課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課件

專題五DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA技術(shù)課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段知識(shí)回顧DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、基本單位3、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段復(fù)習(xí)DNA復(fù)制的條件解旋酶：打開DNA雙鏈DNA母鏈：提供DNA復(fù)制模板4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈引物：使DNA連接脫氧核苷酸ATP課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1、DNA分子的平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端3'端-OH端為3′磷酸基團(tuán)的末端為5′。課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是如何形成的課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2、復(fù)制過(guò)程解讀 ①DNA的解旋親代DNA分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈②RNA引物的合成,以單鏈DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段③DNA的生成以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時(shí)的DNA片斷稱為岡崎片斷課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段⑤DNA片斷的連接在DNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來(lái)。形成一條完整的新的DNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的子代DNA課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物2、DNA聚合酶作用過(guò)程當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸想一想課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段思考：

能否在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增？PCR技術(shù)課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1、PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)：2、原理：一、基礎(chǔ)知識(shí)

（一）PCR原理：閱讀課本P58-59課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段DNA母鏈：解旋酶(條件）：4種脫氧核苷酸：DNA聚合酶（條件）：ATP：引物：緩沖溶液適宜溫度3、PCR反應(yīng)的條件80—100℃：耐熱的DNA聚合酶：課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段(二)PCR反應(yīng)的過(guò)程1、變性：

溫度上升到90℃以上時(shí),雙鏈DNA解聚成為單鏈。2、復(fù)性（退火）：

溫度下降到50℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。3、延伸：

溫度上升到72℃左右,溶液中的4種脫氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則合成新的DNA鏈。課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR循環(huán)第一步：加熱變性:雙鏈DNA解聚成為單鏈課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段模板序列模板序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段模板序列模板序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸:合成新的DNA鏈課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段模板序列模板序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)拷貝的靶序列課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,82430次循環(huán)后擴(kuò)增的數(shù)量課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段4、PCR循環(huán)的結(jié)果②DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。①?gòu)牡诙喲h(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ（延伸而成的DNA單鏈）結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸。課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR反應(yīng)詳細(xì)解析第一輪變性ＡＢ復(fù)性ＡＢ課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段延伸ＡＢ第二輪Ａ變性Ａ1Ａ2A鏈PCR課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段復(fù)性Ａ1Ａ2延伸Ａ1Ａ2PCR終產(chǎn)物課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段B鏈PCR變性BB1B2復(fù)性B1B2課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR終產(chǎn)物延伸B1B2第三輪A1B2同A鏈第二輪PCR反應(yīng)同B鏈第二輪PCR反應(yīng)課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段試驗(yàn)設(shè)計(jì)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增雙歧桿菌的DNA的片段課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段實(shí)驗(yàn)器材雙歧桿菌培養(yǎng)基離心機(jī)微量移液器化學(xué)試劑PCR儀課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1.雙歧桿菌的培養(yǎng)培養(yǎng)24h培養(yǎng)基配方：大豆蛋白胨5g酵母提取物10g

微量鹽溶液40ml葡萄糖10g

半膀氨酸鹽酸鹽0.5g0.1%胰胨5g

刃天青1mlPH=7實(shí)驗(yàn)過(guò)程課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2.PCR操作菌液離心，保留底部雙歧桿菌沉淀在雙歧桿菌沉淀中加入0.2ml裂解液，使細(xì)胞裂解，釋放DNA3.DNA處理2.提取DNA55℃加熱孵育3h90℃加熱10min冷冰中冷卻離心1.菌體處理課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段4.其它組分添加DNA上清液10μL10倍擴(kuò)增緩沖液5μL25mmol/LMgCl2溶液3μL20mmol/L4種脫氧核苷酸的均勻混合液1μLTaq聚合酶1μL兩種引物各0.5μL蒸餾水29μL課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段預(yù)變性94℃，5min30次重復(fù)反應(yīng)94℃，30s55℃，30s最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min72℃，1min5.PCR反應(yīng)變性復(fù)性延伸課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段6.PCR產(chǎn)物檢驗(yàn)分光光度計(jì)法

取2μLPCRDNA溶液，加入98μLH2O，使DNA５０倍稀釋

以蒸餾水為對(duì)照，在260nm處測(cè)樣品DNA的光吸收值根據(jù)公式計(jì)算DNA含量DNA含量（μg/mL）=50×（260nm度數(shù)）×稀釋倍數(shù)課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段結(jié)果分析與評(píng)價(jià)根據(jù)公式計(jì)算DNA片段的含量比擴(kuò)增前增加了了多少倍。課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段相關(guān)鏈接瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA含量1.配制濃度為１％的瓊脂糖凝膠，倒入電泳槽中，插好梳子課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2.向電泳槽中加入電泳緩沖溶液，移去梳子3.在DNA中加入載樣緩沖液，混勻后，滴加到樣品孔中課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段4.接通電源，電泳20-40min+-5.EB溶液染色，在紫外儀上觀察電泳帶及其位置，判斷擴(kuò)增情況課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段

