蛋白質的研究方法

關于蛋白質的研究方法12主要內容蛋白質對象的選擇和樣品的獲取蛋白質的檢測和鑒定蛋白質的結構分析蛋白質生物功能檢測

第2頁,共125頁，2024年2月25日，星期天3蛋白質對象的選擇和樣品的獲取第3頁,共125頁，2024年2月25日，星期天4

一、研究對象的選擇無論何種來源的生物材料一般都含有成千上萬種不同的蛋白質分子；在一種生物組織中，同時又存在著多種蛋白質組分。雖然它們都具有肽鏈結構，但在分子大小、極性以及電荷上會有所差異。

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選擇研究蛋白的原則：在組織中含量比較高相對比較穩(wěn)定的蛋白質（如血液中的Hb；肌肉中的肌球蛋白和肌動蛋白等）從模式生物基因組測序結果來看，每一種生物有機體內都還有大量的蛋白質（50％左右）從來沒有被研究過。第5頁,共125頁，2024年2月25日，星期天6獲取蛋白樣品的方法：

直接從生物組織中提純蛋白—為主根據(jù)基因組測序獲得的信息

第6頁,共125頁，2024年2月25日，星期天7應用各種分辨效果好的化學及物理化學方法第7頁,共125頁，2024年2月25日，星期天8直接從生物組織中提純蛋白——蛋白質的分離純化包括以下過程：1.破碎生物組織，并用適當?shù)木彌_液將蛋白質抽提出來；2.將有關的蛋白質分級沉淀下來;

（鹽析法或有機溶劑法）3.應用層析法或電泳法使它們各自分開；4.蛋白質結晶；5.蛋白質純度鑒定和含量測定。第8頁,共125頁，2024年2月25日，星期天9根據(jù)基因組測序獲得的信息

（1）可以獲得所要研究的特定蛋白質的AA序列。

先根據(jù)推出的AA序列合成對象蛋白中的一段肽，用它去獲得有關的抗體，然后用抗體去探測蛋白質的存在，甚至可以用抗體通過親和層析純化對象蛋白第9頁,共125頁，2024年2月25日，星期天10（2）去獲得有關基因的cDNA全序列，然后通過重組DNA技術去表達重組蛋白。有偏差，甚至完全是假象。即使推測得到的蛋白質編碼信息是對的，在細胞內還存在轉錄后的RNA加工，翻譯后的蛋白質的修飾和加工等基因序列上目前還無法反映的信息。第10頁,共125頁，2024年2月25日，星期天11制備過程中注意事項：要求自始至終保持在天然狀態(tài)避免一切過激因素--如過酸或過堿，高溫，重金屬等的影響。2.通常都在低溫條件下操作。3.盡可能使樣品中蛋白質的濃度維持在較高水平。第11頁,共125頁，2024年2月25日，星期天12二、細胞的破碎

少數(shù)蛋白質存在于細胞外面（如血液和體液中）大多數(shù)蛋白質都存在于細胞的里面。

一般固形生物材料首先都必須加以破碎，以釋放出細胞內的蛋白質組分。

生物材料必須新鮮要求：

1.材料-80℃2.或者制成干粉（丙酮）

3.低溫存放第12頁,共125頁，2024年2月25日，星期天破碎的方法：機械破碎法：利用機械力的攪切作用，使細胞研碎高速攪切器、玻璃勻漿器、家用攪肉器、研缽、玻璃珠高速勻漿器以及靜壓器（高壓破碎）。2.滲透破碎法：利用低滲條件，使細胞溶脹破碎。紅血球放于水中，便發(fā)生自溶。第13頁,共125頁，2024年2月25日，星期天14*抽提作用：生物材料在破碎的過程中，通常被浸在適當?shù)木彌_液中，使細胞中的蛋白質等內容物釋放到這種溶液中去。第14頁,共125頁，2024年2月25日，星期天153.交替凍融法：

生物組織經(jīng)凍結后，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。

4.超聲波法：

利用超聲波震蕩，使細胞膜上所受張力不均而解體。

5.酶消化法：

利用蛋白酶、溶菌酶、蝸牛復合酶等對細胞膜或細胞壁的分解作用，使它們解體第15頁,共125頁，2024年2月25日，星期天16三、去污劑處理溶解膜蛋白膜蛋白的提取與細胞質蛋白，核蛋白提取不同之處在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣┑?6頁,共125頁，2024年2月25日，星期天膜蛋白的處理：復雜

細胞膜的結構第17頁,共125頁，2024年2月25日，星期天18按其所在位置大體可分為：兩種類型外周蛋白（通過次級鍵和外膜脂質的極性頭螯合在一起）

固有蛋白外周蛋白選擇適當離子強度及PH的含有EDTA的緩沖液抽提（高鹽溶液）固有蛋白嵌合在膜雙層中，它通過疏水作用與

膜內部脂質層的疏水性尾部相結合，具有α螺旋結構。第18頁,共125頁，2024年2月25日，星期天

去污劑：一類具有親水性頭部

疏性尾巴

的雙親性（amphipathic）脂類分子作用：既可以破壞細胞的磷脂雙層結構，又可以與具有疏水性表面的膜蛋白結合，從而阻止釋放出來的膜蛋白通過疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集體。

