真核生物的基因調(diào)控

關(guān)于真核生物的基因調(diào)控一真核細胞的基因結(jié)構(gòu)真核細胞與原核細胞在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及DNA的空間結(jié)構(gòu)方面存在很大的差異，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：

1在真核細胞中，一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈，即基因以多順反子的形式存在。

2真核細胞DNA與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只有一小部分DNA是裸露的。第2頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3真核細胞中有一部分由幾個或幾十個堿基組成的DNA序列，在整個基因組中重復(fù)幾百次甚至上百萬次。高等真核細胞DNA中很大部分是不轉(zhuǎn)錄的。大部分真核細胞的基因中存在不被翻譯的內(nèi)含子。

4真核生物能夠有序地根據(jù)生長發(fā)育階段的需要進行DNA片斷的重排，在需要時，可增加細胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。第3頁,共89頁，2024年2月25日，星期天5真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)較大，它們可能遠離啟動子達幾百個甚至上千個堿基對，它主要是通過改變整個所控制基因5ˊ上游區(qū)DNA構(gòu)型來影響它與RNA聚合酶的結(jié)合能力。

6真核生物的RNA在細胞核中合成，只有穿過細胞膜，到達細胞質(zhì)后，才能被翻譯成蛋白質(zhì)。

7許多真核細胞的基因需經(jīng)過復(fù)雜的成熟和剪接過程（maturationandsplicing）才能順利地翻譯成蛋白質(zhì)。第4頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共89頁，2024年2月25日，星期天二基因家族(genefamily)原核細胞中，整個體系置于一個啟動子控制之下。由于真核細胞的DNA都是單順反子，許多相關(guān)的基因常常按功能成套組合，一套基因就是一個基因家族。家族中各成員的表達水平和酶活性可以很不相同，但通常是密切相關(guān)的。通常分為簡單多基因家族、復(fù)雜多基因家族和發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜多基因家族。第8頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1簡單多基因家族：指在家族中有一個或數(shù)個基因以串聯(lián)方式重復(fù)排列。如編碼ssrRNA的基因家族，其中每個ssrRNA基因都被規(guī)模宏大的間隔序列所分開。間隔序列的長度約為ssrRNA長度的2—6倍，并含有中等重復(fù)序列，每個ssrRNA基因都被單獨轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生獨立于其它部分的RNA分子，經(jīng)加工為成熟的ssrRNA。第9頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2復(fù)雜多基因家族：一般由幾個相關(guān)基因家族構(gòu)成，基因家族之間由間隔序列隔開，并作為獨立的轉(zhuǎn)錄單位。如：海膽的組Pr基因家族。第10頁,共89頁，2024年2月25日，星期天

組蛋白（海膽）

組蛋白（果蠅）第11頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜多基因家族

在生物體發(fā)育的不同階段，復(fù)雜多基因家族中的基因結(jié)構(gòu)和數(shù)量，會發(fā)生變化的情況，基因之間存在著具有調(diào)節(jié)功能的重復(fù)序列。在每個基因家族中，基因排列的順序就是它們在發(fā)育階段的表達順序。如人類的血紅蛋白，在母體懷孕后的不同時期出現(xiàn)不同的亞基和數(shù)量變化。第12頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共89頁，2024年2月25日，星期天三真核基因的斷裂結(jié)構(gòu)1外顯子和內(nèi)含子：現(xiàn)已查明，大多數(shù)真核基因都是由Pr編碼序列和非Pr編碼序列組成。編碼序列稱為外顯子（exon），非編碼序列稱為內(nèi)含子（intron）。在一個結(jié)構(gòu)基因中，編碼某一Pr不同區(qū)域的各個外顯子并不連續(xù)地排列在一起，而常常被長度不等的內(nèi)含子所隔離，形成鑲嵌排列的斷裂方式，所以真核基因有時稱為斷裂基因(interruptedgene)。只有真核基因具有切除基因中內(nèi)含子，產(chǎn)生功能型mRNA和Pr的能力，原核生物不具有此種特性。第14頁,共89頁，2024年2月25日，星期天觀察研究外顯子和內(nèi)含子的方法：

