聚合酶鏈反應(yīng)

關(guān)于聚合酶鏈反應(yīng)2

一.概述聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR),又稱無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)，是一種特定DNA片段在體外快速擴(kuò)增的新方法。數(shù)小時(shí)達(dá)107-108倍1985年，Centus公司KaryMullis發(fā)明1993年因此獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)第2頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天3PCR擴(kuò)增儀第3頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天4變性5’3’5’3’3’5’3’5’引物復(fù)性3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2第4頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天5延伸3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2再變性第5頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天6再?gòu)?fù)性P1P1P2P2再延伸第6頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天7P1P1P2P2短片段以指數(shù)形式擴(kuò)增長(zhǎng)片段以線性形式擴(kuò)增最終主產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在P1-P2之間第7頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天8PCR循環(huán)的主要參數(shù)：1.預(yù)變性：92°C--95°C，2--5min2.變性：92°C--95°C，30s-1min3.復(fù)性：40°C--60°C，20s--2min4.延伸：70°C--75°C，30s--3min5.總延伸：72°C，7min第8頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天9三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第9頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天10PCR擴(kuò)增條件

94℃,5min

94℃,1min

30

55℃,1min

72℃,1min

72℃,7min第10頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天11第11頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天12DNAMarkerNGF←2000bp←1000bp←750bp←500bp←250bp←100bp第12頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天13第13頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天14第14頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天15第15頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天16三.PCR反應(yīng)體系緩沖液提供所需的pH環(huán)境DNA模板：欲擴(kuò)增的DNA樣品

dNTP：四種脫氧核苷酸MgCl2：提供Mg++離子引物：根據(jù)欲擴(kuò)增的DNA樣品設(shè)計(jì)耐熱的DNA聚合酶：來(lái)源于喜熱的細(xì)菌第16頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天17耐熱的DNA聚合酶Taq聚合酶喜溫性細(xì)菌ThermusaquaticusBM5→3聚合活性5→3外切活性

Pwo聚合酶

喜溫性細(xì)菌Pyrococcyswoesei5→3聚合活性3→5外切活性（校正）耐熱1000C2小時(shí)

Tth聚合酶

喜溫性細(xì)菌Thermusthermophilus5→3聚合活性當(dāng)錳離子存在時(shí)具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性

C.therm聚合酶

喜溫性細(xì)菌Thermusthermophilus3→5外切活性（校正）當(dāng)鎂離子存在時(shí)具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性第17頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天181.PCRbuffer:72C時(shí)，反應(yīng)體系的pH值下降1個(gè)單位，接近于7.2MgCl2－

濃度1－2mmol/L，過(guò)量引起非特異擴(kuò)增，不足使酶活性顯著降低，導(dǎo)致產(chǎn)物量少；2.三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）：是合成的原料，四種的濃度應(yīng)相等，濃度一般為50—200μmol／L。第18頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天193.引物：0.1-1umol/L高濃度－引物二聚體、非特異產(chǎn)物低濃度－產(chǎn)率低4.Taq酶：來(lái)自于水生棲熱菌（Thermusaquaticus),

最適反應(yīng)溫度為70—75oC。常用濃度為1—2.5U/100ul，濃度過(guò)高缺乏專一性，過(guò)低則產(chǎn)物產(chǎn)量低。第19頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天205.DNA樣品按照常用的分子生物學(xué)方法制備的DAN或RNA樣品，其純度應(yīng)能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。質(zhì)量100-500ng不含有蛋白酶、核酸酶、DNA結(jié)合酶、Taq酶抑制劑6.石蠟油減少反應(yīng)液的蒸發(fā)第20頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天21四.影響PCR的主要因素1.溫度參數(shù)：模板變性溫度--低溫不產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR不啟動(dòng)；超過(guò)95C，影響Taq酶活性退火溫度

溫度高--特異性強(qiáng)，引物與模板結(jié)合不

牢，DNA擴(kuò)增效率下降溫度低--產(chǎn)量高，特異性差

Ta=Tm-5=4(G+C)+2(A+T)-5

第21頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天22引物延伸溫度：取決于Taq酶最適溫度

70-75C

大于1Kb的DNA片段，1min以上，并加入明膠或BSA15-20%甘油有助于2.5KbDNA片段擴(kuò)增第22頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天23PCR擴(kuò)增平臺(tái)期循環(huán)到一定次數(shù)后，擴(kuò)增產(chǎn)物不再以指數(shù)關(guān)系增加，而是以線性關(guān)系增加或不增加，稱為平臺(tái)期。提前進(jìn)入平臺(tái)期的原因

