揭秘冷凍電鏡技術(shù)

微末生物NanomegaBioAI作為當前結(jié)構(gòu)生物學領(lǐng)域最熱門的蛋白結(jié)構(gòu)成像技術(shù)，冷凍電鏡主要包括電子衍射晶體學（Micro-ED）、單顆粒冷凍電鏡（Cryo-EMSPA）和電子冷凍斷層掃描（Cryo-ET）三大類技術(shù)。其中，冷凍電鏡單顆粒分析已逐漸成為結(jié)構(gòu)生物學的重要工具，被廣泛用于研究難以結(jié)晶的大分子復合物，以前所未有的方式深刻地改變著結(jié)構(gòu)生物學領(lǐng)域，促進了生物學領(lǐng)域重大新發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)生。在這篇綜述中，來自加州大學洛杉磯分校的周正洪教授圍繞單顆粒冷凍電鏡技術(shù)，從樣品處理、儀器成像、重建以及模型構(gòu)建等方面進行了詳細的介紹，最后以3.8?分辨率解析的細胞質(zhì)多角體病毒（CPV）的三維結(jié)構(gòu)為例介紹了該技術(shù)在解決生物學問題方面的應用。本文以Towardsatomicresolutionstructuraldeterminationbysingle-particlecryo-electronmicroscopy為題，于2008年發(fā)表在結(jié)構(gòu)生物學領(lǐng)域的國際期刊Curr.Opin.Struct.Biol.上（編者注：本文發(fā)表在2013年發(fā)生的冷凍電鏡領(lǐng)域的“分辨率革命”之前，因此一些細節(jié)跟現(xiàn)在的冷凍電鏡有所區(qū)別，但總體技術(shù)思路不變。讀者可以將其當作冷凍電鏡發(fā)展早期的里程碑式綜述進行看待，也可以以此為契機首次詳細了解冷凍電鏡這一強大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成像技術(shù)）。一、單顆粒冷凍電鏡技術(shù)單顆粒冷凍電鏡技術(shù)在在確定蛋白質(zhì)高達亞納米級別分辨率的3D結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著越來越重要的作用，目前分辨率可達3.8?。在此分辨率下，可以解析蛋白質(zhì)螺旋鏈的轉(zhuǎn)角和深溝、β折疊中的鏈分層、無序環(huán)的密度和龐大的氨基酸側(cè)鏈等細節(jié)結(jié)構(gòu)特征。此外，該技術(shù)也可以用于分析CPV、Epsilon15噬菌體和輪狀病毒等生物體的結(jié)構(gòu)特征，進一步擴展了其在生物學領(lǐng)域的應用價值。與傳統(tǒng)經(jīng)典的X射線晶體衍射方法構(gòu)建出的蛋白結(jié)構(gòu)模型相比，冷凍電鏡的分析結(jié)果與X射線衍射的分析結(jié)果間存在良好的一致性。二、實驗流程1、樣品制備單顆粒冷凍電鏡技術(shù)對樣品質(zhì)量要求較高。冷凍電鏡樣品制備的目標是從新鮮制備的樣品中獲得網(wǎng)格上的冷凍水合樣品，以盡量減少所研究的大分子復合物可能的變形或損壞。因此，結(jié)構(gòu)完整的樣品對于單粒子冷凍電鏡至關(guān)重要。冷凍劑的選擇仍備受爭議。很多研究在做CPV和輪狀病毒時采用的是液氮冷卻，分辨率為3.8?,而在分析GroEL結(jié)構(gòu)和Epsilon15噬菌體結(jié)構(gòu)時候選擇的是液氦，分辨率為4.5?。當同時使用液氮和液氦分析相同樣品進行結(jié)構(gòu)分析時發(fā)現(xiàn)，液氮的效果更好。主要原因是因為液氦溫度下冰和生物樣品之間的低分辨率對比度降低。作者使用FEIPolaraG2雙溫冷凍電子顯微鏡比較了液氮和液氦溫度下冷卻同一樣品所獲得的圖像，從圖像對比度、劑量耐受性和潛在分辨率極限等方面分析數(shù)據(jù)質(zhì)量差異，最終發(fā)現(xiàn)液氦來冷卻樣品實現(xiàn)高分辨率成像并沒有總體優(yōu)勢。2、儀器和成像當向超大粒子的高分辨率分析邁進時，景深（depthoffiled，指在相機拍攝的圖像中，處于清晰狀態(tài)下的最近物體和最遠物體之間的距離）問題成為一個限制因素。目前基于中心投影定理，在當前大多數(shù)3D重建程序中實現(xiàn)蛋白質(zhì)三維重構(gòu)的方法，在景深受到限制的情況下可能不再成立。使用更高的電壓（更短的電子波長）緩解了這個問題。但對于直徑高達800?（80nm）或更大的粒子，使用300keV電子將分辨率提高到4?以上，需要對傳遞函數(shù)進行完全校正。