硅膠柱層析技術

硅膠柱層析技術1精品PPT|借鑒參考第一頁，共三十三頁。常說的過柱子應該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。其實硅膠柱層析技術也可以稱作硅膠吸附柱色譜技術2精品PPT|借鑒參考第二頁，共三十三頁。色譜法，又稱層析法。是一種以分配平衡為機理的分配方法。色譜體系包含兩個相，一個是固定相，一個是流動相。當兩相相對運動時，反復多次的利用混合物中所含各組分分配平衡性質的差異，最后達到彼此分離的目的。色譜法按固定相的狀態(tài)可分為柱色譜、平板色譜和棒色譜三種，而實驗室中最常用的是柱層析和薄層層析，以及它們之間的配合應用。3精品PPT|借鑒參考第三頁，共三十三頁。柱層析1、吸附色譜的原理在一定條件下，硅膠與被分離物質之間產生作用，這種作用主要是物理和化學作用兩種。物理作用來自于硅膠表表面與溶質分子之間的范德華力；化學作用主要是硅膠表面的硅羥基與待分離物質之間的氫鍵作用。2、操作步驟2.1硅膠準備硅膠一般選用250-400目(即40-63μm直徑的硅膠顆粒)，根據ΔRf選用硅膠的用量。2.2實驗儀器準備一支玻璃色譜柱,一個鐵架臺,燒杯,錐形瓶,徑口直徑較大的玻璃漏斗,一支玻璃棒,等。4精品PPT|借鑒參考第四頁，共三十三頁。2.3裝柱2.3.1吸附劑的加入①干法：將吸附劑一次加入色譜管，振動管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入開始層析時使用的流動相，或將色譜管下端出口加活塞，加入適量的流動相，旋開活塞使流動相緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤濕下沉，在管內形成松緊適度的吸附層。操作過程中應保持有充分的流動相留在吸附層的上面。②濕法：將吸附劑與流動相混合，攪拌以除去空氣泡，徐徐傾入色譜管中，然后再加入流動相，將附著于管壁的吸附劑洗下，使色譜柱表面平整。俟填裝吸附劑所用流動相從色譜柱自然流下，液面將與柱表面相平時，即加試樣溶液。5精品PPT|借鑒參考第五頁，共三十三頁。2.3.2試樣的加入①將試樣溶于層析時使用的流動相中，再沿色譜管壁緩緩加入。注意勿使吸附劑翻起。②或將試樣溶于適當?shù)娜軇┲?，與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發(fā)去盡后使呈松散狀；將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。6精品PPT|借鑒參考第六頁，共三十三頁。2.4洗脫除另有規(guī)定外，通常按流動相洗脫能力大小，遞增變換流動相的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時，再改變流動相的品種和比例。操作過程中應保持有充分的流動相留在吸附層的上面。2.5檢測2.5.1初步檢測當沖洗溶劑流出一定量后，可對流出液進行初步檢測，并且將錐形瓶更換成小試管進行收集。一般只進行初步的快捷檢測，因此通常是取一小薄層板，用鉛筆和直尺將硅膠板分劃成多個小方塊，并按一定的次序編號。取一根內徑為0.3mm左右的玻璃毛細管蘸取少量流出液，點于薄層板的一個小格內，待半點干后，然后用物理的或化學的方法檢測。7精品PPT|借鑒參考第七頁，共三十三頁。2.5.2正式檢測①點樣:取分部收集的沖洗溶液進行分別直接點樣,如果沖洗溶液太稀,濃度太小,可先濃縮.點樣的容器一般用玻璃毛細管,點樣斑點的直徑一般為3-5mm.②展開:在普通的展開槽中進行,展開方式常選用上行展開.③展開劑:使用沖洗溶液.④顯色:一般常用物理檢測法和化學檢測法.物理檢測法中首先有紫外光法,紫外光常用兩種波長(254nm與365nm).其次是碘蒸氣顯色法.化學檢出法通常驚醒顯色劑直接噴霧.顯色劑有通用顯色劑和專用顯色劑.通用顯色劑最常見的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液,噴霧后,有的化合物立即反應,但多數(shù)化合物需加熱后經歷數(shù)分鐘才顯色,不同化合物的反應不同,所以顏色也往往不同.專用顯色劑是指對某個或某一類化合物顯色的試劑,利用化合物本身的特有性質,或利用其所含的某些官能團的特殊反應.展開后根據斑點的,可以粗略的估計待分離物的含量的大小.8精品PPT|借鑒參考第八頁，共三十三頁。2.6合并根據上面薄層檢測的結果,我們可以將具有相同Rf值的部分進行合并,然后利用旋轉蒸發(fā)器對合并部分進行旋轉蒸發(fā),最后得到我們需要的目標產物.2.7色譜柱的洗滌在絕大多數(shù)情況下,硅膠分離柱中的硅膠是一次性使用,但在使用后的色譜柱中由于還含有沖洗溶劑,所以要將里面的硅膠到出是比較困難的.取出硅膠的一種方法是將該柱放置一段時間,讓溶劑自然揮發(fā)完后,倒出硅膠.但這種方法既費時又污染環(huán)境.第二種方法可以用一根比色譜柱稍長的木桿或塑料桿將含有溶劑的硅膠一段一段地掏出,但這種辦法也比較麻煩.第三種方法時利用一個一般地真空泵,將柱中剩余的溶劑進行減壓抽出,在色譜柱和真空泵之間加一個冷阱,這樣抽出地溶劑既進行了有效地收集而不污染環(huán)境,而色譜柱中地硅膠又能較快得到干燥,使硅膠能夠方便地倒出.9精品PPT|借鑒參考第九頁，共三十三頁。3、色譜柱的選擇柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。①減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。②加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。③常壓柱色譜，又稱柱層析，是色譜法中最常見的一種。它的突出優(yōu)點是，分離效率比經典的化學分離方法高的多，與其他色譜法相比，不需要昂貴的儀器設備，更換流動相和吸附劑方便，消耗材料少，成本低，適合分離取樣量從克到微克級范圍很寬的各種樣品，因此在化學實驗室中至今仍被廣泛應用。