聚合酶鏈反應

關于聚合酶鏈反應2

一.概述聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction,PCR),又稱無細胞克隆技術，是一種特定DNA片段在體外快速擴增的新方法。數(shù)小時達107-108倍1985年，Centus公司KaryMullis發(fā)明1993年因此獲諾貝爾化學獎第2頁,共42頁，2024年2月25日，星期天3PCR擴增儀第3頁,共42頁，2024年2月25日，星期天4變性5’3’5’3’3’5’3’5’引物復性3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2第4頁,共42頁，2024年2月25日，星期天5延伸3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2再變性第5頁,共42頁，2024年2月25日，星期天6再復性P1P1P2P2再延伸第6頁,共42頁，2024年2月25日，星期天7P1P1P2P2短片段以指數(shù)形式擴增長片段以線性形式擴增最終主產(chǎn)物片段長度在P1-P2之間第7頁,共42頁，2024年2月25日，星期天8PCR循環(huán)的主要參數(shù)：1.預變性：92°C--95°C，2--5min2.變性：92°C--95°C，30s-1min3.復性：40°C--60°C，20s--2min4.延伸：70°C--75°C，30s--3min5.總延伸：72°C，7min第8頁,共42頁，2024年2月25日，星期天9三、PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第9頁,共42頁，2024年2月25日，星期天10PCR擴增條件

94℃,5min

94℃,1min

30

55℃,1min

72℃,1min

72℃,7min第10頁,共42頁，2024年2月25日，星期天11第11頁,共42頁，2024年2月25日，星期天12DNAMarkerNGF←2000bp←1000bp←750bp←500bp←250bp←100bp第12頁,共42頁，2024年2月25日，星期天13第13頁,共42頁，2024年2月25日，星期天14第14頁,共42頁，2024年2月25日，星期天15第15頁,共42頁，2024年2月25日，星期天16三.PCR反應體系緩沖液提供所需的pH環(huán)境DNA模板：欲擴增的DNA樣品

dNTP：四種脫氧核苷酸MgCl2：提供Mg++離子引物：根據(jù)欲擴增的DNA樣品設計耐熱的DNA聚合酶：來源于喜熱的細菌第16頁,共42頁，2024年2月25日，星期天17耐熱的DNA聚合酶Taq聚合酶喜溫性細菌ThermusaquaticusBM5→3聚合活性5→3外切活性

Pwo聚合酶

喜溫性細菌Pyrococcyswoesei5→3聚合活性3→5外切活性（校正）耐熱1000C2小時

Tth聚合酶

喜溫性細菌Thermusthermophilus5→3聚合活性當錳離子存在時具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性

C.therm聚合酶

喜溫性細菌Thermusthermophilus3→5外切活性（校正）當鎂離子存在時具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性第17頁,共42頁，2024年2月25日，星期天181.PCRbuffer:72C時，反應體系的pH值下降1個單位，接近于7.2MgCl2－

濃度1－2mmol/L，過量引起非特異擴增，不足使酶活性顯著降低，導致產(chǎn)物量少；2.三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）：是合成的原料，四種的濃度應相等，濃度一般為50—200μmol／L。第18頁,共42頁，2024年2月25日，星期天193.引物：0.1-1umol/L高濃度－引物二聚體、非特異產(chǎn)物低濃度－產(chǎn)率低4.Taq酶：來自于水生棲熱菌（Thermusaquaticus),

最適反應溫度為70—75oC。常用濃度為1—2.5U/100ul，濃度過高缺乏專一性，過低則產(chǎn)物產(chǎn)量低。第19頁,共42頁，2024年2月25日，星期天205.DNA樣品按照常用的分子生物學方法制備的DAN或RNA樣品，其純度應能達到實驗要求。質(zhì)量100-500ng不含有蛋白酶、核酸酶、DNA結(jié)合酶、Taq酶抑制劑6.石蠟油減少反應液的蒸發(fā)第20頁,共42頁，2024年2月25日，星期天21四.影響PCR的主要因素1.溫度參數(shù)：模板變性溫度--低溫不產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR不啟動；超過95C，影響Taq酶活性退火溫度

溫度高--特異性強，引物與模板結(jié)合不

牢，DNA擴增效率下降溫度低--產(chǎn)量高，特異性差

Ta=Tm-5=4(G+C)+2(A+T)-5

第21頁,共42頁，2024年2月25日，星期天22引物延伸溫度：取決于Taq酶最適溫度

70-75C

大于1Kb的DNA片段，1min以上，并加入明膠或BSA15-20%甘油有助于2.5KbDNA片段擴增第22頁,共42頁，2024年2月25日，星期天23PCR擴增平臺期循環(huán)到一定次數(shù)后，擴增產(chǎn)物不再以指數(shù)關系增加，而是以線性關系增加或不增加，稱為平臺期。提前進入平臺期的原因

