酶的改造方法進(jìn)展

關(guān)于酶的改造方法進(jìn)展為什么要進(jìn)行酶改造？溫和的自然體系：常溫、常壓、中性pH、水環(huán)境極端的工業(yè)體系：高溫、高壓、酸、堿、有機(jī)溶劑酶不適應(yīng)第2頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶的改造方法

酶的化學(xué)修飾-分子修飾酶的物理修飾-固定化酶的生物改造-定向進(jìn)化

酶的人工模擬-抗體酶第3頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、酶的化學(xué)修飾B通過(guò)制備酶單分子納米凝膠，大大提高了酶的穩(wěn)定性第4頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶分子修飾主要方法

金屬離子置換修飾大分子結(jié)合修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾

第5頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天1）金屬離子置換修飾實(shí)例

SOD的金屬離子置換：

天然SOD中的鐵原子被錳原子取代后，重組酶對(duì)H2O2的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，對(duì)NaH3的抑制作用的敏感型顯著降低。

氨基酸?；傅慕饘匐x子置換：氨基?；傅匿\被鈷取代后，底物專一性和最適pH都有改變，鋅酶對(duì)N-乙酰丙氨酸的最適pH是8.5,而鈷酶是7.0.第6頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天2）酶大分子修飾的實(shí)例每分子核糖核酸酶和6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，酶的催化效率提高2.25倍；用琥珀酸酐法活化的聚乙二醇對(duì)菠蘿蛋白酶進(jìn)行修飾，在55℃的穩(wěn)定性比未修飾的提高38%；尿激酶采用聚乙二醇5000修飾，在兔體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)9~13倍；超氧化歧化酶采用聚乙二醇修飾后半衰期延長(zhǎng)70~350倍；L-天冬酰胺酶經(jīng)聚乙二醇修飾后，抗原性顯著降低，1994年經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)成為治療急性白血病的藥物使用第7頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天3）側(cè)鏈基團(tuán)修飾的實(shí)例用亞硝酸修飾天冬酰胺酶，使氨基末端的Leu和肽鏈中的Lys殘基上的-NH2脫氨變成-OH，酶的半衰期延長(zhǎng)2倍；葡萄糖異構(gòu)酶經(jīng)琥珀?；揎椃踊?，最適pH下降0.5，穩(wěn)定性增加，更有利于果葡糖漿生產(chǎn)；用O-甲基異脲修飾溶菌酶，使酶分子中的Lys殘基上的

-氨基結(jié)合屏蔽，穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)；枯草桿菌蛋白酶的第104位Tyr上的酚羥基經(jīng)四硝基甲烷修飾后，生成3-硝基酪氨酸殘基，使酶對(duì)帶正電荷的底物結(jié)合能力顯著增強(qiáng)；第8頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天

胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

4）肽鏈有限水解修飾實(shí)例第9頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天5）氨基酸置換修飾實(shí)例Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。評(píng)價(jià)：化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)；發(fā)展趨勢(shì)：定點(diǎn)突變通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)把農(nóng)桿菌

-葡萄糖苷酶催化中心的第358位L-GluL-Ala，使親核的羧基

甲基，結(jié)果使該酶失去了水解活性，而可以催化糖苷合成第10頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶分子修飾的發(fā)展趨勢(shì)大分子修飾研究最為成功，尤其是聚乙二醇修飾；酶的側(cè)鏈基團(tuán)修飾已經(jīng)成為酶結(jié)構(gòu)研究的重要手段；更為精細(xì)的酶?jìng)?cè)鏈修飾往往和結(jié)構(gòu)生物學(xué)緊密相關(guān)；第11頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、酶的物理改造-固定化

載體固定化：納米材料、樹脂、水凝膠、殼聚糖等無(wú)載體固定化：細(xì)胞表面自固定化、酶聚集體等第12頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天10mL淀粉葡萄糖苷酶(350μg/mL)與30mg殼聚糖混合，在室溫放置1h，不時(shí)攪拌，在4℃過(guò)夜，過(guò)濾，用600mL蒸餾水洗滌,過(guò)濾即得殼聚糖固定化淀粉葡萄糖苷酶；第13頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天海藻酸鈉先加熱配成溶液，取一定量堿性蛋白酶溶液和海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻后用蠕動(dòng)泵將混合液滴入2%的CaCl2

中形成凝膠珠，放入4℃冰箱硬化4h，得到海藻酸鈉微球?？ɡz加熱配成一定的濃度,50℃水浴保溫,加入乳糖酶溶液，均勻攪拌后冷卻，4℃冰箱中硬化，得到塊狀固定化酶；第14頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶與1.5%的海藻酸鈉溶液充分混和，通過(guò)針頭滴入1.1%氯化鈣溶液中，形成珠狀的海藻酸膠顆粒。凝膠珠用0.5%的聚賴氨酸處理，再經(jīng)0.1%的2-N-環(huán)已胺乙基磺酸處理，用生理鹽水洗滌，再以0.05mol/L的檸檬酸鈉水溶液液化微囊內(nèi)海藻酸鈣，得到近乎透明的微囊化的固定化酶。第15頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天DEAE-纖維素固定蟲漆酶