10精品PPT|借鑒參考第十頁，共三十三頁。4溶劑的選擇溶劑的選擇也許是整個柱色譜分離操作中最困難之處,也是實驗成功的最關鍵之處.溶劑通常先利用簡便的硅膠薄層色譜進行篩選.4.1薄層色譜點樣把樣品溶解在一種低沸點的有機溶劑中(如氯仿,丙酮.甲醇.乙醇等)然后用毛細管或微量點樣管將試液點到薄層板上.點樣量要適當,一般點樣量少些,則分離叫清晰.但要注意到檢測靈敏度.4.2展開4.2.1展開劑選擇選擇展開劑時,可采用微量圓環(huán)法和小型色譜法進行選擇.11精品PPT|借鑒參考第十一頁，共三十三頁。①微量圓環(huán)法:將欲分離的物質,按常規(guī)方法點在薄板,兩點相距2-3cm,再用毛細管吸取所實驗的溶劑系統(tǒng),垂直放于樣點中心,讓溶劑自毛細管中依中立流出進行展開,干燥后顯色.觀察斑點的分離情況.背試物質為未知化和物時,常先用低極性溶劑展開,如式樣留在圓點不動,則需增加溶劑的極性或增大洗脫液的量,如移動過快,則必須用較低極性的溶劑來調整.②小型色譜法.用普通的載薄片制成薄板,把欲分離的物質點載薄板上,放于小型玻璃缸或廣口瓶中展開,干燥后顯色,觀察斑點分離情況.12精品PPT|借鑒參考第十二頁，共三十三頁。4.2.2展開薄層色譜的展開方法有上行法,下行法,雙向展開法,徑向展開法等。①上行法:使展開劑由下向上爬.②下行法:使展開劑由上向下.該法可使用極性較弱的展開劑.③雙向展開法:取方形薄板像紙色譜一樣進行雙向展開.④徑向展開法:可將吸附劑涂成圓形或扇形,在圓心部分加如展開劑,使薄層徑向展開.⑤多次展開:用展開劑對薄層展開一次.稱為單次展開.一次展開后,取出薄板,揮發(fā)出去展開劑后再行展開.⑥梯度展開:該法所用的展開劑在連續(xù)不斷的改變組成.一般可把一個裝有強極性展開劑的滴定管深入密閉的含弱極性的展開劑的層析槽中,槽中用電磁攪拌器把滴下的強極性展開劑混勻,此時,展開劑的極性逐漸由弱變強,使極性差別較大的多種組分混合物得以很好的分離.13精品PPT|借鑒參考第十三頁，共三十三頁。4.3顯色展開后,如物質有色,可明顯的在薄層上觀察到它們的位置.如無色,則要通過一定的方法顯色,定位,一邊確定斑點的位置及大小.4.4常用溶劑的極性常用溶劑的極性順序：石油醚〈環(huán)己烷/己烷〈苯〈乙醚〈氯仿〈乙酸乙酯〈正丁醇〈丙酮〈乙醇〈甲醇〈水。在薄層色譜中,當溶劑的極性太大時.會使待分離物全部接近溶劑前沿,當溶劑的極性太小時,又會使待分離物幾乎全部保留在圓點,這兩種情況都是待分離物得不到分離.使用單一溶劑，往往不能達到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低極性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區(qū)分度的作用，常用的溶劑組合有：Petroleumether/Ethylacetate,Petroleumether/Acetone,Petroleumether/Ether,Petroleumether/CH2Cl2,CH2Cl2/ethylacetate,ethylacetate/MeOH,CHCl3/ethylacetate14精品PPT|借鑒參考第十四頁，共三十三頁。柱層析

極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸15精品PPT|借鑒參考第十五頁，共三十三頁。1、稱量

200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。2、攪成勻漿加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分攪拌。如果洗脫劑是石油醚/乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感，不能用氯仿體系過柱。勻漿法16精品PPT|借鑒參考第十六頁，共三十三頁。3、裝柱將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內。隨著沉降，會有一些硅膠沾在蓄液球內，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。4、壓實沉降完成后，加入更多的石油醚（氯仿），用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱，都應進行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過柱時由于柱床萎縮產生開裂。17精品PPT|借鑒參考第十七頁，共三十三頁。5、上樣干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會沖壞硅膠表面。6、過柱和收集柱層析實際上是在擴散和分離之間的權衡。太低的洗脫強度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H，0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml收一餾分。18精品PPT|借鑒參考第十八頁，共三十三頁。7、檢測要更多地使用專用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會損失較多產品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個數(shù)量級。8、送譜收集的產品旋干，在送譜前通常需要重結晶。如果樣品太少或為液體，可過一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段?？