第19頁,共125頁，2024年2月25日，星期天20有的去污劑的親水性頭部可離子化（即含有一帶電基團）如：脫氧膽酸鈉（sodiumdeoxycholate）十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS）有的去污劑不能解離，所以分子中缺少帶電基團，如：

TritonX-100，辛基葡萄糖苷(octylglucoside）第20頁,共125頁，2024年2月25日，星期天21臨界微團濃度（criticalmicelleconcentration，CMC)：

每一種去污劑都具有一特征性的CMC。

CMC值與其分子中疏水部分與親水部分的結構有關。當[去污劑]低于此值的時候，去污劑分子在水溶液中將不形成微團，達到此值的時候，微團開始形成。

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離子化去污劑（SDS）：其“疏水尾巴”破壞蛋白質分子的疏水性部分的結構，其帶電的“頭部”破壞蛋白質分子中的氫鍵和離子鍵。作用的結果是：使任何蛋白（不管是膜蛋白還是水溶性蛋白）都發(fā)生完全變性，并溶解在水溶液中，同時失去生物活性。在部分情況下，當去污劑被透析掉后，蛋白質可以復性并恢復生物活性。

第22頁,共125頁，2024年2月25日，星期天23SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）：就是利用SDS的這種結合在整個蛋白分子上，并使蛋白完全變性的特性。這樣經(jīng)過SDS變性的蛋白質在電場中完全按大小分離開。第23頁,共125頁，2024年2月25日，星期天24非離子去污劑：相對溫和，一般不會使蛋白質變性。只是將蛋白質分子從膜上溶解下來而已。當[去污劑]＜其CMC值的時候，去污劑分子與膜蛋白表面的疏水區(qū)域結合，使蛋白質在水溶液中溶解而不聚集。當[去污劑]≧其CMC值的時候，去污劑分子將與膜磷脂一起形成混合微團，膜蛋白以整合在微團中的形式存在。一般選擇非離子去污劑來保持膜蛋白生物活性第24頁,共125頁，2024年2月25日，星期天

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四、蛋白分子的穩(wěn)定防止蛋白質分子可能被同時釋放的蛋白質水解酶降解、Pr空間結構可能被溫度或化學試劑等環(huán)境因素破壞而喪失生物學活性等。處理：需要在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑；在低溫下操作；加入穩(wěn)定劑(如甘油等）．第27頁,共125頁，2024年2月25日，星期天28五、細胞碎片的去除——離心(centrifugation)

原理：懸浮在溶液中的兩個或多個不同質量或密度的顆粒（如細胞、細胞器、大分子復合體、或分子等）沉降到試管的底部的速度是不一樣的，質量越大、或密度越高沉降的速度越快。沉淀：固體性的細胞碎片和細胞器沉降到離心管的底部形成；上清：絕大多數(shù)蛋白分子或蛋白復合體保留在細胞抽提液中即上清中．

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六、目標蛋白質的分離、純化

蛋白質的分級沉淀和層析分離將不同蛋白質分開的性質主要包括：分子量的大小帶電情況水溶性與某種物質的特異高親和力等

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（一）蛋白質的分級沉淀

常用的方法有：

鹽析法

有機溶劑法第30頁,共125頁，2024年2月25日，星期天31蛋白質的膠體性質：

蛋白質顆粒表面多為親水基團，可吸引水分子，使顆粒表面成有一層水膜，蛋白質顆粒相互隔開，不會聚集成大顆粒而沉淀。此外，蛋白質表面可帶有電荷，可起膠粒穩(wěn)定的作用。若去除蛋白質膠體表面電荷和水化膜兩個穩(wěn)定因素，蛋白質極易從溶液中析出

鹽析法第31頁,共125頁，2024年2月25日，星期天32#第32頁,共125頁，2024年2月25日，星期天33

鹽析法

概念：將中性鹽加入蛋白質溶液，破壞水化膜和電荷而使蛋白質沉淀，叫鹽析。各種蛋白質鹽析所需的鹽濃度及PH不同，加入不同濃度的中性鹽可使各種蛋白質依次分別沉淀出來。

優(yōu)點：操作簡便對易變性的蛋白質有一定的保護作用，適用范圍十分廣泛。缺點：分辨能力差，純化倍數(shù)低第33頁,共125頁，2024年2月25日，星期天341.基本原理在蛋白質水溶液中添加無機鹽，可以產(chǎn)生兩種影響：