CM-纖維素酶固定蟲漆酶

第16頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天吸附交聯(lián)法：先將酶吸附在硅膠或樹脂等載體上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。交聯(lián)包埋法：把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細(xì)的集合體，然后用高分子或多糖一類物質(zhì)進(jìn)行包埋成顆粒。制得的固定化酶穩(wěn)定性好；第17頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala固定化氨基?；钢苽銵-丙氨酸世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶第18頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶固定化的發(fā)展趨勢(shì)載體新材料層出不窮

介孔材料、納米材料，磁性材料，大孔材料等；固定化方法日新月異

定向固定，微囊化固定，酶聚集體，靜電紡絲等；酶的結(jié)構(gòu)與性能研究是熱點(diǎn)

結(jié)構(gòu)模擬與計(jì)算等；第19頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、酶的生物改造-定向進(jìn)化

自然界酶的進(jìn)化是極其緩慢的，無(wú)法適應(yīng)工業(yè)過(guò)程的需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，人們可以在試管內(nèi)利用幾周時(shí)間完成自然界幾萬(wàn)年的進(jìn)化過(guò)程自然進(jìn)化誘變育種定向進(jìn)化上萬(wàn)年幾年到十多年幾個(gè)月第20頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶的定向進(jìn)化技術(shù)發(fā)展歷程生物催化劑進(jìn)化方法發(fā)展歷程隨機(jī)和定點(diǎn)突變定向進(jìn)化計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)基于序列-功能關(guān)系與統(tǒng)計(jì)模型的理性進(jìn)化第21頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)穩(wěn)定性活性有機(jī)溶液中的活性不同的底物的利用酸堿度蛋白質(zhì)的表達(dá)親和性專一性1234……性能代數(shù)達(dá)到目的隨機(jī)突變隨機(jī)雜交篩選目標(biāo)蛋白酶定向進(jìn)化的過(guò)程和應(yīng)用范圍第22頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶定向進(jìn)化的典型例子枯草桿菌蛋白酶E熱穩(wěn)定性的分子進(jìn)化第23頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天進(jìn)化后的枯草桿菌蛋白酶E在60%的DMF中酶催化效率提高157倍，最適溫度提高17℃正面反面第24頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)硝基苯酯酶的分子進(jìn)化(LoriGiver等，1998）（在30%的DMF中酶催化活性提高100倍）第25頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天β-葡糖苷酶耐熱性的提高(Mary′aJesu′sArrizubieta等，2000）第26頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶定向進(jìn)化的基本過(guò)程隨機(jī)突變不同的定向進(jìn)化方法構(gòu)建突變基因文庫(kù)載體的選擇，基因重組，組建基因文庫(kù)突變基因的篩選

平板篩選法，熒光篩選法，表面展示法

第27頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天隨機(jī)突變方法：定向進(jìn)化的核心無(wú)性進(jìn)化方法：易錯(cuò)PCR法，盒式誘變有性進(jìn)化方法

1）DNA改組法（DNAShuffling)2）體外隨機(jī)重組法（RPR)3）交錯(cuò)延伸法(StEP)基因家族的同源重組外顯子的改組雜合進(jìn)化第28頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天易錯(cuò)PCR方法第29頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天有性進(jìn)化：DNA改組方法（1994，Stemmer)第30頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天有性進(jìn)化：體外隨機(jī)重組法（1998，Arnold)第31頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天有性進(jìn)化:交錯(cuò)延伸法（1997，Arnold)第32頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因家族的同源重組無(wú)性進(jìn)化方法：易錯(cuò)PCR法，盒式誘變有性進(jìn)化方法