沙渥V1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。19精品PPT|借鑒參考第十九頁，共三十三頁。PPT內容概述硅膠柱層析技術。常說的過柱子應該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。是一種以分配平衡為機理的分配方法?；瘜W作用主要是硅膠表面的硅羥基與待分離物質之間的氫鍵作用。操作過程中應保持有充分的流動相留在吸附層的上面。將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。選擇展開劑時,可采用微量圓環(huán)法和小型色譜法進行選擇.。如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。32第二十頁，共三十三頁。TIPS:1.先根據TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質Rf值之差最大化2.將柱子必須裝平整、均勻3.考慮有限柱填料的吸附量4.可考慮用梯度法分開并洗脫21精品PPT|借鑒參考第二十一頁，共三十三頁。柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。關于無水無氧柱，適用于對氧，水敏感，易分解的產品。22精品PPT|借鑒參考第二十二頁，共三十三頁。關于柱子的尺寸柱子長了，相應的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點就?。ǚ从吃谥由暇褪菢悠穼颖容^?。?，這樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，不過這些成本相對于產品來說也許就不算什么了（有些不環(huán)保的說，不過溶劑回收重蒸后也就減小了部分浪費）。23精品PPT|借鑒參考第二十三頁，共三十三頁?，F(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在1：5～10，書中寫硅膠量是樣品量的30～40倍，具體的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質分的比較開（是指在所需組分rf在0.2～0.4，雜質相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的直徑，比如用3cm的，也可以減小淋洗劑的極性等等。24精品PPT|借鑒參考第二十四頁，共三十三頁。關于濕法、干法上樣濕法上樣，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒關系?？墒怯械纳蠘雍笤诠枘z上又會析出，這一般都是比較大量的樣品才會出現(xiàn)，是因為硅膠對樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較好的固體才會發(fā)生，這就應該先重結晶，得到大部分的產品后再柱分，如果不能重結晶那就不管它了，直接過就是了，樣品隨著淋洗劑流動會溶解的。干法上樣，一般用于固體或粘度大的液體樣品。樣品用低沸點易溶溶劑溶解，加入1-3倍的粗硅膠，晾干或旋干，干燥的標準是硅膠成細粉而不粘在瓶壁上。裝好的柱子上留一段溶劑，把吸附了樣品的硅膠慢慢到進去，震動柱子或再加一些溶劑，把粘在柱壁上的硅膠洗下。25精品PPT|借鑒參考第二十五頁，共三十三頁。溶劑的選擇當然是最便宜，最安全，最環(huán)保的了。所以大多選用石油醚，乙酸乙酯。文獻中有寫用正己烷的，太貴了，除非特別需要不要用不然銀子嘩嘩的，流的比淋洗劑還快，不過因為極性很小，有時還是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡覺，注意保持清醒別讓溶劑流干了，那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅膠的吸附是一個放熱過程，所以夏天的時候經常會在柱子里產生氣泡，天氣冷的時候會好一些。甲醇，據說能溶解部分的硅膠，所以產品如果想過元素分析的話要留神，應該經過后繼處理，比如說重結晶等。其他的溶劑用的相對較少，要依個人的不同需要選擇了。26精品PPT|借鑒參考第二十六頁，共三十三頁。由于某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜嘛），我們這里是用10升或25升的塑料桶裝的，就要注意這些工業(yè)品的純度是較低的。經常能夠從送來的大桶底部看見有色的雜質，其他的雜質就可想而知了，所以在比較嚴格的柱分時就要對溶劑重蒸。當然過原料時就可以免去這一步了，反正下面還有提純的方法。另外溶劑在過柱子后最好也回收使用，一方面環(huán)保，另一方面也能節(jié)省部分經費，缺點是要消耗一定的人工。這里要注意的是，一般在過柱同時進行的是減壓旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于揮發(fā)度的不同會導致極性的變化，一般會使得極性變大，在梯度淋洗時比較合適，正好極性越來越大了。在過完柱子后，溶劑最后回收要采用常壓，因為在減壓旋蒸時會有部分低沸點的雜質一起出來，常壓時就會減少這種現(xiàn)象，如果雜質和你下面要過的樣品有反應那就慘了。27精品PPT|借鑒參考第二十七頁，共三十三頁。關于操作問題1裝柱柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑，會被淋洗劑帶到產品中的，可以采用四氟節(jié)門（T型四氟節(jié)門三通接頭）的。干法和濕法裝柱覺得沒什么區(qū)別，只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應該要適度的緊密（太密了淋洗劑走的太慢），一定要均勻（不然樣品就會從一側