1.電子顯微鏡：將成熟mRNA分子和相應(yīng)的染色體DNA進行分子雜交，形成DNA-RNA異源雙鏈分子（heterdaplexes）,在電鏡下可觀察到部分單鏈DNA區(qū)段從異源雙鏈分子上呈環(huán)狀突起，表示這序列在成熟mRNA分子上已被切除，為內(nèi)含子。第15頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2.用S1核酸酶處理異源雙鏈分子：

S1核酸酶能專一降解未配對的單鏈核苷酸，基因組DNA中只有與成熟mRNA鏈相對應(yīng)的片斷，由于形成異源雜合體而得以保留。這些保留下來的DNA片斷就是外顯子。根據(jù)對全序列的分析，它們的大小和在DNA鏈上的特定位置都能被精確地測定。第16頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3限制性內(nèi)切酶切圖譜分析：采用幾種不同的限制性內(nèi)切酶，綜合分析DNA的酶切圖譜和成熟mRNA分子一的酶切位點的分布，就可確定內(nèi)含子的大小及其在基因中與外顯子的排列方式。第17頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2外顯子與內(nèi)含子的可變性：在基因轉(zhuǎn)錄、加工產(chǎn)生成熟mRNA分子時，內(nèi)含子通過剪接加工被去除，保留在成熟mRNA分子中的外顯子被拼接在一起，最終被翻譯成蛋白質(zhì)。因此，通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用，由成熟mRNA產(chǎn)生的cDNA分子中，只含有外顯子，沒有內(nèi)含子。第18頁,共89頁，2024年2月25日，星期天外顯子和內(nèi)含子的關(guān)系并不是完全固定不變的，有時會出現(xiàn)這樣的情況：在同一條DNA鏈上的某一段DNA序列，它作為編碼茉一條多肽鏈基因的一部分時是外顯子，但作為編碼另一條多肽鏈基因的一部分時，則成了內(nèi)含子，這是由于mRNA剪接加工的方式不同造成的。其結(jié)果是同一段DNA序列加工生成了兩條或兩條以上的mRNA鏈。第19頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3外顯子與內(nèi)含子的連接區(qū)：真核基因斷裂結(jié)構(gòu)的另一個重要特點是外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)（exon-intronjunction）的高度保守性和特異性堿基序列。外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)就是指外顯子和內(nèi)含子的交界，又稱邊界序列。有兩個重要特征：第20頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1.內(nèi)含子的兩端序列之間沒有廣泛的同源性，因此內(nèi)含子兩端序列不能互補，即上游序列和下游序列不可能通過堿基配對形成發(fā)卡式二級結(jié)構(gòu)。

2.外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)很短，但卻高度保守（consensussequence），它是RNA剪接的信號序列。第21頁,共89頁，2024年2月25日，星期天序列分析表明：幾乎每個內(nèi)含子5ˊ端起始的兩個堿基都是GT，3ˊ端最后兩個堿基總是AG，由于這兩個堿基的高度保守性和存在的廣泛性，將其稱為GT-AG法則，即5ˊGT…AG3ˊ。第22頁,共89頁，2024年2月25日，星期天四真核生物DNA水平的調(diào)控1基因丟失：某些原生動物、昆蟲及甲殼綱動物細胞分化過程中發(fā)現(xiàn)有部分染色體丟失的現(xiàn)象。這種方式僅存在于進化程度較低的生物中，如馬蛔蟲。

2基因擴增：指某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象，它使得細胞在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的基因產(chǎn)物以滿足生長發(fā)育的需要。是基因活性調(diào)控的一種方式。第23頁,共89頁，2024年2月25日，星期天如：非洲爪蟾的卵母細胞中原有rRNA（rDNA）基因約500個拷貝，在減數(shù)分裂Ⅰ的粗線期內(nèi)，這個基因開始迅速復(fù)制，到雙線期，其copy數(shù)達200萬個，增加近4000倍，可用來合成1012個rRNA，以滿足卵裂期間和胚胎期間合成大量Pr的需要。第24頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3.基因重排與變換：一個基因可以通過從遠離其啟動子的地方移到距它很近的位點而被啟動轉(zhuǎn)錄，這種方式稱基因重排。典型的例子是小鼠免疫球Pr結(jié)構(gòu)基因的表達，免疫球Pr肽鏈主要由可變區(qū)、恒定區(qū)及兩者之間的連接區(qū)組成，在未分化的細胞中（胚胎細胞中）三者相距較遠。當(dāng)淋巴細胞發(fā)育分化時，能通過染色體內(nèi)的重組，把三個遠離的基因緊密地連接在一起，從而產(chǎn)生免疫球Pr。第25頁,共89頁，2024年2月25日，星期天