(1)鹽離子與Pr分子中的極性基團離子基團作用降低Pr分子的活度系數(shù)，趨使其溶解度。(2)鹽離子也與水這種偶極分子作用，使水分子的活度降低，導致Pr水合程度的減少，從而趨使Pr溶解度。第34頁,共125頁，2024年2月25日，星期天35

*鹽溶（saltingin)--當溶液中的鹽離子強度比較低的時候，蛋白質的溶解度會隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象叫做～.*鹽析（saltingout)--但當溶液中的鹽離子強度比較高的時候，蛋白質的溶解度會隨著鹽濃度的增加而降低，這種現(xiàn)象叫做～

.一定的鹽濃度下，每一種蛋白都有一不同的特異溶解度。

第35頁,共125頁，2024年2月25日，星期天36影響鹽析作用的因素（1）鹽的種類（2）PH和溫度#（3）蛋白質濃度%第36頁,共125頁，2024年2月25日，星期天37（1）鹽的種類對同一種Pr而言，價數(shù)愈高的鹽離子，鹽析能力也愈強:

PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CHOHCOO-）2＞

AC－＞CL－＞NO3-＞Br-＞I-＞CNS-K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+

負離子價數(shù)較高的中性鹽（如硫酸鹽、磷酸鹽等）的Ks值常較一價中性鹽的Ks值高。

Ks:鹽析常數(shù)（價數(shù)較高時，Ks值也較大）。代表鹽析的效率，是與Pr及鹽種類有關的特性常數(shù)。第37頁,共125頁，2024年2月25日，星期天38硫酸銨（常用鹽析劑）

優(yōu)點：鹽析能力較強具有較高的溶解度較低的溶解度溫度系數(shù)價格低廉不產(chǎn)生副作用。

缺點：緩沖能力較差

PH難控制第38頁,共125頁，2024年2月25日，星期天39（2）PH和溫度S。代表蛋白質在無機鹽溶液中的溶解度

除取決于Pr的種類，還受PH及溫度影響:PH=PI時，S。的數(shù)值極小

S。隨溫度增加而減低。鹽析過程中，若增高溫度，有助于Pr的析出。#第39頁,共125頁，2024年2月25日，星期天40（3）蛋白質濃度

[Pr]較高，在較低無機鹽濃度時,蛋白質便開始析出，鹽析界限比較寬。

[Pr]較低，需要無機鹽的濃度也高，即鹽析界限變窄。

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蛋白質濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低。但蛋白質濃度愈高時，其他蛋白質的共沉淀作用也愈強

所以當?shù)鞍踪|溶液太濃時，應適當稀釋，通常在2.5～3.0％之間比較合適。第41頁,共125頁，2024年2月25日，星期天421.基本原理（1）在PI附近，Pr主要以中性離子形式存在。此時若添加有機溶劑，由于有機溶劑可使溶液電離常數(shù)減小，增強了中性離子間靜電引力，從而使分集合而沉淀出來。（2）有機溶劑本身的水合作用會破壞Pr表面的水合層，也促使Pr變得不穩(wěn)定而聚集析出.常用的有機溶劑：乙醇和丙酮

有機溶劑法

分辨力比鹽析方法高，提純效果好

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2.影響有機溶劑沉淀Pr的因素

（1）

PH值

PH=PI時蛋白質的溶解度最低。按PI來調節(jié)PH值，有利于分離。（2）蛋白質濃度

[Pr]越高，加入一定量有機溶劑后，Pr析出越多。此時溶液的介電常數(shù)也相應提高，可以減少Pr的變性。

[Pr]越高,Pr分子間作用引起的共沉淀現(xiàn)象也顯著增強，這樣分離效果差，不利于分級沉淀。

只有選擇恰當?shù)腫Pr]才有可能獲得良好的分高效果。第43頁,共125頁，2024年2月25日，星期天44（3）離子強度中性鹽的加入能促使Pr在有機溶劑中溶解，并且能防止Pr的變性。但含鹽過多，卻會使Pr

過度析出，不利于分級沉淀。一般∠0.05M的稀鹽溶液。（4）多價陽離子

Pr與多價的陽離子如（Zn2+、Cu2+等）能結合成復合物。這種復合物在有機溶劑中往往使Pr

溶解度變小。第44頁,共125頁，2024年2月25日，星期天45常溫下有機溶劑可使蛋白質變性，低溫條件下可減慢變性速度。因此用有機溶劑沉淀蛋白質時應在低溫條件下進行。如利用丙酮沉淀蛋白質時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量-般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離，否則蛋白質會變性。

缺點：易使酶和具有活性的蛋白質變性。故操作時要求條件比鹽析嚴格。對于某些敏感的酶和蛋白質，使用有機溶劑沉淀尤其要小心。

第45頁,共125頁，2024年2月25日，星期天46

(二）蛋白質的層析分離法

（色譜法）最基本的特征：固定相流動相第46頁,共125頁，2024年2月25日，星期天47

原理—

各種物質得以分離的最基本原因：就在于它們在這兩個相之間具有不同的分配系數(shù).兩相作相對運動時，這些物質在兩相間進行多次的分配，即使它們的分配系數(shù)只有微小的差異，通過這個過程也能得到最大的分離效果。第47頁,共125頁，2024年2月25日，星期天48