觀察電泳帶的粗細(xì)以及分布評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課堂小結(jié)在體外制造與體內(nèi)相同的環(huán)境，進(jìn)行DNA復(fù)制反應(yīng)緩沖溶液DNA模板與兩條模板鏈結(jié)合的兩種引物PCR原理PCR反應(yīng)條件四種脫氧核苷酸耐熱的DNA聚合酶合適的溫度課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段變性復(fù)性延伸PCR反應(yīng)過(guò)程課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段DNA含量檢測(cè)紫外分光光度計(jì)法凝膠電泳法課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段高考鏈接1.2006.廣東下列關(guān)于基因工程應(yīng)用的敘述，正確的是（）A．基因治療就是把缺陷基因誘變成正?；駼．基因診斷的基本原理是DNA分子雜交C．一種基因探針能檢測(cè)水體中的各種病毒D．原核基因不能用來(lái)進(jìn)行真核生物的遺傳改良B課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段解析：基因治療是把健康的外源基因?qū)氲接腥毕莼虻募?xì)胞中；一種基因探針能檢測(cè)相應(yīng)的某一種特定的病毒；原核基因可以用來(lái)進(jìn)行真核生物的遺傳改良，例如用蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因改良棉花。課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2.2005.全國(guó)卷Ⅱ檢測(cè)基因序列所必須的酶是（）

A.解旋酶

B.DNA連接酶

C.限制性內(nèi)切酶

D.RNA聚合酶C課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段解析：A.解旋可以用加熱法。B.DNA連接酶是在取得目的基因、并打開運(yùn)載體后把它們組合起來(lái)時(shí)使用的。D.RNA聚合酶是在轉(zhuǎn)錄或者RNA自我復(fù)制時(shí)使用課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段3.2002.廣東判斷：DNA復(fù)制中單個(gè)脫氧核苷酸在DNA酶的作用下連接合成新的子鏈

()×解析

DNA酶包括DNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA內(nèi)切酶等，此處應(yīng)當(dāng)指DNA聚合酶。課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課堂練習(xí)填空題1.PCR儀加熱使（）變性,復(fù)性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料合成新鏈。2.PCR經(jīng)（）三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán)。DNA互補(bǔ)72℃Tap酶4種dNTP變性、復(fù)性、延伸課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段選擇題1.PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性取決于()A退火溫度B引物堿基組成和長(zhǎng)度C循環(huán)次數(shù)D.A+B+CD2.PCR實(shí)驗(yàn)的特異性主要取決于（）A.DNA聚合酶的種類B.反應(yīng)體系中模板DNA的量C.引物序列的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度D.四種dNTP的濃度C課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段簡(jiǎn)答題1.PCR反應(yīng)包括引物與DNA模板鏈間的解鏈與復(fù)性。討論循環(huán)溫度范圍對(duì)引物-DNA雙螺旋穩(wěn)定性的影響及對(duì)PCR產(chǎn)率的影響。答：由于GC對(duì)間是三個(gè)氫鍵的作用力，比兩個(gè)氫鍵作用力的AT對(duì)要穩(wěn)定，因此DNA的解鏈與退火都是依賴于G+C的含量與A+T的含量的比例。GC對(duì)普遍比AT對(duì)更傾向于非特異性的復(fù)性，所以GC含量高的引物比AT含量高的引物更適合于PCR反應(yīng)。課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2.你打算擴(kuò)增下圖所示的兩段序列之間的DNA，請(qǐng)從所列出引物中選出合適的一對(duì)，5’-GACCTGTGGAAGCCATACGGGATTG-3’3’-CTGGACACCTTCGGTATGCCCTAAC-5’引物1

引物25’-GACCTGTGGAAGC5’-CATACGGGATTG5’-CTGGACACCTTCG5’-GTATGCCCTAAC5’-CGAAGGTGTCCAG5’-GTTAGGGCATAC5’-GCTTCCACAGGTC5’-CAATCCCGTATG答：引物1：5’-GACCTGTGGAAGC

引物2：5’-CAATCCCGTATG課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段3.PCR的基本原理是什么？用PCR擴(kuò)增某一基因，必須預(yù)先得到什么樣的信息？答：（1）利用DNA半保留復(fù)制的原理，在體外進(jìn)行DNA的變性、復(fù)性和引物延伸。（2）至少要預(yù)先知道足夠合成一對(duì)引物的靶DNA序列。課題2-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段教學(xué)習(xí)題答案1.請(qǐng)繪圖表示PCR反應(yīng)的前三個(gè)循環(huán)步驟。假設(shè)在PCR反應(yīng)中，只有一個(gè)DNA片段作為膜拜，請(qǐng)計(jì)算在30次循環(huán)反應(yīng)后，反應(yīng)物中大約有多少個(gè)這