基因的重排與變換

一個基因可以通過從遠離其啟動子的地方移到距它很近的位點而被啟動轉(zhuǎn)錄，這種方式稱為重排。通過基因重排調(diào)節(jié)基因活性的典型例子是小鼠免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基因的表達。

VDJCμCα

E未分化細胞

VDJCμCα

E

產(chǎn)生Cμ細胞VDJCαE產(chǎn)生Cμ細胞

類型轉(zhuǎn)換

免疫球蛋白中連基因的組織特一行表達與基因重排

V.可變區(qū);D.多態(tài)區(qū);J.結(jié)合區(qū)

第26頁,共89頁，2024年2月25日，星期天五順式作用元件與基因調(diào)控1染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)錄的影響：轉(zhuǎn)錄發(fā)生之前，染色質(zhì)常常會在特定的區(qū)域被解旋或松馳，形成自由DNA。這種變化包括核小體結(jié)構(gòu)的消除或改變，DNA本身局部結(jié)構(gòu)的變化如雙螺旋的局部超旋或松馳，DNA從B-DNA變?yōu)閆-DNA等。這些變化導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因暴露，促進轉(zhuǎn)錄因子與啟動區(qū)DNA的結(jié)合，從而導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄。第27頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1、染色體水平的調(diào)控

A、染色體結(jié)構(gòu)的改變Tu1Tu2

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化影響基因轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)去超螺旋基因轉(zhuǎn)錄

真核基因的活躍轉(zhuǎn)錄是在常染色質(zhì)上進行的。轉(zhuǎn)錄發(fā)生之前，染色質(zhì)常常會在特定的區(qū)域被解旋或松弛，形成自由DNA。這種變化可能包括核小體結(jié)構(gòu)的消除或改變，DNA本身局部結(jié)構(gòu)的變化，如雙螺旋的局部超旋或松弛，DNA從右旋型變?yōu)樽笮停╖-DNA）等。這些變化可導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因暴露，促進轉(zhuǎn)錄因子與啟動區(qū)DNA的結(jié)合，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄。多線染色體第28頁,共89頁，2024年2月25日，星期天活躍表達的基因所在的染色質(zhì)上含有對DNaseⅠ的超敏感位點(hypersensitivesite)，即率先降解位點。每個活躍表達基因都有一個或數(shù)個超敏感位點，大多位于基因5ˊ端啟動區(qū)。每個超敏感位點是一段長約100-200bp的DNA序列。非活躍基因的5ˊ端相應(yīng)位點不表現(xiàn)對DNaseⅠ的超敏感性。第29頁,共89頁，2024年2月25日，星期天

3啟動子及其對轉(zhuǎn)錄的影響：真核生物基因轉(zhuǎn)錄的起始位點具有“帽子”結(jié)構(gòu)專一性，而且只有嘌呤（以腺嘌呤為主）才能起始轉(zhuǎn)錄。調(diào)控區(qū)較大，除具有結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ的CAAT區(qū)之外，大多數(shù)基因還擁有GC區(qū)和增強子。第30頁,共89頁，2024年2月25日，星期天幾乎所有真核基因3ˊ端都存在一個poly（A）位點，該位點上游15-30bp處的保守序列AATAAA對于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準確切割及加poly（A）是必需的，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的終止是AATAAA和終止區(qū)之間相互作用的結(jié)果。新生RNA在poly（A）位點的準確剪切加工則通過AATAAA區(qū)和poly（A）位點周圍序列的相互作用來達到。第31頁,共89頁，2024年2月25日，星期天真核生物的啟動子：所謂啟動子是指確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地啟始的DNA序列。真核基因啟動子在由RNA聚合酶Ⅱ催化轉(zhuǎn)錄的DNA序列5ˊ上游區(qū)富含TA的保守序列，該序列前4個堿基為TATA，所以稱為TATA框（TATAbox，或TATA區(qū)）。TATA區(qū)的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始；CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，不參與起始位點的確定。第32頁,共89頁，2024年2月25日，星期天現(xiàn)在認為啟動子-25～-35區(qū)含有TATA序列，在-70～-80區(qū)有CCAAT序列（CAATbox），在-80～-110區(qū)含有GCCACACCC或GGGCGGG（GCbox）。習(xí)慣上將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動子元件（upstreampromoterelement,UPF）或稱上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）。第33頁,共89頁，2024年2月25日，星期天Sequenceelementswithinatypicaleukaryoticgene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301