層析分離能力的實質—物質的分配問題

*分配系數(shù)：

當一種溶質分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在固定相和移動相兩相內的濃度之比是一個常數(shù)，這稱為分配系數(shù)。C1K=C2

*質量分配系數(shù)：若不用濃度而用物質的絕對量的比值來表示，則稱為質量分配系數(shù)即：

VsD=KVm

Vs:固定相的體積Vm:

流動相的體積

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種類：

氣相層析按兩相狀態(tài)來分液相層析吸附層析分配層析按層析機理來分離子交換層析凝膠排阻層析親和層析柱層析按操作方式來分薄層層析紙層析層析法分離、純化：Pr、多肽和AA第49頁,共125頁，2024年2月25日，星期天50

離子交換層析法*原理：陰（陽）離子交換樹脂顆粒（作為固定相）填充在層析柱內，由于陰（陽）離子交換樹脂顆粒上帶正（負）電荷，能吸引溶液中的

陰（陽）離子。然后再用含陰（陽）離子的溶液洗柱。含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來，增加陰離子濃度，含負電量多的蛋白質也被洗脫下來，于是兩種蛋白質被分開。第50頁,共125頁，2024年2月25日，星期天51第51頁,共125頁，2024年2月25日，星期天52固定相：1.纖維素

DEAE纖維素、CM纖維素2.葡聚糖第52頁,共125頁，2024年2月25日，星期天53纖維素:骨架為柔性長鏈1.

加入量

：加入層析柱的蛋白質量通常纖維素量的十分之一。2.

提高分辨率，樣品體積應盡可能地少。3.

在洗脫時，可以通過改變洗脫緩沖液的PH，而使蛋白質分子電荷減少而被解吸下來，也可以通過提高洗脫緩沖液中離子強度，減弱蛋白質分子與載體親和力的辦法，將蛋白質組分逐一洗脫下來。第53頁,共125頁，2024年2月25日，星期天54葡聚糖的離子交換樹脂:骨架為三維網(wǎng)狀結構優(yōu)點：1.同時具有分子篩的作用2.因其高度的網(wǎng)狀結構，所帶有的交換基團也比纖維素多得多。交換容量為離子交換纖維素的3～5倍。

缺點：

它的床體積常受PH或鹽濃度影響而變化，對分離效果有一定程度的干擾。

第54頁,共125頁，2024年2月25日，星期天55凝膠（排阻）層析又稱分子篩或凝膠過濾（gelfiltration）原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。當分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時，直徑大于孔徑的分子將不能進入凝膠內部，便直接沿膠粒間隙流出（全排出）。較小的分子進入能容納它的孔穴，繞道而行，在柱內保留時間就比較長。這樣，較大的分子被先洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而達到相互分離的目的.#第55頁,共125頁，2024年2月25日，星期天56用作凝膠的載體物質有三類：

交聯(lián)葡聚糖凝膠商品名為SephadexG

聚丙烯酰胺凝膠商品名為Bio-gelP(丙烯酰胺+N，N’-次甲基二丙烯酰胺聚合而成

P值表示不同的交聯(lián)度)

瓊脂糖凝膠商品名為Sepharose或Bio-gelA

（從海藻瓊脂中分離除去瓊脂膠后的中性級成分是D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖相間重復結合而成的鏈狀化合物）第56頁,共125頁，2024年2月25日，星期天57第57頁,共125頁，2024年2月25日，星期天58瓊脂糖凝膠優(yōu)點：1.其機械強度比葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠好得多。2.對蛋白質等高分子的吸附作用也小得多3.適用分子量的范圍寬，最大可以到108。第58頁,共125頁，2024年2月25日，星期天59凝膠排阻層析的應用：1.作為分析工具(分子量差別大的物質)2.作為脫鹽工具(SephadexG-25)3.高分子溶液的濃縮(不穩(wěn)定的高分子)4.去除熱原物質(DEAE-A-25)5.物質的分離提純6.用于測定高分子物質的分子量第59頁,共125頁，2024年2月25日，星期天60吸附層析法原理：柱層析中，含有Pr分子的混合物隨流動相通過由吸附劑組成的固定相時，Pr分子通過各種次級作用能夠吸附在吸附劑上,由于不同分子的吸附能力不同，可以通過洗脫使它們逐一解脫出來，而使混合物得以分離。優(yōu)點：1.

