒸餾水，按“3.3”項下方法用0.01002mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線圖，見圖2。結(jié)果顯示，金櫻子供試品溶液二階導(dǎo)數(shù)曲線突躍明顯，D2pH/D2V等于0的點便是滴定終點，滴定終點對應(yīng)消耗NaOH滴定液5.25mL。圖SEQ圖\*ARABIC2金櫻子供試品溶液的D2pH/D2v滴定曲線3.5方法學(xué)考察3.5.1精密度試驗精密吸取6份枸櫞酸對照品溶液10mL，分別放入100mL燒杯中，各加入20mL蒸餾水，按“3.3”項下方法用0.01002mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線圖，測得消耗NaOH溶液體積，計算RSD為1.91%，見表3。結(jié)果表明該儀器精密度良好。表SEQ表\*ARABIC3精密度試驗結(jié)果序號消耗NaOH體積（mL）平均值（mL）RSD（%）17.507.731.9127.6037.7547.9057.8067.803.5.2穩(wěn)定性試驗精密稱取金櫻子粉末4.0g，放入250mL具塞錐形瓶，加入70%乙醇200mL，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取6份供試品溶液各30mL，分別放入100mL燒杯中，加入蒸餾水10mL，于0、2、4、6、8、10h按照“3.3”項下方法用0.01002mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線圖，測得消耗NaOH溶液體積，計算RSD為2.00%，見表4。結(jié)果表明該金櫻子供試品溶液在10h內(nèi)基本穩(wěn)定。表SEQ表\*ARABIC4穩(wěn)定性試驗結(jié)果序號放置時長（h）消耗NaOH體積（mL）平均值（mL）RSD（%）0225.20345.25465.25585.106105.003.5.3重復(fù)性試驗精密稱取金櫻子粉末（批號：201101301）2.0g，平行6份，置于100mL具塞錐形瓶，按“3.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液30mL，放入100mL燒杯中，加入蒸餾水10mL，按照“3.3”項下方法用0.01002mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線圖，測得消耗NaOH溶液體積，計算總有機酸平均提取率為0.55%，RSD為2.18%，見表5。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。表SEQ表\*ARABIC5重復(fù)性試驗結(jié)果序號消耗NaOH體積（mL）總有機酸提取率（%）平均提取率（%）RSD（%）15.250.560.552.1825.200.5535.100.5445.250.5655.300.5765.000.533.5.4加樣回收率試驗精密稱取6份已知總有機酸含量的金櫻子粉末（批號：201101301）1.0g，按1:1加入枸櫞酸對照品，置于100mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇50mL，按“3.2”項方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液50mL，放入100mL燒杯中，按“3.3”項下方法用0.01002mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線圖，測得消耗NaOH溶液體積，計算平均加樣回收率為100.58%，RSD為2.42%，見表6。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。