basedonthethymidinekinasegene

octamertranscriptionelementpromoterTATAbox(TATAAAA)

locatedapproximately25-30bpupstreamofthe+1startsite

determinestheexactstartsite(notinallpromoters)bindstheTATAbindingprotein(TBP)whichisasubunitofTFIIDGCbox(CCGCCC)

bindsSp1(Specificityfactor1)

CAATbox(GGCCAATCT)

bindsCTF(CAATboxtranscriptionfactor)

Octamer(ATTTGCAT)

bindsOTF(Octamertranscriptionfactor)+1ATTTGCAT第34頁,共89頁，2024年2月25日，星期天RNA聚合酶II啟動子

第35頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2增強子及其對轉(zhuǎn)錄的影響：增強子是指能使和它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列。目前在病毒、植物、動物和人類正常細胞中都發(fā)現(xiàn)有增強子存在，是基因表達的重要調(diào)控元件。通常具有下列性質(zhì)：

a增強效應(yīng)十分明顯，一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10—200倍，有的可增加上千倍。第37頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共89頁，2024年2月25日，星期天B.增強效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)，不論增強子以什么方向排列（5ˊ→3ˊ或3ˊ→5ˊ），甚至和基因相距3000bp，或在基因的下游，均表現(xiàn)出增強效應(yīng)。c.大多為重復(fù)序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結(jié)合。其內(nèi)部常含有一個核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），該序列是在另一個基因附近產(chǎn)生增強效應(yīng)時所必需的。第39頁,共89頁，2024年2月25日，星期天d.其增強效應(yīng)有嚴密的組織和細胞特異性，說明只有特定的Pr（轉(zhuǎn)錄因子）參與才能發(fā)揮功能。

e.沒有基因?qū)Ｒ恍?，可在不同的基因組合上表現(xiàn)出增強效應(yīng)。

f.許多增強子還受外部信號的調(diào)控，如金屬硫蛋白的基因啟動區(qū)上游所帶的增強子，就可以對環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反應(yīng)。第40頁,共89頁，2024年2月25日，星期天六反式作用因子對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控

反式作用因子也稱轉(zhuǎn)錄因子，基因的所有順式作用元件都要和相應(yīng)的反式作用因子結(jié)合，并通過Pr之間的相互作用才能實現(xiàn)它們對基因的調(diào)控。順式作用元件和反式作用因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，根據(jù)各個Pr成分在轉(zhuǎn)錄中的作用，能將整個復(fù)合體分為3部分第41頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1.參與所有或某些轉(zhuǎn)錄階段的RNA聚合酶亞基，不具有基因特異性。

2.與轉(zhuǎn)錄的起始或終止有關(guān)的輔助因子，也不具有基因特異性。

3.與特異調(diào)控序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，具基因特異性，如TATA區(qū)。第42頁,共89頁，2024年2月25日，星期天特異轉(zhuǎn)錄因子對基因表達的調(diào)控是大量的、廣泛存在和高度有序的，主要有兩種形式：

1)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成過程受到控制。

2)通過專一因子的結(jié)合，提高RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄活性。第43頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1CAAT區(qū)結(jié)合蛋白CTF/NF1：

CTF和NF1是CAAT區(qū)的結(jié)合蛋白，是腺病毒復(fù)制所必需的。CTF/NF1是一組具雙重功能的蛋白質(zhì)，它們與CTTA區(qū)相結(jié)合，參與促進RNA聚合聚合酶Ⅱ指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄起始過程；當(dāng)它們與其它相似于CAAT區(qū)的DNA序列相結(jié)合，則有利于起始DNA的復(fù)制。第44頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2TATA和GC區(qū)結(jié)合蛋白：