物理吸附，吸附能量比較低，洗脫也比較容易。2.操作簡便，吸附劑容易獲得，價格較低廉第60頁,共125頁，2024年2月25日，星期天61固定相：吸附劑—磷酸鈣凝膠磷酸鈣膠Ca3（PO4）2磷酸氫鈣膠CaHPO4·2H2O羥基磷酸鈣膠Ca5（PO4）3OH[羥基磷灰石]磷酸鈣膠對蛋白質的吸附作用原理:主要是由于１.Ca2+與Pr負電荷性基團結合。２.磷酸基團與Pr正電荷基團第61頁,共125頁，2024年2月25日，星期天62

流動相：

洗脫劑--檸檬酸鹽作用：檸檬酸離子因與Ca2+有更強的相互作用，它能大大降低蛋白質和凝膠的吸附能力。

NaCl，KCI甚至濃度高達3M時，也不影響Pr負電荷的吸附，相反這些鹽可以大大降低Pr正電荷的吸附。因此在高濃度的這些鹽溶液中應用羥基磷灰石進行層析時，可以專門吸附酸性蛋白質及中性蛋白質而排除堿性蛋白質。第62頁,共125頁，2024年2月25日，星期天63親和層析法1.原理：利用生物高分子具有能和某些相對應的專一分子可逆結合的特性。

如，酶的活性部位能和底物\抑制劑\輔助因子專一性地結合,改變條件又能使這種結合解除.[酶的變構中心與變構因子（或稱效應物）之間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結合蛋白與結合物之間]。這些被作用的對象物質稱之為配基（ligand)。

第63頁,共125頁，2024年2月25日，星期天64固定相--配基固定在固相載體上第64頁,共125頁，2024年2月25日，星期天65第65頁,共125頁，2024年2月25日，星期天662.優(yōu)點：具有高度的吸附專一性層析過程簡便、快速3.載體的選擇：(1)必須具有高度親水性，使Pr分子容易與它接近.(2)非專一性吸附要十分小。(3)必須具有大量可供活化而能與配基結合的基團。

常用載體：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酸胺凝膠和多孔玻璃等。

第66頁,共125頁，2024年2月25日，星期天67高效液相層析法（HighPerformanceLiquidChromatography

，HPLC）又稱“高壓液相色譜，是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。

第67頁,共125頁，2024年2月25日，星期天68HPLC包括：

輸液系統(tǒng)：驅動流動相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統(tǒng)

層析柱：分離樣品中的各個物質

進樣器：將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)

檢測系統(tǒng)：將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉化為光學或電學信號，并分析顯示出來第68頁,共125頁，2024年2月25日，星期天69第69頁,共125頁，2024年2月25日，星期天70第70頁,共125頁，2024年2月25日，星期天71分類(1)液一固吸附層析(2)液一液分配層析：是應用最多的方法之一。(3)離子交換層析(4)凝膠滲透層析第71頁,共125頁，2024年2月25日，星期天72⑴液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機酸或聚酰胺凝膠等。液-固吸附層析中的流動相依其所起的作用不同，分為“底劑”和洗脫劑兩類，底劑起決定基本色譜的分離作用，洗脫劑起調節(jié)試樣組份的滯留時間長短，并對試樣中某幾個組份具有選擇性作用。第72頁,共125頁，2024年2月25日，星期天73⑵液-液分配層析：固定相為單體固定液構成。將固定液的官能團結合在薄殼或多孔型硅膠上，經(jīng)酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羥基。這種以化學鍵合相為固定相的液-液層析稱為化學鍵合相層析。另一種利用離子對原理的液-液分配層析為離子對層析。第73頁,共125頁，2024年2月25日，星期天74⑶離子交換層析：原理與普通離子交換相同。在離子交換HPLC中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱離子性鍵合相層析。流動相主要是水溶液，pH值最好在被分離酸、堿的pK值附近。第74頁,共125頁，2024年2月25日，星期天75

蛋白質的檢測和鑒定第75頁,共125頁，2024年2月25日，星期天76

一般可通過以下幾個方面進行：

光譜學特性電泳行為特異抗體反應特異生物學活性

N一末端氨基酸序列測定質譜檢測排阻層析

第76頁,共125頁，2024年2月25日，星期天77

一、光譜學特性

光譜特性的總原則是：當一定波長的光（即電磁波）與Pr分子接觸時，所吸收的或反射的輻射能量與Pr分子結構特征和濃度是密切相關的。

第77頁,共125頁，2024年2月25日，星期天78

不同波長范圍的電磁波與其作用后的剩余能量值反映的是蛋白質分子的不同特征:190--200nm波長范圍的光吸收反映的是蛋白質主鏈上的酞胺鍵中電子的被激發(fā)；230-300nm波長范圍的光吸收譜（最大吸收值在280nm波長處）反映的是蛋白質分子中芳香族氨基酸側鏈上電子的被激發(fā)。所以一般情況下，溶液在280nm波長處（屬紫外光范圍）的光吸收能力被當做是存在蛋白質的證據(jù)。第78頁,共125頁，2024年2月25日，星期天79二、電泳檢測