表SEQ表\*ARABIC6加樣回收率試驗結(jié)果序號總有機酸含量（mg）對照品加入量（mg）實際測定值（mg）加樣回收率（%）平均加樣回收率（%）RSD（%）15.526.0011.59101.16100.582.4225.526.0011.68102.6635.526.0011.59101.1645.526.0011.5099.6655.526.0011.68102.6665.526.0011.2996.163.6單因素試驗3.6.1乙醇體積分?jǐn)?shù)精密稱取5份金櫻子粉末各2.0g，置于100mL具塞錐形瓶，分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇100mL（50%，60%，70%，80%，90%），搖勻，放入數(shù)控超聲波清洗器，調(diào)節(jié)超聲功率400W，初始溫度40℃，提取30min，過濾得到供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液30mL，置于100mL燒杯，加入10mL蒸餾水，按“3.3”項下方法用0.01002mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線圖，測得消耗NaOH溶液體積，計算總有機酸提取率，繪制乙醇體積分?jǐn)?shù)與金櫻子總有機酸提取率關(guān)系曲線圖。結(jié)果見圖3。圖SEQ圖\*ARABIC3乙醇體積分?jǐn)?shù)對金櫻子總有機酸提取率的影響由圖3可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%-70%范圍內(nèi)，金櫻子總有機酸提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高。乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，金櫻子總有機酸提取率達(dá)到最大值，隨后，金櫻子總有機酸得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而降低。究其原因，乙醇作為超聲提取的溶劑介質(zhì)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，有機酸更容易溶出擴散，體積分?jǐn)?shù)上升到一定程度后，用過高濃度的乙醇對有機酸進(jìn)行提取，會導(dǎo)致部分有機酸提取不完全，如酒石酸、蘋果酸、檸檬酸在高濃度乙醇中的溶解度都比在低濃度乙醇中的溶解度低REF_Ref20220\r\h[14]，又或者微量元素在不同濃度的溶劑中的溶解度不同，影響著有機組分的溶解。因此，作為提取溶劑介質(zhì)的乙醇溶液濃度過高是不可行的。3.6.2超聲功率精密稱取6份金櫻子粉末各2.0g，置于100mL具塞錐形瓶，加入70%乙醇100mL，放入數(shù)控超聲波清洗器，設(shè)置初始溫度40℃，分別調(diào)節(jié)超聲功率250、300、350、400、450、500W，超聲提取30min，過濾得到供試品溶液，分別精密吸取30mL供試品溶液，置于100mL燒杯中，加入10mL蒸餾水，按“3.3”項下方法用0.01002mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線圖，測得消耗NaOH溶液體積，計算總有機酸提取率，繪制超聲功率與金櫻子總有機酸提取率關(guān)系曲線圖。結(jié)果見圖4。圖SEQ圖\*ARABIC4超聲功率對金櫻子總有機酸提取率的影響由圖4可見，超聲功率在250W-450W的范圍內(nèi)，金櫻子總有機酸提取率隨超聲功率的增大而升高。超聲功率在450W時，金櫻子總有機酸提取率達(dá)到最大值，隨后，總有機酸提取率隨超聲功率的增大而降低。一般來說，超聲儀的功率越大，提取得越完全；增大超聲功率，提取率上升到一定程度后反而開始降低，可能因為功率過大使空化作用過強，空化作用過大破壞了有機酸的分子結(jié)構(gòu)，使溶液中的總有機酸含量降低。3.6.3超聲時間精密稱取5份金櫻子肉粉末2.0g，置于100mL具塞錐形瓶，加入70%乙醇100mL，置于數(shù)控超聲波清洗器中，設(shè)置超聲功率400W，初始溫度40℃，分別超聲提取20、40、60、80、100min，過濾得到供試品溶液，分別精密吸取30mL供試品溶液，置于100mL燒杯，加入10mL的蒸餾水，搖勻，按照“3.3”項下的方法用0.01002mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線圖，測得消耗NaOH溶液體積，計算總有機酸提取率，繪制超聲時間與金櫻子總有機酸得率關(guān)系曲線圖。結(jié)果見圖5。圖SEQ圖\*ARABIC5超聲時間對金櫻子總有機酸提取率的影響由圖5可知，超聲時間在20-40min時，金櫻子總有機酸提取率隨超聲時間的增加而升高。