TATA和GC區(qū)結(jié)合蛋白主要是RNA聚合酶Ⅱ起始一般基因轉(zhuǎn)錄所必需的4種Pr因子，有TFⅡD、TFⅡA、TFⅡB、TFⅡE。

TFⅡD：與TATA區(qū)相結(jié)合。

TFⅡA：參與TFⅡD和TATA區(qū)的結(jié)合。

TFⅡB：幫助RNA聚合酶Ⅱ與啟動區(qū)結(jié)合。

TFⅡE：幫助RNA聚合酶起始基因轉(zhuǎn)錄。第45頁,共89頁，2024年2月25日，星期天表

RNA聚合酶Ⅱ的基本轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子分子量(kD)功能TBP30與TATA盒結(jié)合TFⅡ-B33介導(dǎo)RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合TFⅡ-F30,74解旋酶TFⅡ-E34,37ATP酶TFⅡ-H62,89解旋酶TFⅡ-A12,19,35穩(wěn)定TFⅡ-D的結(jié)合TFⅡ-I120促進TFⅡ-D的結(jié)合第46頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第47頁,共89頁，2024年2月25日，星期天PhosphorylationofthepolymeraseCTDbyTFIIHFormationofaprocessiveRNApolymerasecomplexandallowstheRNAPoltoleavethepromoterregion.Back第48頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3RNA聚合酶Ⅲ及其下游啟動區(qū)結(jié)合蛋白：

RNA聚合酶Ⅲ主要結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點的下游50bp以上區(qū)，有許多輔助因子參與RNA聚合酶Ⅲ對不同啟動區(qū)的識別和結(jié)合，如轉(zhuǎn)錄因子TFⅢA參與該酶對非洲爪蟾5SrRNA的轉(zhuǎn)錄。第49頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共89頁，2024年2月25日，星期天TFⅢA具鋅指結(jié)構(gòu)域（鋅指區(qū)Zincfingerregion）:TFⅢA蛋白有9個相似的重復(fù)單位，每個單位大約由30個AA殘基組成，每個單位中有一對固定位點的半胱氨酸殘基，一對固定的組AA殘基，它們和Zn離子絡(luò)合，使中間的AA殘基回折成一種手指狀結(jié)構(gòu)，稱鋅指或鋅指區(qū)。第51頁,共89頁，2024年2月25日，星期天SP1鋅指結(jié)構(gòu)域Zincfingersmayformα-helicesthatinsertintothemajorgroove,associated