蛋白質分子為兩性電解質，在不同PH的溶液中帶有不同的電荷，從而在直流電場中能夠泳動，這就是電泳現(xiàn)象。按介質狀態(tài)來分:自由電泳區(qū)帶電泳按操作原理可分為:

一般電泳等電電泳等電聚焦電泳免疫電泳等第79頁,共125頁，2024年2月25日，星期天80自由電泳--以溶液為介質，在溶液中將蛋白質分離

缺點:自由電泳過程中擴散嚴重，分辨率有限區(qū)帶電泳--在固體支持物上所進行的電泳．固體支持物有:濾紙、醋酸纖維薄膜、瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠

優(yōu)點:分辨率很高。第80頁,共125頁，2024年2月25日，星期天81SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS–(十二烷基硫酸鈉)是陰離子型去污劑(Sodiumdodecylsulfate,SDS)Qu=

（遷移率）6πrηu與Q、r有關

若蛋白質分子帶有足夠的電荷，在SDS中進行電泳，由于分子篩效應，

u僅取決于分子的大小。因此SDS一凝膠電泳可以按蛋白質分子大小的不同將其分開。這時，若以分子量的對數(shù)（logM）對相對于染料前沿的遷移率（Rf）作圖，呈現(xiàn)線性關系。

第81頁,共125頁，2024年2月25日，星期天82第82頁,共125頁，2024年2月25日，星期天83

這種關系，對一種膠濃度時，只適用于一定的分子量范圍：

5％膠濃度時，適用于分子量6～200萬的區(qū)間；

10％膠濃度時，適用于分子量1.6～7萬的區(qū)間；

15％膠濃度時，適用于分子量1.2～4.5萬的區(qū)間。

第83頁,共125頁，2024年2月25日，星期天84聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜第84頁,共125頁，2024年2月25日，星期天等電聚焦電泳——（isoelectricfocusing,IEF）是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術。

利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內制造一個pH梯度。

pH梯度制作利用的兩性電解質（ampholyte，商品名為ampholine），是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場作用下，自然形成pH梯度。

凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等

第85頁,共125頁，2024年2月25日，星期天86Pr分子有一定的PI，它處在一個由陽極到陰極梯度逐漸增加的介質中，并通過以直流電時，它便“聚焦”在與其PI相同的pH位置上。PI不同的蛋白質泳動后形成位置不同的區(qū)帶而得到分離。第86頁,共125頁，2024年2月25日，星期天87優(yōu)點：1.有很高的分辨率；2.可以區(qū)分等電點只有0.01pH單位差異的蛋白質；3.根據(jù)其所在位置還能夠測定蛋白質的分子量；4.對很稀的樣品，最后達到高度的濃縮。第87頁,共125頁，2024年2月25日，星期天88雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）

第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳--PI第二向采用SDS一凝膠電泳--分子量由于結合了蛋白質的等電點和分子量兩種完全不同的特一性來進行分離，因此具有非常高的分辨率可同時分析幾千上萬個蛋白，分辨率高，分離度好。是蛋白質組學研究的核心技術。第88頁,共125頁，2024年2月25日，星期天89雙向PAGE第89頁,共125頁，2024年2月25日，星期天90

雙向電泳技術缺點，具有以下特征的蛋白質在二維電泳中還很難被檢測到：①等電點（pl)值很大或很小的，比如大于8和小于4的那些蛋白質；②分子質量很大的蛋白質，比如大于l00kDa的蛋白質就比實際的少了，而大于150kDa的蛋白質就幾乎完全探測不到了（盡管在一維電泳凝膠上這些大蛋白質都能清楚地被觀察到；③疏水性蛋白質。

第90頁,共125頁，2024年2月25日，星期天免疫電泳

將電泳分離和專一性免疫沉淀相結合的分析方法：

免疫電泳法是指利用凝膠電泳與雙向免疫擴散兩種技術結合的實驗方法。在電場作用下標本中各組分因電泳遷移率不同而分成區(qū)帶，然后沿電泳平行方向將凝膠挖一溝槽，將抗體加入溝槽內，使抗原與抗體相互擴散而形成沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置及形狀，以分析標本中所含組分的性質。由于免疫反應有很高的專一性，可用于鑒定Pr的純度，分析樣品中蛋白質的組分。PH8.6本實驗常用于抗原分析及免疫性疾病的診斷。第91頁,共125頁，2024年2月25日，星期天92第92頁,共125頁，2024年2月25日，星期天93三、測定純化蛋白質的分子大小

測定蛋白處于非變性條件下的大小一般可通過：凝膠層析沉降平衡超速離心（sedimentationequlibriumultracentrifugation)

動態(tài)光散射（dynamiclightscattering)孔徑梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳（poregradientpolyacrylamidegelelectrophoresis）