超聲時間在40min時，金櫻子總有機酸提取率達(dá)到最大值，隨后，總有機酸提取率隨超聲時間的增加而降低。分析其原因可能為超聲作用時間過長，使其他雜質(zhì)的提取率加大，如一些脂溶性物質(zhì)成分的析出，使有機酸在溶液中的溶解度降低，從而影響了有機酸的提取工作。超聲時間的延長，還會使溫度升高，溫度的變化可能會導(dǎo)致其他成分的溶解度加大而影響有機酸的提取。3.7正交試驗優(yōu)化在單因素試驗的結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)計3因素3水平的正交試驗（見表7），按照L9(3表SEQ表\*ARABIC7三因素三水平水平因素超聲時間A（min）超聲功率B（W）乙醇體積分?jǐn)?shù)C（%）120400502404507036050090表SEQ表\*ARABIC8正交試驗優(yōu)化結(jié)果試驗號超聲時間A超聲功率B乙醇體積分?jǐn)?shù)C總有機酸提取率（%）11110.6621220.6031330.4842120.4952230.5662310.6173130.5483210.7393320.52K11.741.692.00—K21.661.891.61—K31.791.611.58—k10.580.560.67—k20.550.630.54—k30.600.540.53—R0.050.090.14—優(yōu)化水平A3B2C1—表SEQ表\*ARABIC9三因素方差分析結(jié)果方差來源自由度平方和S均方VFP超聲時間20.0030.0014.9370.168超聲功率20.0120.00619.7280.048*乙醇體積分?jǐn)?shù)20.0360.01860.3100.016*根據(jù)正交試驗優(yōu)化的結(jié)果（見表8）可得，因素A（超聲時間）的k3為最大值，k3=0.60；因素B（超聲功率）的k2為最大值，k2=0.63；因素C（乙醇體積分?jǐn)?shù)）的k1為最大值，k1=0.67。因此，可以得到金櫻子總有機酸的超聲提取最佳工藝為A3B2C1，即采用50%乙醇、超聲功率為450W、超聲提取金櫻子藥材粉末60min。根據(jù)方差分析的結(jié)果（見表9）可得，因素A（p=0.168）>因素B（p=0.048）>因素C（p=0.016），可以認(rèn)為影響金櫻子總有機酸提取率的程度由小到大依次為超聲時間、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)。由于因素A的P值>0.5，認(rèn)為對提取效果無顯著性影響，而因素B和因素C的P值<0.5，可以認(rèn)為該因素對提取效果有顯著性影響，即超聲功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)對金櫻子總有機酸超聲提取效果有著顯著性影響。3.8最佳工藝驗證精密稱取3份金櫻子粉末（批號：220700981）各1.0g，置于100mL具塞錐形瓶，加入50%乙醇50mL，放入數(shù)控超聲波清洗器，調(diào)節(jié)超聲功率450W，初始溫度40℃，提取60min，過濾得到供試品溶液，分別精密吸取30mL供試品溶液，置于100mL燒杯，加入10mL蒸餾水，按照“3.3”項下方法用0.01002mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定，繪制D2pH/D2V對V的二階導(dǎo)數(shù)曲線圖，測得消耗NaOH溶液體積，計算總有機酸平均提取率為0.76%，RSD為1.89%。結(jié)果見表10。表SEQ表\*ARABIC10最佳工藝試驗結(jié)果序號稱樣量（g）消耗NaOH體積（mL）總有機酸提取率（%）平均提取率（%）RSD（%）11.00016.950.740.761.8921.00037.200.7731.00027.150.76