1.引物量不足

2.dNTP量不足

3.Taq酶失活

4.原始模板數(shù)量太多第23頁,共42頁，2024年2月25日，星期天24循環(huán)次數(shù)：25-35次次數(shù)太多--核苷酸錯配、非特異擴增多進入平臺期，增加次數(shù)效果不大次數(shù)太少--產(chǎn)率低第24頁,共42頁，2024年2月25日，星期天252.引物設計引物與待擴增的DNA序列互補的寡核苷酸片段。5’引物又稱上游引物，其核苷酸序列與模板5’序列相同。3’引物又稱下游引物，其核苷酸序列與模板3’序列互補。第25頁,共42頁，2024年2月25日，星期天26引物長度人類基因組有30億bp，按照統(tǒng)計學的計算，隨機組合的17個堿基的核苷酸序列，在人類基因組中可能出現(xiàn)一次。 引物長度一般為20-24個堿基。有時也見50甚至更多的堿基。第26頁,共42頁，2024年2月25日，星期天27引物組成： 堿基隨機分布，避免聚嘌呤或聚嘧啶的存 在，G、C含量一般在40-60%

引物內(nèi)部避免形成次級結(jié)構(gòu)如發(fā)卡結(jié)構(gòu) 兩個引物之間不應互補，避免形成引物 二聚體第27頁,共42頁，2024年2月25日，星期天28兩條引物應避免有同源序列，以免兩條引物競爭模板的同一位點。引物5’端：

可加上酶切位點或熒光素等引物3’端：5-6個堿基與靶DNA嚴格配對第28頁,共42頁，2024年2月25日，星期天293’

‥‥TTCAAGCATCTCCAAGAGTTGGCATACGGTAAG‥‥5’

引物5’GTGAATTCTCTCAACCGTAT3’注：紅色部分為限制性內(nèi)切酶切割位點，堿基與 模版鏈不完全互補。第29頁,共42頁，2024年2月25日，星期天30逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR）

原理：提取組織細胞總RNA，以其中的mRNA為模板，采用需要的引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA作為模板，通過特異性引物，PCR擴增目的基因。應用：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；獲取目的基因；

合成cDNA探針；第30頁,共42頁，2024年2月25日，星期天31選取適當?shù)慕M織，提取總RNA以mRNA做模版加入引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、合成cDNA的第一鏈逆轉(zhuǎn)錄酶水解mRNA鏈合成cDNA的第二鏈加入引物、Taq酶，做常規(guī)PCR擴增出大量的cDNA分子第31頁,共42頁，2024年2月25日，星期天32RT-PCR操作需注意的問題：

1.模版RNA應嚴格純化，；

2.避免RNA酶污染；

3.所用與實驗有關的物品，需用0.1％的焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡處理。第32頁,共42頁，2024年2月25日，星期天33增效PCR（boosterPCR）當擴增少于1000拷貝的模板DNA時會遇到兩個問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴增，而特異擴增片段產(chǎn)量降低。對于這種情況，可設置二步PCR，先用較低濃度的引物進行初級PCR，此時由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴增，只是由于引物少產(chǎn)物亦少。約經(jīng)15～20個循環(huán)后補充引物量，以初級PCR產(chǎn)物為模板進行擴增，靶序列的產(chǎn)量將相應增加。第33頁,共42頁，2024年2月25日，星期天342.巢式PCR（nestPCR）此時也是進行二步PCR，與上面不同的是，第二級PCR需另行設置反應體系，并應用另外的PCR引物，此時引物的位置位于初級PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級PCR產(chǎn)物做模板，進行第二步PCR，這樣只有初級PCR中特異的擴增片段才能被二級引物擴增。除了達到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。第34頁,共42頁，2024年2月25日，星期天35巢式PCR采用兩對引物進行PCR，其中第二對引物位于第一對引物內(nèi)。P1上P1下P2上P2下P1上P2上第35頁,共42頁，2024年2月25日，星期天36FirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterest第36頁,共42頁，2024年2月25日，星期天37在同一PCR體系中加入數(shù)對PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應體系可同時擴增多個DNA片段。多重PCR常用來檢測同一基因的多個外顯子的缺失，或在檢測缺失設置內(nèi)對照。3、多重PCR

第37頁,共42頁，2024年2月25日，星期天38定量PCR測定靶基因的原始拷貝數(shù)目前常用Taqman法.該法的原理是:反應底物中加入熒光探針,探針中的熒光基團與淬滅基團距離