第93頁,共125頁，2024年2月25日，星期天94凝膠層析

1.凝膠是一類多孔性高分子聚合物,每個顆粒猶如一個篩子.當樣品溶液通過凝膠柱時,相對分子質量較大的物質由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙,隨著溶劑流動,因此流程較短,向前移動速度快而首先流出層析柱;2.反之,相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔,可自由地進出凝膠顆粒的網(wǎng)孔,在向下移動過程中,它們從凝膠內擴散到膠?？紫逗笤龠M入另一凝膠顆粒,如此不斷地進入與逸出,使流量增長,移動速率慢而最后流出層析柱.第94頁,共125頁，2024年2月25日，星期天953.而中等大小的分子,它們也能在凝膠顆粒內外分布,部分進入顆粒,從而在大分子物質與小分子物質之間被洗脫.這樣,經(jīng)過層析柱,使混合物中的各物質按其分子大小不同而被分離。

Ve＝－b’logMwC’其中b’,C’為常數(shù)。即Ve為洗脫體積，與logMw也成線性關系。我們可以通過在一凝膠柱上分離多種已知分子量的蛋白質后，并根據(jù)上述的線性關系繪出標準曲線，然后用同一凝膠柱測出其它未知蛋白的分子量。第95頁,共125頁，2024年2月25日，星期天96沉降平衡超速離心（sedimentationequlibriumultracentrifugation)

用該技術測定蛋白質分子質量的時候，測定的是幾個絕對動力學參數(shù)。第96頁,共125頁，2024年2月25日，星期天

原理：當Pr樣品在相對較低的離心速度（但還是處于超速范圍）下離心時，在一個從離心管頂部指向底部的、越往底部越大的沉降力作用下，Pr分子很快形成一個從離心管頂部往下逐漸增加的連續(xù)Ｐr濃度梯度；與此同時，將有一個方向與離心力相反的擴散力作用于Pr上；當沉降離心進行一定時間之后，作用于Pr上的離心力和擴散力（前者與蛋白在離心管中所在位置離軸心的距離成正比例，后者與Pr濃度成正比）正好相互消除，這樣使得蛋白樣品的表面處于一個平衡狀態(tài)而不再移動；在這種平衡條件下，不同部位Pr濃度與所在部位離軸心的距離之間的關系與蛋白質分子質量成某種數(shù)學關系。第97頁,共125頁，2024年2月25日，星期天98第98頁,共125頁，2024年2月25日，星期天99

動態(tài)彈性光散射是通過測定蛋白顆粒的直徑、然后與標準蛋白樣品比較而推算蛋白分子質量的方法。這種測定技術也可通過觀察樣品是單分散性的（monodispersed）還是多分散性的（polydisper-sed）而反映所測蛋白樣品是否均一。

第99頁,共125頁，2024年2月25日，星期天100

孔徑梯度電泳

這是通過制備具有一定范圍的從大到小孔徑梯度的聚丙烯酸胺凝膠，然后讓蛋白在非變性條件下在這種凝膠上電泳而進行的。經(jīng)過低電流條件下的較長時間的電泳，蛋白質分子將在凝膠中與其直徑相等的孔徑處停下（因為再往下凝膠中的孔徑比蛋白直徑小）。通過與同時在膠中電泳的標準樣品比較我們就可以知道蛋白在這種非變性條件下的分子質量。優(yōu)點：１.所獲得的是天然狀態(tài)下的蛋白分子大小。

2.如果蛋白分子能夠在這種低電流電場中長時間保持穩(wěn)定的話，這種方法比較經(jīng)濟。第100頁,共125頁，2024年2月25日，星期天101

質譜質譜是一種在化學中被廣泛采用的、測定原子或分子質量方法中最直接、最準確的方法。

第101頁,共125頁，2024年2月25日，星期天102

用質譜測定蛋白質分子質量的總的原理：首先純化好的蛋白樣品要被轉變成揮發(fā)和帶電（即解離）狀態(tài)，電離后的蛋白質分子（帶有多個電荷）然后進人一個真空加速電場中，之后，不同質荷比（m/z）的蛋白分子表現(xiàn)出的行為〔或者在外加磁場中的偏轉、或者抵達固定探測器的所謂“飛行時間（timeofflight,TOF)"〕不一樣。利用所測得的質荷比以及蛋白所帶的電荷值，計算機軟件很快就會正確地給出所測蛋白分子的質量。

第102頁,共125頁，2024年2月25日，星期天103

用質譜測定蛋白質的分子質量，精確一般可達0.01%，是目前進行蛋白質分子量測定最準確的方法（其準確度超過SDS、彈性光散射和孔徑梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳，甚至分析超速離心等）。質譜技術現(xiàn)在也可直接用于：氨基酸序列的測定蛋白質的翻譯后修飾的鑒定蛋白質組學研究工作。第103頁,共125頁，2024年2月25日，星期天104