4討論4.1提取溶劑的選擇提取工藝研究中，提取溶劑的選擇十分重要。大部分低分子質(zhì)量的天然有機酸，易溶于水，而難溶或不溶于石油醚。而提取植物中的有機酸通常采用水、甲醇、乙醇等溶劑或混合溶劑作為提取溶劑。經(jīng)過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，采用水做提取溶劑不合適，陸敏REF_Ref20409\r\h[15]等利用高效液相色譜法測定常見水果中的有機酸，發(fā)現(xiàn)只用水作為提取溶劑時，制備好的提取液中蘋果酸和檸檬酸的含量下降速度很快，在提取后2h、4h和24h上機測得檸檬酸的含量分別降低了19.3%、22.7%和96.3%，在2h、4h的蘋果酸含量分別降低27.4%、31.1%甚至在提取后24h，蘋果酸已基本檢測不出。有鑒于此，只用水作為提取溶劑時，有機酸極其不穩(wěn)定，所以選用醇溶液做提取溶劑，但基于甲醇溶液存在毒性，因此優(yōu)先選擇了乙醇溶液進(jìn)行金櫻子總有機酸的提取。4.2NaOH溶液濃度的選擇預(yù)實驗中，在摸索枸櫞酸對照品溶液的突躍范圍時，首先使用了濃度為0.01002mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行電位滴定，為了使枸櫞酸對照品溶液所消耗的NaOH溶液體積盡量在6-8mL，通過計算枸櫞酸對照品質(zhì)量的范圍應(yīng)需在3.84-5.12mg，因此精密吸取制備好的0.5mg/mL的枸櫞酸對照品溶液10mL進(jìn)行電位滴定，測得所消耗的NaOH體積在7-8mL，符合要求，因此確定用濃度為0.01002mol/L的氫氧化鈉溶液作為枸櫞酸對照品溶液的滴定液。在金櫻子供試品溶液的突躍范圍試驗時，對金櫻子總有機酸的含量是未知的，所以第一次吸取制備好的金櫻子供試品溶液10mL，使用了濃度為0.1002mol/L的NaOH溶液對供試品溶液進(jìn)行滴定，突躍點不明顯；此后嘗試把NaOH溶液的濃度降低，通過使用0.05mol/L、0.025mol/L和0.01mol/L的NaOH溶液對金櫻子供試品溶液進(jìn)行滴定，發(fā)現(xiàn)使用0.05mol/L的NaOH溶液作為滴定液，突躍點依舊不明顯，而0.025mol/L的氫氧化鈉溶液滴定時突躍點靠前，不利于滴定曲線的繪制，最后決定使用0.01mol/L的氫氧化鈉溶液作為金櫻子供試品溶液的滴定液，除此之外為了使消耗的NaOH體積增大、繪制的滴定曲線美觀，把金櫻子供試品溶液取樣量由10mL變?yōu)?0mL。4.3超聲溫度的控制在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)即便設(shè)定超聲儀溫度為40℃，但溫度會在43-45℃范圍內(nèi)浮動，可能是由于提取過程中會放熱，以及超聲功率過高或者超聲時間過長的影響，溫度隨之有所變化。雖然變化程度不大，但也是難以控制在一個穩(wěn)定值，因此沒有選擇溫度作為單因素分析試驗的考察對象，對于溫度不穩(wěn)定現(xiàn)象采取設(shè)定相同水位線的辦法，盡量控制每次的初始水位線相等，使得提取過程中溫度即便變化也是在一定范圍內(nèi)升高。而最終選擇設(shè)置超聲儀初始溫度統(tǒng)一為40℃，因為超聲儀的溫度必須超過室溫才會開始運作，而且溫度的選擇盡可能低，需要給予提取過程中溫度升高的空間，過高的溫度會破壞某些有機酸結(jié)構(gòu)，降低有機酸提取效果，所以溫度選擇設(shè)置為僅比室溫高一點。4.4實驗操作的注意事項過濾的效果直接影響著滴定曲線結(jié)果的觀察。而以下因素均有可能影響著過濾操作，一是中藥材金櫻子在預(yù)處理時，金櫻子粉碎成粉末這一步驟中，要注意粉末的粗細(xì)程度，使用粉碎機時要留意操作時間不宜過長，次數(shù)不宜過多；而且金櫻子粉末需要進(jìn)行過篩，使用40目和80目的篩網(wǎng)除去過粗和過細(xì)的藥材粉末，防止過細(xì)的粉末透過濾紙流進(jìn)濾液以及過粗的粉末影響總有機酸提取不完全；二是超聲時間過長或者超聲功率過大，會使藥材細(xì)胞破裂程度過大，造成溶液中殘渣多而不易過濾，濾液中所含雜質(zhì)成分多，會影響滴定結(jié)果的觀察；三是選用定量分析濾紙，定量分析濾紙在制造過程中經(jīng)過特殊處理，除去了纖維中的大部分雜質(zhì)，從而減少了濾紙在過濾時給待測液帶來的雜質(zhì)影響。在預(yù)實驗中，第一天制備的對照品溶液有剩余，未存放至低溫環(huán)境冷藏，第二天繼續(xù)用此對照品溶液再一次進(jìn)行枸櫞酸對照品溶液突躍范圍試驗，兩次小試驗之間的時間間隔相差超過了12小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精密吸取相同體積的枸櫞酸對照品溶液所測得的含量與前一天相比，第二天的含量降低了，且與理論值偏差較大。