除了視野仍然有限外，CCD相機作為記錄介質(zhì)比膠片具有許多顯著優(yōu)勢，并且已被嚴格證明是單粒子冷凍電鏡成像的首選記錄設(shè)備，分辨率高達亞納米級。首先，寬動態(tài)范圍、線性度和低噪聲水平使這些器件成為記錄二維晶體衍射強度的理想選擇。其次，CCD相機可提供有關(guān)圖像質(zhì)量的即時反饋，從而可以有效地優(yōu)化樣品制備和顯微鏡對準。再次，無需在顯微鏡真空中裝卸照相膠片的步驟，冷凍電鏡網(wǎng)格的使用壽命可以從采用膠片時期的一天顯著延長到CCD方法的數(shù)天或數(shù)周。第四，盡管由于CCD相機的點擴散功能較差，高分辨率數(shù)據(jù)受到的抑制更嚴重，但CCD圖像在低分辨率區(qū)域具有更好的信噪比，從而提供了更好的圖像“對比度”，這對于對齊單粒子圖像至關(guān)重要。最后，與傳統(tǒng)的照相膠片相比，CCD成像曝光的樣品面積要小得多。因此，它最大限度地減少了類似于“點掃描”方法的可能的光束引起的樣品移動或帶電，并減少了每個圖像中散焦變化的影響。對于近原子分辨率的冷凍電鏡重建，應嚴格篩選原始冷凍電鏡圖像，僅選擇功率譜中可見對比度傳遞函數(shù)環(huán)高達5?的圖像。這些圖像的功率譜中也不應有可見的標本漂移、電荷和散光，以確保在最終的3D重建中僅使用高質(zhì)量的圖像。3、重建單顆粒結(jié)構(gòu)重建的數(shù)據(jù)處理包括兩個基本步驟：取向中心參數(shù)確定和3D重建。結(jié)構(gòu)細化是作為這兩個步驟的迭代過程進行的，通過逐步向更高的分辨率推進。各種軟件包，包括EMAN、FREALIGN和IMIRS，已成功用于近原子分辨率結(jié)構(gòu)重建。這些軟件包中使用的方向中心參數(shù)確定原理是相似的，包括搜索公共線和匹配計算投影。對于3D重建步驟，EMAN和FREALIGN使用直接傅里葉反演方法，這是計算效率最高的方法，但可能具有較大的內(nèi)存要求（例如，800?粒子的內(nèi)存要求為30GB并且通常對噪聲更敏感。相比之下，在IMIRS中實現(xiàn)的計算效率較低的傅里葉-貝塞爾合成方法和球諧波合成方法對圖像噪聲的敏感度較低，對存儲器的要求也較低。總體而言，這些研究中使用的總計算時間相差幾個數(shù)量級，并且可能與實現(xiàn)細節(jié)和用戶程序的差異有關(guān)。單顆粒冷凍電鏡重建的有效分辨率可以通過嚴格評估密度圖中解析的結(jié)構(gòu)特征或標志以及使用獨立重建圖的統(tǒng)計分析來估計。通過使用EMAN中實現(xiàn)的高斯濾波器過濾原子分辨率模型，顯示了三種類型的二級結(jié)構(gòu)單元(α螺旋、β片和連接環(huán)）在不同分辨率下的模擬密度。在3.8–4.0?分辨率下，理想的螺旋密度圖應顯示深凹槽和清晰的螺距。鏈間距離為4.4?的β片中的鏈（氫鍵密度區(qū)域除外）和相距3.8?的Cα原子的鋸齒形圖案也被解析。較大的氨基酸的側(cè)鏈的密度也應該開始出現(xiàn)。在研究人員獲得的CPV冷凍電鏡密度圖中，這些特征都存在，包括相鄰Cα原子之間的3.8?距離和許多側(cè)鏈密度數(shù)據(jù)明確、結(jié)構(gòu)精準、令人信服（評估有效分辨率的常用統(tǒng)計標準包括傅里葉殼相關(guān)和頻譜信噪比，二者被證明是等效的）。通過檢查圖中的一些可分辨特征（例如α螺旋結(jié)構(gòu)中軸的空隙、側(cè)鏈的密度、β折疊片層之間的清晰分離）來評估模型質(zhì)量至關(guān)重要。由于重建方法中可能存在系統(tǒng)誤差，在使用傳統(tǒng)的FSC曲線（Fouriershellcorrelation）方法評估冷凍電鏡圖的有效分辨率時需要謹慎，尤其是當分辨率接近原子尺度時更是如此。人們已經(jīng)認識到，由于使用互相關(guān)方法（crosscorrelation）來進行基于模板匹配的數(shù)據(jù)優(yōu)化的過程中存在模型偏差（modelbias可能存在的“噪音相關(guān)性”會導致誤導性的“高分辨率”FSC評估結(jié)果（編者注：這一問題實際上反映了實驗人員追求單項數(shù)據(jù)的結(jié)果。真正的評估數(shù)據(jù)應該落實到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型與其冷凍電鏡拍攝結(jié)果的對應效果上。然而，如果僅僅是為了追求分辨率數(shù)值而對目標結(jié)構(gòu)進行調(diào)整，反而會使得結(jié)果產(chǎn)生更加嚴重的偏差。）種模型偏差問題對于低信噪比的圖像數(shù)據(jù)（例如在近聚焦條件下的圖像數(shù)據(jù)）或非對稱、低對稱性的目標物體以及小蛋白顆粒更為嚴重。