withβ-sheetsontheotherside第52頁,共89頁，2024年2月25日，星期天ThefirstfingerofasteroidreceptorcontrolsspecificityofDNA-binding(positionsshowninred);thesecondfingercontrolsspecificityofdimerization(positionsshowninblue).TheexpandedviewofthefirstfingershowsthatdiscriminationbetweenGREandEREtargetsequencesrestsontwoaminoacidsatthebase.第53頁,共89頁，2024年2月25日，星期天4常見的反式作用因子中的DNA識別或結(jié)合域：1螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋（helix-turn-helix,H-T-H）結(jié)構(gòu)：這一類蛋白質(zhì)分子中至少有兩個α螺旋，中間由短側(cè)鏈AA殘基形成“轉(zhuǎn)折”，近羧基端的α螺旋中氨基酸殘基的替換會影響該蛋白質(zhì)在DNA雙螺旋大溝中的結(jié)合。第54頁,共89頁，2024年2月25日，星期天Thehelix-turn-helixdomain第55頁,共89頁，2024年2月25日，星期天HTH結(jié)構(gòu)及其與DNA的結(jié)合第56頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2.鋅指（Zincfinger）結(jié)構(gòu):鋅指結(jié)構(gòu)家族蛋白大體可分為鋅指、鋅鈕（twist）和鋅簇（cluster）結(jié)構(gòu)，基特有的半胱氨酸和組氨酸殘基之間氨基酸殘基數(shù)基本恒定，有鋅參與時才具備轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。這類蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合很牢固，特異性也很高。第57頁,共89頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的鋅指結(jié)構(gòu)第58頁,共89頁，2024年2月25日，星期天Thezincfingerdomain第59頁,共89頁，2024年2月25日，星期天back…第60頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3.堿性-亮氨酸拉鏈(basic-leucinezipper):即bZIP結(jié)構(gòu)。在許多調(diào)控蛋白中發(fā)現(xiàn)的一段富含亮AA的序列，這個區(qū)域易形成α螺旋或卷曲螺旋的構(gòu)象，具有這種“拉鏈”形式的兩個蛋白就能形成穩(wěn)定的二聚體。拉鏈區(qū)以外的AA大都呈堿性，具的結(jié)合DNA的本領(lǐng)。第61頁,共89頁，2024年2月25日，星期天Back…第62頁,共89頁，2024年2月25日，星期天ThebasicregionsofthebZIPmotifareheldtogetherbythedimerizationattheadjacentzipperregionwhenthehydrophobicfacesoftwoleucinezippersinteractinparallelorientation.第63頁,共89頁，2024年2月25日，星期天Back第64頁,共89頁，2024年2月25日，星期天4.堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helix/loop/helix）：即bHLH結(jié)構(gòu)。在免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子結(jié)合蛋白E12與E47中，羧基端100-200個氨基酸殘基可形成兩個雙性α螺旋，被非螺旋的環(huán)狀結(jié)構(gòu)所隔開，蛋白質(zhì)的氨基端是堿性區(qū)，其DNA結(jié)合特性與亮AA拉鏈類蛋白相似。肌細胞定向分化的調(diào)控因子MyoD-1、原癌基因產(chǎn)物Myc及其結(jié)合蛋白Max等都屬于bHLH蛋白。研究發(fā)現(xiàn)：bHLH類蛋白只有形成同源或異源二聚體時，才具有足夠的DNA結(jié)合能力。第65頁,共89頁，2024年2月25日，星期天5.同源域蛋白（homeodomains）是指編碼60個保守氨基酸序列的DNA片斷，廣泛存在于真核生物基因組內(nèi)，與生物有機體的生長、發(fā)育和分化密切相關(guān)。許多含有同源轉(zhuǎn)換區(qū)的基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，同源轉(zhuǎn)換區(qū)AA序列很可能參與形成了DNA結(jié)合區(qū)。第66頁,共89頁，2024年2月25日，星期天5轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域：在真核核生物中，反式作用因子的功能受Pr-Pr之間相互作用的調(diào)節(jié)，完整的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能通常以復(fù)合物的方式來完成，所以并不是每個轉(zhuǎn)錄因子都直接與DNA結(jié)合。因此，是否具有轉(zhuǎn)錄活化域成為反式式作用因子中唯一的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。第67頁,共89頁，2024年2月25日，星期天反式作用因子的功能具有多樣性，其轉(zhuǎn)錄活化域也有多種，通常依賴于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以外的30-100個氨基酸殘基。不同的轉(zhuǎn)錄活化域有下列幾個特征性結(jié)構(gòu)：

1)帶負電荷的螺旋結(jié)構(gòu)：哺乳動物細胞中糖皮質(zhì)激素受體的兩個轉(zhuǎn)錄活化域都有酸性的螺旋結(jié)構(gòu)，能特異性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始的活性并不是很強，它們可能與TFⅡD復(fù)合物中某個通用因子或RNApolymeraseⅡ本身結(jié)合，并有穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的作用。第68頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2)富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)：如SP1是啟動子GCbox的結(jié)合蛋白，除結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)以外，SP1共有4個參與轉(zhuǎn)錄活化的區(qū)域，其中最強的轉(zhuǎn)錄活化域富含谷氨酰胺占該區(qū)AA總數(shù)的25%左右。3)富含脯AA的結(jié)構(gòu)：第69頁,共89頁，2024年2月25日，星期天七激素及其影響許多類固醇激素（如雌性激素、孕激素、醛固酮、糖皮質(zhì)激素和雄激素）以及一般的代謝性激素（胰島素），它們的調(diào)控作用是通過啟始轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)的。固醇類激素是疏水性分子，可以自由出入細胞膜。靶細胞具有專一的細胞質(zhì)受體，可與激素形成復(fù)合物，三維結(jié)構(gòu)甚至化學(xué)性質(zhì)變化。第70頁,共89頁，2024年2月25日，星期天類固醇第71頁,共89頁，2024年2月25日，星期天激素至少以5種方式啟動基因的轉(zhuǎn)錄：