所以枸櫞酸對照品溶液需放置較長時間時，均應(yīng)低溫環(huán)境冷藏。電位滴定法解決了酸堿滴定法中藥材提取液的滴定終點顏色變化不明顯或者溶液渾濁不易觀察的問題，但本次實驗使用的是非全自動電位滴定儀，過程中仍發(fā)現(xiàn)存在一些不足的地方，滴加氫氧化鈉滴定液的操作較為不方便，需要一邊操作滴定管，一邊觀察記錄數(shù)據(jù)，且手動滴定在體積讀數(shù)方面存在一定的誤差，實驗結(jié)果準(zhǔn)確度取決于操作者的水平。有文獻(xiàn)記載，電位滴定法選用自動電位滴定儀，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的量可準(zhǔn)確到0.0001毫升,而人工滴定只能準(zhǔn)確到0.01毫升REF_Ref20553\r\h[16]，且自動電位滴定儀可自動輸出數(shù)據(jù)，能確定滴定終點，顯示滴定終點時標(biāo)準(zhǔn)液所消耗的體積并記錄保存。我認(rèn)為，與自動滴定相比，手動滴定確實存在一些不足。除此之外，滴定過程中，除了正確的突躍點，有時會另外存在一兩個小突躍，可能導(dǎo)致此現(xiàn)象的原因一是過濾不完全，金櫻子肉粉末太細(xì)以至于沒有被濾紙完全阻擋而流至濾液中，因此濾液中存在其他成分雜質(zhì)，使滴定曲線出現(xiàn)本不該有的小突躍，因為枸櫞酸對照品溶液的滴定曲線并不會出現(xiàn)此現(xiàn)象；二是金櫻子總有機酸中可能存在個別二元弱酸，如果二元弱酸的兩級解離常數(shù)相差較大，會分級被中和而出現(xiàn)兩個滴定突躍；三是有機酸的成分強弱不一REF_Ref20592\r\h[17]，與NaOH滴定液中和的速率不同，導(dǎo)致滴定曲線有瑕疵。實驗期間，正處冬季，11月和12月的溫差較大，12月突然降溫的幾天時間里，浸泡pH計電極的氯化鉀浸泡液有結(jié)晶現(xiàn)象，為避免對滴定結(jié)果有影響，每天對pH計進(jìn)行校正。由于室溫的影響，早晚的pH讀數(shù)有所差別，同體積同濃度的金櫻子供試品溶液滴定突躍點的pH數(shù)值相差較大，但所對應(yīng)的消耗NaOH體積基本相同，偏差不大；因此可以認(rèn)為突躍點的pH讀數(shù)即便有所不同，但最終對應(yīng)的消耗NaOH溶液體積是正確的。4.5展望隨著天然藥物學(xué)和藥理學(xué)的發(fā)展，有機酸類物質(zhì)的藥理活性逐漸受到廣泛關(guān)注，有機酸的藥用價值不斷得到發(fā)掘，因此中藥中有機酸提取、分離純化的方法在不斷發(fā)展與創(chuàng)新，對其工藝的要求和技巧也越來越高。簡單、快速和綠色環(huán)保的提取技術(shù)是發(fā)展趨向所需求的。在最新的2020版《中國藥典》中記載，對金櫻子的質(zhì)量控制，是檢查水分和總灰分；對金櫻子成分的含量測定只制定了多糖類成分的標(biāo)準(zhǔn)，對其他的主要成分尚未制定相應(yīng)含量標(biāo)準(zhǔn)，因此對金櫻子總有機酸超聲提取工藝的優(yōu)化工作，能為金櫻子總有機酸的含量測定工作提供參考意義。

5結(jié)論金櫻子藥用價值廣，市場發(fā)展前景極具優(yōu)勢，備受科研和生產(chǎn)技術(shù)人員們的關(guān)注，成為人們研究的重要課題，本實驗對金櫻子總有機酸的超聲提取工藝進(jìn)行研究，選出最佳提取方案，致力于將金櫻子總有機酸提取工作效率提升至更高，便于其他后續(xù)研究工作的進(jìn)行。本實驗一開始對枸櫞酸對照品溶液和金櫻子供試品溶液進(jìn)行電位滴定突躍范圍試驗，并對該方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，金櫻子總有機酸的平均加樣回收率為100.58%，RSD為2.42%，由此可見此實驗方法的可行性；通過單因素分析，金櫻子總有機酸提取率最高對應(yīng)的條件分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲功率450W、超聲時間40min，根據(jù)此結(jié)果設(shè)計正交試驗開展優(yōu)化工作，從而得到的最佳提取工藝方案為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲功率為450W、超聲時間60min，金櫻子總有機酸