1）DNA改組法（DNAShuffling)2）體外隨機(jī)重組法（RPR)3）交錯(cuò)延伸法(StEP)基因家族的同源重組外顯子的改組雜合進(jìn)化第33頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因突變庫(kù)的篩選方法目標(biāo)根據(jù)定向進(jìn)化要求，在一定的環(huán)境要求下進(jìn)行篩選，從突變基因文庫(kù)中得到所需的突變基因。難點(diǎn)突變庫(kù)容量大，一般達(dá)到106，工作量巨大關(guān)鍵高通量篩選：通量大，效率高方法平板篩選法，熒光篩選法，噬菌體表面展示法，細(xì)胞表面展示法第34頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天平板篩選方法依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況篩選熱穩(wěn)定性：溫度梯度和高溫環(huán)境抗生素耐受性：抗生素濃度梯度pH穩(wěn)定性：pH梯度極端環(huán)境：高鹽、低溫、高濃毒物質(zhì)第35頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天平板篩選方法依據(jù)顏色變化篩選大腸桿菌?-半乳糖苷酶基因顯色：噬菌體DNA載體（藍(lán)色）反應(yīng)產(chǎn)物顯色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黃色硝基酚脂肪酶篩選海因酶篩選第36頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天平板篩選方法依據(jù)透明圈大小篩選淀粉酶的進(jìn)化：淀粉平板培養(yǎng)基豆鼓纖溶酶的進(jìn)化：血纖維蛋白培養(yǎng)基第37頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光篩選方法利用自身熒光激發(fā)特性

生成產(chǎn)物本身是具有熒光激發(fā)特性的物質(zhì)利用熒光報(bào)告基因辣根過(guò)氧化合物酶和單加氧酶的融合基因：原理：萘→萘酚→醌類化合物（能激發(fā)熒光）綠色熒光蛋白基因：獲2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

第38頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天綠色熒光蛋白的應(yīng)用分子標(biāo)記：FISH分析菌株（a）未加探針；（b）DAPI染色（c）α-探針雜交（d）Msint-1268探針雜交菌株Y1；（e）Msint-1268探針雜交M.trichosporiumOB3b第39頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天噬菌體顯示篩選模式第40頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天噬菌體顯示的幾種類型第41頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天核糖體顯示技術(shù)第42頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天RNA-蛋白質(zhì)融合技術(shù)第43頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天RNA-蛋白質(zhì)的融合第44頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶定向進(jìn)化的發(fā)展趨勢(shì)定向進(jìn)化方法發(fā)展迅猛

方法均有知識(shí)產(chǎn)權(quán)；方法更有針對(duì)性和特征性；高通量篩選方法是關(guān)鍵

新方法（熒光顯示/表面展示）在涌現(xiàn)，技術(shù)交叉是趨勢(shì)；定向進(jìn)化是近20年中最成功的酶改造方法

新的實(shí)例越來(lái)越多；第45頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天

酶對(duì)熱，酸，堿以及有機(jī)溶劑的不穩(wěn)定性，限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。四、酶的人工模擬模擬酶-----模擬酶的生物催化功能，用化學(xué)半合成法或化學(xué)全合成法合成的酶。固定化酶

-----結(jié)合到特定的支持物上并能發(fā)揮作用的一類酶。第46頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)酶的作用原理來(lái)模擬酶的活性中心和催化機(jī)制，用化學(xué)方法制成的高效、高選擇性、結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性較高的新型催化劑。模擬酶利用現(xiàn)有的酶或蛋白質(zhì)做母體，引入相應(yīng)的催化機(jī)團(tuán)，形成酶的化學(xué)修飾物。以合成的高分子聚合物為母體，根據(jù)酶的活性部位結(jié)構(gòu)，連接上所需的功能機(jī)團(tuán)或金屬配合物。第47頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天主客體酶模型：環(huán)糊精、冠醚等；膠束酶模型;肽酶；抗體酶：分子印跡酶；半合成酶；雜化酶;模擬酶的分類第48頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天環(huán)糊精模擬酶?jìng)?cè)鏈上接上羥基、咪唑基和羧基，模擬胰凝乳蛋白酶結(jié)果：催化對(duì)叔丁基苯乙酸酯的水解速度比天然酶一倍第49頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天分子印跡模擬酶實(shí)例模擬結(jié)果：以R-1-苯乙醇與月桂酸的酯化反應(yīng)為模型反應(yīng)，獲得了高效的非水相脂肪酶，印跡酶在有機(jī)相中對(duì)新構(gòu)象的記憶時(shí)間達(dá)幾周，極大提高了脂肪酶的對(duì)映體選擇性。第50頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗體酶抗體的特性1）蛋白質(zhì)特性2）能高選擇配體，專一性與抗原結(jié)合3）種類達(dá)千萬(wàn)種酶的特性1）大部分為蛋白質(zhì)2）能高選擇性結(jié)合底物，催化反應(yīng)高效進(jìn)行

1.抗體酶的理論基礎(chǔ)第51頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天第52頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天12第53頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗體酶催化的應(yīng)用實(shí)例重排反應(yīng)模擬結(jié)果：以椅式構(gòu)象的氧雜雙環(huán)化合物為反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)類似物，制備了催化分支酸為預(yù)苯酸的抗體酶，比原反應(yīng)速度快102-104倍，而且僅催化（—）分支酸。第54頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天縮合反應(yīng)第55頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)酯基反應(yīng)第56頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酰胺鍵的形成第57頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天酯解反