分解纖維素的微生物的分離培

纖維素：棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物；纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸；分布植物的根、莖、葉中；第一頁，共三十三頁。1、在草食性動物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。2、農(nóng)作物秸稈：米秸、麥秸、稻草、草、木屑等富含大量的纖維素，被利用的機(jī)會很少、效率低；

纖維素生物燃料：

最有希望替代石油能源

科學(xué)家正致力于研究，怎樣將農(nóng)業(yè)廢棄物、木材及生長更為迅速的草本植物，轉(zhuǎn)化為種類繁多的生物燃料（甚至是航空燃油）。第二頁，共三十三頁。課題3分解纖維素的微生物的分離（一）纖維素與纖維素酶纖維素：一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，廣泛地存在于植物的根、莖、葉等器官中。纖維素酶：由微生物分泌的一種復(fù)合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它們的協(xié)同作用，最終將纖維素分解成葡萄糖。纖維素C1酶Cx酶纖維二糖葡萄糖苷酶葡萄糖第三頁，共三十三頁。①取二支20mL的試管實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn)②各加入一張濾紙條③各加入10mL0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液甲乙④在甲試管中加入1mL蒸餾水，乙試管加入1mL纖維素酶⑤將試管放在140r/min的搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失

討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？第四頁，共三十三頁。剛果紅染色法剛果紅能與像纖維素的多糖形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生該反應(yīng)。（二）纖維素分解菌的篩選用加入剛果紅的纖維素培養(yǎng)基去培養(yǎng)微生物時(shí)，如果培養(yǎng)基中出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈時(shí)，可說明該菌落是纖維素分解菌，因?yàn)樗褜⒈粍偣t染成紅色的纖維素分解了。第五頁，共三十三頁。一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

請你根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程圖和提供的三個(gè)資料以及“操作提示”，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一個(gè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布在鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上

篩選產(chǎn)生透明圈的菌落*第六頁，共三十三頁。①取樣環(huán)境1、土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境（樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等）操作步驟②討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。第七頁，共三十三頁。2、選擇培養(yǎng)

增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。

①目的：②制備選擇培養(yǎng)基③操作：P29

第八頁，共三十三頁。培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基組成提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、無機(jī)鹽KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g無機(jī)鹽酵母膏0.5g生長因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水第九頁，共三十三頁。提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即完全培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎猛耆囵B(yǎng)基做對照,或?qū)⒗w維素改為葡萄糖。A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）B、這個(gè)培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。C、你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對照實(shí)驗(yàn)，說明選擇培養(yǎng)基的作用第十頁，共三十三頁。說明：分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。但因酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。第十一頁，共三十三頁。

在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)該營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需微生物？第十二頁，共三十三頁。按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101～107倍。3.梯度稀釋101102103104105106第十三頁，共三十三頁。PPT內(nèi)容概述纖維素：。課題3分解纖維素的微生物的分離。實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn)。剛果紅能與像纖維素的多糖形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生該反應(yīng)。富含纖維素的環(huán)境（樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等）。增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基。是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）。有透明圈的基本是能分解纖維素的微生物。1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈。1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落。對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的________含量進(jìn)行定量測定。分解纖維素的微生物的分離?！敬鸢浮緾第十四頁，共三十三頁。4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上（1）制備鑒別培養(yǎng)基P29（2）涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)。第十五頁，共三十三頁。培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生長因子KH2PO40.25g無機(jī)鹽土豆汁100mL碳源、生長因子瓊脂15g凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉)第十六頁，共三十三頁。方法一：先

，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。方法二：在

時(shí)就加入剛果紅。培養(yǎng)微生物倒平板5.剛果紅染色法

挑選產(chǎn)生透明圈的菌落即為分解纖維素的菌落。第十七頁，共三十三頁。這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？染色法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)方法一方法二有透明圈的基本是能分解纖維素的微生物操作繁瑣剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜操作簡便不存在菌落混雜問題1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。第十八頁，共三十三頁。方法一中NaCl溶液的作用？思考：

漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能力就強(qiáng)！第十九頁，共三十三頁。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別培養(yǎng)基挑選菌落什么樣的環(huán)境取樣?①培養(yǎng)的目的?②選擇培養(yǎng)基的特點(diǎn)?挑選什么樣的菌落?①鑒別培養(yǎng)基特點(diǎn)?②如何鑒別?根據(jù)：微生物對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)環(huán)境中去找；增加纖維素分解菌濃度，確保能夠從樣品中分離到纖維素分解菌；液體培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基剛果紅染色法實(shí)驗(yàn)回顧挑選有透明圈的菌落第二十頁，共三十三頁。

在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。純化培養(yǎng)第二十一頁，共三十三頁。四、結(jié)果分析與評價(jià)

1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。

2.分離的結(jié)果是否一致

由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。第二十二頁，共三十三頁。

為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行_____________實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的發(fā)酵方法有______發(fā)酵和______發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的________含量進(jìn)行定量測定。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

液體

固體

葡萄糖

五、課題延伸第二十三頁，共三十三頁。思考：本實(shí)驗(yàn)課題2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？

課題2將土樣梯度稀釋液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基上，分離并統(tǒng)計(jì)菌落。本課題先選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再稀釋涂布在鑒別培養(yǎng)基上，挑選菌落。第二十四頁，共三十三頁。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別培養(yǎng)基挑選菌落什么樣的環(huán)境取樣?①培養(yǎng)的目的?②選擇培養(yǎng)基的特點(diǎn)?挑選什么樣的菌落?①鑒別培養(yǎng)基的特點(diǎn)?②如何鑒別?根據(jù)：微生物對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)環(huán)境中去找；目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物；剛果紅染色法第二十五頁，共三十三頁。分解纖維素的微生物的分離纖維素酶種類、作用、催化活力剛果紅染色篩選原理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤取樣選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)純化培養(yǎng)前置染色法后置染色法富含纖維素土壤增大分解菌含量染色鑒別分離出分解菌課堂總結(jié)第二十六頁，共三十三頁。第二十七頁，共三十三頁。第二十八頁，共三十三頁。DNA重組技術(shù)下列不屬于微生物的是()A．藍(lán)藻和蘑菇B．葫蘆蘚和鐵線蕨C．噬菌體和黃曲霉D．放線菌和變形蟲【解析】病毒、原核生物(例如細(xì)菌、放線菌、支原體、藍(lán)藻)、真核類的藻類和真菌及原生動物都是微生物。而一般多細(xì)胞的植物與動物不屬于微生物，如葫蘆蘚是苔蘚植物，鐵線蕨是蕨類植物，都屬于多細(xì)胞高等植物?！敬鸢浮緽第二十九頁，共三十三頁。微生物營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（）A．是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源B．凡碳源都提供能量C．除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽D．無機(jī)氮源也能提供能量【解析】不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況具體分析。對于A、B選項(xiàng)，它的表述是不完整的。有的碳源只能是碳源，如CO2；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，還是能源，如蛋白胨。對于C選項(xiàng)，除水以外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如CO2可作自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3可作自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對于D選項(xiàng)，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源?！敬鸢浮緿第三十頁，共三十三頁。微生物與病毒的關(guān)系關(guān)于病毒增殖的敘述中，正確的是（）A．病毒侵入宿主細(xì)胞后，合成一種蛋白質(zhì)B．病毒的繁殖只在宿主的活細(xì)胞中進(jìn)行C．病毒的繁殖以核衣殼為單位D．在普通的培養(yǎng)基上能培養(yǎng)病毒【解析】解答此題需從以下幾方面入手分析：首先，病毒是營寄生方式生活，必須生活在活的細(xì)胞內(nèi)，不能獨(dú)立生活，所以在普通的培養(yǎng)基上不能生活。第二，繁殖時(shí)，病毒的核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞，利用宿主的成分合成子代個(gè)體，除了核衣殼，還應(yīng)包括該病毒的其他結(jié)構(gòu)。合成的蛋白質(zhì)不只是一種，應(yīng)該是多種，包括多種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)及物質(zhì)合成時(shí)所需的多種酶?！敬鸢浮緽第三十一頁，共三十三頁。培養(yǎng)基的種類要從多種細(xì)菌中分離某種細(xì)菌，培養(yǎng)基要用（）A．加入青霉素的培養(yǎng)基B．加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基C．固體培養(yǎng)基D．液體培養(yǎng)基【解析】微生物的分離需使用固體培養(yǎng)基，由于某種細(xì)菌的種類不明，所以難