專題2課題1微生物實驗室培養(yǎng)

專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題1微生物的實驗室培養(yǎng)了解有關(guān)微生物及培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進行無菌技術(shù)的操作，進行微生物的培養(yǎng)。

一、課題目標：掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點和難點：三、技能目標：課題背景微生物研究和應(yīng)用的前提：如何獲得純凈培養(yǎng)物？防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物①提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件②確保其他微生物無法混入一、培養(yǎng)基作用、種類二、無菌技術(shù)三、制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基四、純化大腸桿菌主要內(nèi)容一基礎(chǔ)知識1.概念：

人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。2.類型：按物理性質(zhì)劃分：按化學(xué)成分劃分：按用途劃分：（一）培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有

無凝固劑瓊脂分離鑒定工業(yè)生產(chǎn)（1）按物理性質(zhì)劃分：天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基:（2）按化學(xué)成分劃分：按照需要的成分進行配置。（3）按用途劃分：選擇培養(yǎng)基:鑒別培養(yǎng)基:加入某種化學(xué)物質(zhì)，從眾多微生物中分離出所需微生物。加入某種試劑，鑒別不同種類的微生物。加入青霉素的培養(yǎng)基:不加氮源的無氮培養(yǎng)基:不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:幾種選擇培養(yǎng)基舉例：分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物唯一碳源為纖維素的培養(yǎng)基分解纖維素的細菌3.基本成分：碳源、氮源、水、無機鹽⑴碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無機氮源：有機氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含C、H、O、N的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源（二）無菌技術(shù)防止外來雜菌的污染.1.哪里需要無菌？2.如何控制無菌？無菌的意義：（1）實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。（2）培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。（3）為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行。（4）實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

1.無菌的范圍消毒:2、無菌技術(shù)的種類滅菌:

使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來殺死部分對人體有害的微生物。使用較為強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）?！挎撸涸谀承┘毦L的一定階段，細胞內(nèi)形成一個圓形、橢圓形或柱形的，抗逆性強的休眠體?！咦樱赫婢a(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的細胞，能直接發(fā)育成新個體。接種室內(nèi)空氣、接種箱、超凈工作臺用紫外線照射30min紫外線消毒實驗者的手臂、實驗臺等酒精、氯氣、石炭酸、煤酚皂溶液化學(xué)藥劑消毒牛奶等不宜高溫消毒滅菌的70～75℃,30min；80℃,15min巴氏消毒日常食物、罐裝食品100℃,5～6min煮沸消毒法適用范圍條件方法（1）消毒15～30min100kPa，121℃培養(yǎng)基、實驗器材高壓蒸汽滅菌1～2h干熱滅菌箱（160℃～170℃）耐高溫需干燥的物品（玻璃器皿等）干熱滅菌燒紅酒精燈火焰充分燃燒層灼燒接種的工具、試管口、瓶口灼燒滅菌滅菌時間所需條件適用對象滅菌方法灼燒滅菌干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋（2）滅菌請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手思考?大腸桿菌的純化培養(yǎng)：（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基二實驗操作（二）純化大腸桿菌1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g瓊脂20.0g1.計算：培養(yǎng)基用量依配方計算各成分的用量2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂、攪拌→補水定容4.調(diào)pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：加棉塞、包牛皮紙、橡皮筋勒緊（一）制備培養(yǎng)基培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌，培養(yǎng)皿干熱滅菌閱讀課本P17，思考與討論倒平板操作后面的四個問題。計算

稱量

溶化

調(diào)節(jié)pH

滅菌

倒平板（一）制備培養(yǎng)基1.將培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手撥出棉塞。12342.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。3.用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10～20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上皿蓋。4.等待平板冷卻凝固（約需5～

10min）。然后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：①防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染②避免培養(yǎng)基中水分過快蒸發(fā)。答：最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。防止空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24～48小時，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。5.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？單個或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：菌

