牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）

牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）I牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）范圍本文件規(guī)定了牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）的試劑及儀器、檢測(cè)方法、質(zhì)量控制和結(jié)果判定等。本文件適用于牛結(jié)核病診斷。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18645動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T32945牛結(jié)核病診斷體外檢測(cè)γ干擾素法術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有特別需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。原理感染牛分枝桿菌的牛，其T淋巴細(xì)胞已被牛分枝桿菌致敏并產(chǎn)生免疫記憶。當(dāng)體外再次遇到牛分枝桿菌特異性抗原（結(jié)核菌素）刺激時(shí)，牛外周血中淋巴細(xì)胞被激活并大量釋放γ-干擾素，而未被感染的牛則不會(huì)分泌或低水平分泌γ-干擾素。通過(guò)雙單克隆抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)特異性γ-干擾素濃度水平，即可診斷牛結(jié)核病。試劑及儀器5.1試劑外周抗凝血培養(yǎng)所需材料參見(jiàn)附錄A。夾心ELISA所需試劑和材料參見(jiàn)附錄B。5.2儀器檢測(cè)所需儀器參見(jiàn)附錄C。檢測(cè)方法6.1試劑配制檢測(cè)所需試劑的配制見(jiàn)附錄D。6.2樣品采集與處理6.2.1無(wú)菌采集牛尾靜脈血3mL～4mL，加入至含肝素鋰或肝素鈉的抗凝血真空管中，輕輕顛倒2次～3次使血液和抗凝劑混合均勻。室溫（22±5℃）運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室并在采血后24h內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。6.2.2分裝前輕輕顛倒抗凝血真空管，充分混勻血液樣品。將抗凝血無(wú)菌加入至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每頭牛抗凝血分裝3孔，1.0mL/孔（可參考表1）。6.2.3在每頭牛的3孔抗凝血樣品中，分別無(wú)菌加入67μLPBS、67μL禽型PPD溶液和67μL牛型PPD溶液（可參考表1），用微量振蕩器低速充分振蕩，使刺激抗原與抗凝血完全混合。6.2.4蓋上細(xì)胞培養(yǎng)板蓋，避免液體揮發(fā)。將含有抗凝血和刺激抗原的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃濕溫培養(yǎng)箱中孵育16h～24h。6.2.5使用移液器小心吸取上層血漿200μL～300μL，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。吸取血漿時(shí)應(yīng)盡量避免吸入紅細(xì)胞。表1.抗凝血樣品和刺激原加入到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板（豎排放置）動(dòng)物1PBSA1禽型PPDA2牛型PPDA3PBSA4禽型PPDA5牛型PPDA6動(dòng)物2動(dòng)物3PBSB1禽型PPDB2牛型PPDB3PBSB4禽型PPDB5牛型PPDB6動(dòng)物4動(dòng)物5PBSC1禽型PPDC2牛型PPDC3PBSC4禽型PPDC5牛型PPDC6動(dòng)物6動(dòng)物7PBSD1禽型PPDD2牛型PPDD3PBSD4禽型PPDD5牛型PPDD6動(dòng)物8動(dòng)物9PBSE1禽型PPDE2牛型PPDE3PBSE4禽型PPDE5牛型PPDE6動(dòng)物10動(dòng)物11PBSF1禽型PPDF2牛型PPDF3PBSF4禽型PPDF5牛型PPDF6動(dòng)物12動(dòng)物13PBSG1禽型PPDG2牛型PPDG3PBSG4禽型PPDG5牛型PPDG6動(dòng)物14動(dòng)物15PBSH1禽型PPDH2牛型PPDH3PBSH4禽型PPDH5牛型PPDH6動(dòng)物166.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)6.3.1溶解陽(yáng)性、陰性對(duì)照凍干粉，配制1×PBST洗滌液，按“操作注意事項(xiàng)”平衡其他試劑。6.3.2取商品化已包被有γ-干擾素單克隆抗體的酶標(biāo)板（根據(jù)樣品多少，可拆開(kāi)分次使用），先加入50μL樣品稀釋液至各孔中，再加入50μL血漿樣品及陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照至各孔中，輕輕振勻孔中樣品，貼上封板膜，37℃孵育2h。6.3.3棄去孔內(nèi)液體。使用1×PBST洗滌液洗板5次，300μL/孔。每次靜置1min后棄洗滌液，洗滌完畢后在吸水紙上拍干。6.3.4用酶標(biāo)抗體稀釋液按1：100稀釋酶標(biāo)抗體（現(xiàn)配現(xiàn)用）。在每孔中加入100μL新鮮配制的酶標(biāo)抗體，貼上封板膜，37℃孵育2h。6.3.5使用1×PBST洗滌液洗板5次，300μL/孔。每次靜置1min后棄洗滌液，洗滌完畢后在吸水紙上拍干。6.3.6每孔加入100μL底物顯色液，貼上封板膜，37℃避光顯色10min。6.3.7按照加入底物顯色液的順序和時(shí)間間隔每孔加入50μL終止液，15min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450nm。6.4操作注意事項(xiàng)6.4.1由于本試驗(yàn)需要活的淋巴細(xì)胞，因此需要使細(xì)胞損傷降至最低。任何情況下不應(yīng)將抗凝血貯存于冰箱中。6.4.2刺激后的血漿樣品如不直接進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，血漿可在2℃～8℃貯存7天，在-20℃可貯存6個(gè)月。貯存前，每個(gè)貯存管必須用合適的蓋子密封。應(yīng)在樣品架上標(biāo)記日期、操作者的首字母、管內(nèi)容物、動(dòng)物編號(hào)和牛群細(xì)節(jié)等相關(guān)信息。檢測(cè)前，樣品應(yīng)恢復(fù)至室溫并充分混勻。6.4.3除酶標(biāo)抗體外，試劑盒使用前各組份應(yīng)平衡至室溫，使用后即放回2℃～8℃。6.4.4不同批號(hào)試劑盒的試劑組分不得混用，使用過(guò)程中各試劑組份應(yīng)避免交叉污染。6.4.5底物顯色液避免暴露于強(qiáng)光和接觸氧化劑。6.4.6終止液中含有H2SO4，使用時(shí)注意不要接觸到身體和衣物。6.4.7抗體包被酶標(biāo)板拆封后應(yīng)避免受潮或沾水（每次將剩余的抗體包被酶標(biāo)板用封口袋扎緊后盡快置于2℃~8℃）。6.4.8陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照凍干粉用滅菌純水稀釋并使用后，盡快置于2℃～8℃保存。6.4.9待檢血漿樣品數(shù)量較多時(shí)，可先使用樣品稀釋液稀釋完所有待檢血漿，再將稀釋好的血漿轉(zhuǎn)移到反應(yīng)板，保證反應(yīng)時(shí)間一致。6.4.10嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行，操作過(guò)程中移液、定時(shí)和洗滌等過(guò)程應(yīng)精確。7質(zhì)量控制在判定結(jié)果前必須檢查對(duì)照樣品的結(jié)果，確定陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的OD450nm值在規(guī)定范圍之內(nèi)：陰性對(duì)照OD450nm值范圍為0.0~0.15。陽(yáng)性對(duì)照OD450nm值范圍為0.7~3.0。如果有一條標(biāo)準(zhǔn)不符合，試驗(yàn)是無(wú)效的，應(yīng)重新進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判定8.1計(jì)算每個(gè)樣品PBS刺激組、禽型PPD刺激組和牛型PPD刺激組的OD450nm值。如果做重復(fù)孔，應(yīng)計(jì)算每頭牛所有樣品PBS刺激組、禽型PPD刺激組和牛型PPD刺激組的平均OD450nm值。8.2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：牛型PPD刺激組OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值≥0.1且牛型PPD刺激組OD450nm值-禽型PPD刺激組OD450nm值≥0.1。陰性判定標(biāo)準(zhǔn)：牛型PPD刺激組OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值＜0.1，或牛型PPD刺激組OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值≥0.1且牛型PPD刺激組OD450nm值-禽型PPD刺激組OD450nm值＜0.1。安全措施按照GB/T18645和GB19489執(zhí)行。