四、測定蛋白質的氨基酸序列蛋白質被純化出來，需要進一步獲取其基因序列，最好測定其部分的或全部的氨基酸序列。自動氨基酸測序儀

第104頁,共125頁，2024年2月25日，星期天105

五、用抗體探測特異蛋白質分子抗體是當外源入侵物（包括蛋白質）與脊椎動物體內的免疫系統(tǒng)接觸后產(chǎn)生的、能與入侵物特異結合的防御性蛋白質分子。這種高度特異、高度靈敏的抗體一抗原結合反應現(xiàn)在被廣泛地應用于檢測微量蛋白的存在情況。

第105頁,共125頁，2024年2月25日，星期天106

目前應用抗體研究蛋白質的方法主要包括下面幾種：

１.蛋白質印跡

2.免疫共沉淀

第106頁,共125頁，2024年2月25日，星期天107(一）蛋白質印跡（Westernblotting）是一種使用廣泛的檢測蛋白質的方法。這種方法與研究核酸時用的印跡法原理非常類似－－蛋白質印跡法是利用抗原一抗體之間的特異結合反應而檢測的；核酸類的印跡法是利用核酸分子之間通過特異堿基配對法則而形成雜交分子這一原理而檢測的

第107頁,共125頁，2024年2月25日，星期天108

蛋白質印跡－－檢測時，蛋白質混合物（一般是細胞抽提物）通過電泳被分開，蛋白質被（一般通過電場的作用）轉移到一種特別的膜（如硝化纖維膜等）上，然后讓特異的抗體與固定在膜上的特異抗原蛋白結合抗原一抗體之間結合的高度特異性使得用某種蛋白質分子制備的特異抗體分子只與膜上的這種蛋白質分子結合，而不與膜上存在的成千上萬種其他蛋白質發(fā)生相互作用。第108頁,共125頁，2024年2月25日，星期天109

結合了特異抗體的蛋白質條帶可以通過能與結合在抗原蛋白上的所謂“第一”抗體結合的、被一種特異的酶／化學發(fā)光基團／熒光基團／放射性同位素標記的“第二”抗體進行顯示。這樣我們可以知道與特異抗體對應的抗原蛋白在檢測的蛋白混合物中是否存在？相對量是多少？如果蛋白混合物是通過SDS分開的話，被檢測蛋白的分子量也一目了然。

第109頁,共125頁，2024年2月25日，星期天110

（二）免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一種在體外探測兩個蛋白分子之間是否存在特異相互作用的方法。免疫共沉淀的原理：如果兩個蛋白在體外系統(tǒng)中能夠發(fā)生特異相互作用的話，那么當用兩個蛋白中的一個所對應的抗體進行免疫沉淀的時候，另一個蛋白也將同時被沉淀下來。

第110頁,共125頁，2024年2月25日，星期天111

蛋白質的結構分析

第111頁,共125頁，2024年2月25日，星期天112

蛋白質結構包括：共價結構和非共價結構靜態(tài)結構和動態(tài)結構。一級結構空間結構第112頁,共125頁，2024年2月25日，星期天113

一、氨基酸序列測定－一級結構的測定蛋白質的一級結構決定其高級結構，測定一個蛋白質的一級結構是我們認識一個蛋白質結構和功能的前提之一。

第113頁,共125頁，2024年2月25日，星期天114

Edman降解法：是肽鏈或蛋白質中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲爾·埃德曼（PehrEdman）首先創(chuàng)立。

質譜技術－－基于串聯(lián)質譜技術的ＡＡ測序方法是根據(jù)質譜技術測定多肽分子質量的極高準確性這一特點而設計的

通過測定蛋白質的氨基酸所對應的DNA編碼序列上讀出（從cDNA序列直接讀出，或從對應的基因組DNA序列中的外顯子序列）第114頁,共125頁，2024年2月25日，星期天115Edman降解法：原理：用異硫氰酸苯酯（PITC）與待分析多肽的N-端氨基在堿性條件下反應，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）的衍生物，然后用酸處理，關環(huán)，肽鏈N-端被選擇性地切斷，得到N-端氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接著用有機溶劑將該衍生物萃取出來，酸作用下，該衍生物不穩(wěn)定，會繼續(xù)反應，形成一個穩(wěn)定的苯基乙內酰硫脲（PTH）衍生物。余下肽鏈中的酰胺鍵不受影響。通過用HPLC或電泳法分析生成的苯乙內酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鑒定出是哪一個氨基酸。每反應一次，結果是得到一個去掉N-端氨基酸殘基的多肽，剩下的肽鏈可以進入下一個循環(huán)，繼續(xù)發(fā)生降解。第115頁,共125頁，2024年2月25日，星期天116優(yōu)點：能夠可靠地測定肽鏈的30個左右氨基酸殘基序列，最多可以分析50-60個氨基酸殘基。在最好的條件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少，缺點：由于Edman降解是以化學試劑對N-端氨基的修飾為基礎的，因此當N-端被其他化學基團所封閉時，就需要先去除這些基團，然后才能進行測序。此外，蛋白質中含有半胱氨酸殘基時，有時兩個半