落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細胞群體單個細胞單個菌落（二）純化大腸桿菌從混雜的微生物群體中獲得只含某一種微生物的過程。何為分離純化？如何純化？接種常見方法平板劃線法操作核心防止雜菌污染，保持培養(yǎng)物純度如何分散成單個細胞？稀釋涂布平板法斜面接種穿刺接種微生物群分散1.平板劃線法：分區(qū)劃線法連續(xù)劃線法（1）概念與原理：聚集的菌群連續(xù)劃線稀釋分散單個細胞菌落生長繁殖1.灼燒接種環(huán)，直至將接種環(huán)_______2.在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞3.試管口通過火焰.4.將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液6.將皿蓋打開一條縫隙，將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。5.試管通過火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五7.灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四區(qū)域內(nèi)劃線。末端燒紅8.將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)（1）為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時,仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？問題討論殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者接種結(jié)束后殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個細胞每次劃線前殺死接種環(huán)上原有微生物取菌種前目的灼燒時期（2）在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？

答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。（3）在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。3個劃線平板1個不劃線平板（重復(fù)實驗）（空白對照）（3）培養(yǎng)放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h2.稀釋涂布平板法①菌液的梯度稀釋：②涂布平板操作：(1)概念與原理：聚集的微生物單個細胞菌液梯度稀釋菌落涂布平板(2)操作：生長繁殖①系列梯度稀釋操作9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水9mL無菌水注意：移液管需要經(jīng)過滅菌；試管口和移液管離火焰1～2cm處。②涂布平板操作：(1)涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？答：應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如:①酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適②吸管頭不要接觸任何其他物體③吸管要在酒精燈火焰周圍等等問題討論各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h（3）培養(yǎng)1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？

未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？

如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。三、結(jié)果分析與評價3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實驗結(jié)果相同嗎？如果不同，請分析產(chǎn)生差異的原因？

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同。隨著時間的延長、菌落的不斷生長，使菌落不斷增大。4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請分析其可能的原因。

無菌操作未達到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過程中受到了污染。1.臨時保藏：試管固體斜面培養(yǎng)基上4℃2.長期保存：菌種易被污染、變異甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃四菌種的保存3～6個月，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)練習(xí)1.不能作為異養(yǎng)微生物碳源的是（）A．牛肉膏B．含碳有機物C．石油D．含碳無機物D2.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的主要差別是（）

A．碳源B．氮源

C．無機鹽D．生長因子A

3.通過選擇培養(yǎng)基可以從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物。在碳源為纖維素的培養(yǎng)基上，大部分微生物無法生長；在培養(yǎng)基中加入青霉素，可以抑制細菌和放線菌。利用上述方法能從混雜的微生物群體中分別分離出（）①大腸桿菌②霉菌③放線菌④纖維素分解菌

A.④②

B.①②

C.①③

D.③④

解析：選A。本題考查了微生物分離知識。纖維素分解菌可以利用纖維素，大部分微生物卻不能；培養(yǎng)基中加入青霉素可以抑制細菌和放線菌，但霉菌能夠生長。習(xí)題鞏固1.獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是

A、將用于微生物培養(yǎng)的器皿.接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌

B、接種純種細菌

C、適宜環(huán)境條件下培養(yǎng)

D、防止外來雜菌的入侵2.下列操作與無菌技術(shù)無關(guān)的是

A、接種前用肥皂洗雙手,再用酒精擦拭雙手

B、接種前用火焰燒灼接種針

C、培養(yǎng)在50℃左右時擱置斜面

D、在酒精燈的火焰旁完成3.外科手術(shù)器械和罐頭食品的處理,要以能夠殺死什么為標準

A、球菌B、桿菌C、螺旋菌D、芽孢DCD編號成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml4．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類是

。（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入

，用于培養(yǎng)

，

自養(yǎng)型微生物

含碳有機物

金黃色葡萄球菌

（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)

。（4）表中營養(yǎng)成分共有

類。（5）不論何