1.引物量不足

2.dNTP量不足

3.Taq酶失活

4.原始模板數(shù)量太多第23頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天24循環(huán)次數(shù)：25-35次次數(shù)太多--核苷酸錯(cuò)配、非特異擴(kuò)增多進(jìn)入平臺(tái)期，增加次數(shù)效果不大次數(shù)太少--產(chǎn)率低第24頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天252.引物設(shè)計(jì)引物與待擴(kuò)增的DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。5’引物又稱上游引物，其核苷酸序列與模板5’序列相同。3’引物又稱下游引物，其核苷酸序列與模板3’序列互補(bǔ)。第25頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天26引物長(zhǎng)度人類基因組有30億bp，按照統(tǒng)計(jì)學(xué)的計(jì)算，隨機(jī)組合的17個(gè)堿基的核苷酸序列，在人類基因組中可能出現(xiàn)一次。 引物長(zhǎng)度一般為20-24個(gè)堿基。有時(shí)也見(jiàn)50甚至更多的堿基。第26頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天27引物組成： 堿基隨機(jī)分布，避免聚嘌呤或聚嘧啶的存 在，G、C含量一般在40-60%

引物內(nèi)部避免形成次級(jí)結(jié)構(gòu)如發(fā)卡結(jié)構(gòu) 兩個(gè)引物之間不應(yīng)互補(bǔ)，避免形成引物 二聚體第27頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天28兩條引物應(yīng)避免有同源序列，以免兩條引物競(jìng)爭(zhēng)模板的同一位點(diǎn)。引物5’端：

可加上酶切位點(diǎn)或熒光素等引物3’端：5-6個(gè)堿基與靶DNA嚴(yán)格配對(duì)第28頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天293’

‥‥TTCAAGCATCTCCAAGAGTTGGCATACGGTAAG‥‥5’

引物5’GTGAATTCTCTCAACCGTAT3’注：紅色部分為限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，堿基與 模版鏈不完全互補(bǔ)。第29頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天30逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR）

原理：提取組織細(xì)胞總RNA，以其中的mRNA為模板，采用需要的引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA作為模板，通過(guò)特異性引物，PCR擴(kuò)增目的基因。應(yīng)用：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；獲取目的基因；

合成cDNA探針；第30頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天31選取適當(dāng)?shù)慕M織，提取總RNA以mRNA做模版加入引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、合成cDNA的第一鏈逆轉(zhuǎn)錄酶水解mRNA鏈合成cDNA的第二鏈加入引物、Taq酶，做常規(guī)PCR擴(kuò)增出大量的cDNA分子第31頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天32RT-PCR操作需注意的問(wèn)題：

1.模版RNA應(yīng)嚴(yán)格純化，；

2.避免RNA酶污染；

3.所用與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的物品，需用0.1％的焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡處理。第32頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天33增效PCR（boosterPCR）當(dāng)擴(kuò)增少于1000拷貝的模板DNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問(wèn)題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴(kuò)增，而特異擴(kuò)增片段產(chǎn)量降低。對(duì)于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)PCR，此時(shí)由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少產(chǎn)物亦少。約經(jīng)15～20個(gè)循環(huán)后補(bǔ)充引物量，以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。第33頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天342.巢式PCR（nestPCR）此時(shí)也是進(jìn)行二步PCR，與上面不同的是，第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級(jí)PCR產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步PCR，這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。除了達(dá)到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。第34頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天35巢式PCR采用兩對(duì)引物進(jìn)行PCR，其中第二對(duì)引物位于第一對(duì)引物內(nèi)。P1上P1下P2上P2下P1上P2上第35頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天36FirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterest第36頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天37在同一PCR體系中加入數(shù)對(duì)PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。多重PCR常用來(lái)檢測(cè)同一基因的多個(gè)外顯子的缺失，或在檢測(cè)缺失設(shè)置內(nèi)對(duì)照。3、多重PCR

第37頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天38定量PCR測(cè)定靶基因的原始拷貝數(shù)目前常用Taqman法.該法的原理是:反應(yīng)底物中加入熒光探針,探針中的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)距離