1激素直接與DNA結(jié)合，促進RNA聚合酶或其它蛋白因子與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的相互作用。

2激素與效應(yīng)物相結(jié)合，改變其構(gòu)象，并使之易于結(jié)合到DNA上，促進RNA聚合酶與啟動區(qū)的結(jié)合。

3由于激素的存在，已經(jīng)與DNA結(jié)合的某個蛋白質(zhì)被激活，并且該Pr的這種形式是RNA聚合酶結(jié)合時所必須的。

4激素是誘導(dǎo)物，它可以使阻礙物失活。

5激素引起染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，暴露DNA，以促進RNA聚合酶的結(jié)合。第72頁,共89頁，2024年2月25日，星期天八其它水平上的基因調(diào)控1RNA的加工成熟：

rRNA：分子內(nèi)切割、化學(xué)修飾——甲基化（原核：堿基甲基化；真核：核糖甲基化）

tRNA：先生成tRNA前體，再加工成熟。

mRNA：先生成核不均一RNA（hnRNA），再加工剪輯，即切掉內(nèi)含子，連接外顯子。第73頁,共89頁，2024年2月25日，星期天2翻譯水平的調(diào)控：主要表現(xiàn)在三個方面：

1)Pr合成起始速率的調(diào)節(jié)。

2)mRNA的識別：與5ˊ帽子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

3)激素的影響。第74頁,共89頁，2024年2月25日，星期天3Pr的加工成熟

1多肽的切割加工與Pr分泌有關(guān)的切割?！づcPr活化有關(guān)的切割。上述兩種均在高爾基體內(nèi)進行信號肽的切除。

2多肽的有限水解：初生的Pr以Pr原或酶原形式存在，無生物活性，經(jīng)過有限的酶解或化學(xué)水解成為有活性的物質(zhì)。

3多肽的化學(xué)修飾：

Pr的磷酸化。·Pr的糖基化。第75頁,共89頁，2024年2月25日，星期天九真核基因在原核中的表達：（一）真核基因在原核中表達有下述特點：

1細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。

2真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列，不能結(jié)合到原核細胞的核糖體上，不能啟動翻譯過程。

3真核基因含有內(nèi)含子（intron），原核細胞缺乏真核細胞轉(zhuǎn)錄的外加工體系，不能切除內(nèi)含子，無法表達出真核蛋白。第76頁,共89頁，2024年2月25日，星期天4表達的真核蛋白在原核細胞中不穩(wěn)定，易被細菌蛋白酶破壞。5用于表達的真核基因，必須刪除信號肽編碼序列，才能表達出成熟的蛋白質(zhì)。因大腸桿菌缺乏真核表達系統(tǒng)的加工后處理功能，連同信號肽一并表達出的真核蛋白前體是無生物活性的。第77頁,共89頁，2024年2月25日，星期天6對于必須糖基化修飾的真核蛋白，由于原核細胞缺乏真核細胞特有的糖基化修飾作用，故無法得到具有生物功能的真核糖基化修飾蛋白。

7外源基因在原核細胞表達后，常以不溶性的包含體（includingbody）形式存在，它需經(jīng)變性-復(fù)性(refolding)處理后，才能得到具有生物活性的蛋白質(zhì)。第78頁,共89頁，2024年2月25日，星期天（二）真核基因在大腸桿菌中的幾種表達方式1融合蛋白：指蛋白的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的Pr由一條短的原核多肽或具有其它功能的多肽和真核Pr結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。第79頁,共89頁，2024年2月25日，星期天融合蛋白的特點：

1在細菌內(nèi)比較穩(wěn)定，容易高效表達。

2基因操作比較簡單。

3表達的融合蛋白經(jīng)化學(xué)處理（CNBr），或特異Pr酶（如凝血因子Ⅹ，膠原酶、凝血酶、腸激肽酶等）水解可以切除融合Pr氨基端的原核多肽，從而獲得有生物活性的真核目的蛋白。第80頁,共89頁，2024