附錄A（資料性）外周抗凝血培養(yǎng)所需材料A.1肝素鋰或肝素鈉真空抗凝管；A.25mL或10mL動(dòng)物采血器；A.3無(wú)菌48孔細(xì)胞培養(yǎng)板；A.4牛型PPD溶液（2.5mL/瓶）；A.5禽型PPD溶液（2.5mL/瓶）；A.6100μL、1000μL槍頭；A.7用于貯存血漿的1.5mL離心管；A.896孔板架。

附錄B（資料性）夾心ELISA所需試劑和材料B.1酶標(biāo)板（包被牛γ-干擾素單克隆抗體，含0.1%ProClin300）；B.2牛γ-干擾素陽(yáng)性對(duì)照凍干粉（含0.1%ProClin300）；B.3牛γ-干擾素陰性對(duì)照凍干粉（含0.1%ProClin300）；B.4樣品稀釋液（血漿稀釋緩沖液，含0.1%ProClin300）；B.5PBST洗滌液（20×）（含0.1%ProClin300）；B.6酶標(biāo)抗體（含0.1%ProClin300）；B.7酶標(biāo)抗體稀釋液（含0.01%的硫柳汞）；B.8底物顯色液（TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）溶液）；B.9終止液（0.5MH2SO4）；B.10滅菌純水（用于溶解陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照凍干粉）；B.11蒸餾水（用于稀釋洗液）；B.12酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)所需的試劑、反應(yīng)槽、封板膜和槍頭。

附錄C（資料性）檢測(cè)所需儀器C.137℃濕溫培養(yǎng)箱；C.2精密可調(diào)移液器（100μL、1000μL）；C.31mL、5mL、10mL的移液器；C.4100mL、1L、2L的量筒；C.512道移液器（50μL～300μL）；C.6微量振蕩器（可選）；C.7洗板機(jī)（可選）；C.837℃水浴鍋；C.9酶標(biāo)儀（含450nm濾光片）。

附錄D（規(guī)范性）檢測(cè)所用試劑的配制D.1刺激抗原牛型PPD溶液（10000IU/mL）和禽型PPD溶液（7500IU/mL）在使用前徹底混勻，2.5mL/瓶。D.2酶標(biāo)板在開(kāi)封前將酶標(biāo)板恢復(fù)至室溫，可放置30min以上。D.3陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照用0.2mL滅菌純水分別溶解陰、陽(yáng)性對(duì)照凍干粉。應(yīng)保證完全溶解，溶解的陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照在2℃～8℃可儲(chǔ)存1個(gè)月，但再次使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫并充分混勻。D.4樣品稀釋液恢復(fù)至室溫并充分混勻，用作血漿稀釋緩沖液。D.5酶標(biāo)抗體和酶標(biāo)抗體稀釋液酶標(biāo)抗體必須一直保存于2℃～8℃。酶標(biāo)抗體稀釋液可直接使用。按表2配制酶標(biāo)抗體工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，未用完的試劑應(yīng)立即丟棄。未用完的酶標(biāo)抗體