因此，有必要使用結(jié)構(gòu)特征或立體化學作為內(nèi)部控制來判斷在模型優(yōu)化的過程中是否發(fā)生了這種偏差。當分辨率達到近原子尺度時，上述的那些“可分辨特征”可用于判斷FSC評估是否受到模型偏差的影響。另一種監(jiān)測FSC評估可能偏差的方法是，根據(jù)兩個不同的初始模型來優(yōu)化整個圖像數(shù)據(jù)集，并監(jiān)測兩種起始點優(yōu)化結(jié)果的收斂性。最后，使用特定方法（如聚焦對方法focal-pairapproach和無模型共線方法model-freecommonlinesmethod）進行方向-中心估計（orientation-centerestimation可以消除模型偏差。后續(xù)地，通過對「方向」或「中心」變化的范圍做出限制，基于模型的方向-中心優(yōu)化可以作為一種“局部”搜索的監(jiān)督方法發(fā)揮作用，降低在評估和調(diào)整分辨率的過程中發(fā)生“模型偏差”的風險。圖1.不同分辨率的二級結(jié)構(gòu)元件。該片段是從HK97衣殼蛋白的原子模型中提取的，包括一個α螺旋和一個β發(fā)夾，它們通過環(huán)連接在一起，并使用EMAN過濾到不同的分辨率。在這種理想情況下，β發(fā)夾中的股線開始分離，較大的氨基酸的側(cè)鏈在4?處清晰可見。在2?分辨率下，酪氨酸分子側(cè)鏈芳香環(huán)上的一個孔被解析（紅色箭頭）。所有密度圖均使用Chimera軟件顯示。4、細分和模型構(gòu)建大體積蛋白復合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的渲染對計算要求非常高，并且可能是結(jié)構(gòu)解釋中的速率限制步驟。因此，研究人員希望從整個蛋白復合物群體中剖析或分割單個結(jié)構(gòu)組件，以便方便地識別和比較詳細的特征。對于二十面體病毒，只有不對稱單元內(nèi)的結(jié)構(gòu)成分在結(jié)構(gòu)上是唯一的，值得檢查，而其他的部分不過是這一結(jié)構(gòu)按特定規(guī)律進行重復。單個組分的分割還允許對結(jié)構(gòu)相似的組分進行非二十面體平均，以提高信噪比并進一步提高平均亞基的分離度。例如，在由8400個顆粒重建的輪狀病毒的不對稱單元中，VP6分子（病毒蛋白6）的13個亞基的非二十面體平均顯著提高了圖譜的分辨率。通過平均降低VP6三聚體中的噪聲，研究人員能夠獲得更好的側(cè)鏈密度分辨率。適用于解釋近原子分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的模型構(gòu)建工具的選擇有限。使問題進一步復雜化的事實是，冷凍電鏡圖通常包含許多亞基，具有超過5000個氨基酸，但其中只有不到10-20%具有可識別的龐大側(cè)鏈。這是有問題的，因為廣泛使用的原子模型構(gòu)建工具，最著名的是O和Coot，采用自下而上的方法，即從側(cè)鏈到氨基酸，再到最終的原子模型。這種自下而上的方法對圖譜質(zhì)量和分辨率有嚴格的要求，并且不容易適用于近原子分辨率的冷凍電鏡圖。新的集成工具，如骨架化和圖優(yōu)化，可以與其他建模工具一起使用，以構(gòu)建粗糙的蛋白質(zhì)主鏈原子骨架模型。同源結(jié)構(gòu)的比對對基于近原子分辨率數(shù)據(jù)的模型構(gòu)建有很大幫助。例如，CPV病毒，CSP病毒和正呼腸孤病毒λ1的蛋白序列（及其在BTV和RDV中的結(jié)構(gòu)同源物）的序列同一性小于10%，這大約是兩條隨機之間的預期水平。因此，使用當前的序列比對程序，這些蛋白質(zhì)沒有可檢測到的序列同源性。然而，冷凍電鏡圖清楚地顯示，CSP與λ1具有相似的整體拓撲結(jié)構(gòu)（或折疊盡管螺旋有明顯的插入和缺失。因此，在構(gòu)建CSP-A和CSP-B模型時，可以使用已知的正呼腸孤病毒λ1結(jié)構(gòu)作為拓撲參考。圖2：輪狀病毒結(jié)構(gòu)顯示了13倍非二十面體平均的能力。（a）輪狀病毒DLP。（b）VP6的三聚體經(jīng)過13倍平均。在(c)平均之前和(d)平均之后，密度板((b)中的紅色矩形)與x射線模型疊加。后者的效果明顯較好。三、應用舉例由于細胞質(zhì)多角體病毒（CytoplasmicPolyhedrosisVirus，CPV）和Epsilon15噬菌體沒有可用的X射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，從其冷凍電鏡結(jié)構(gòu)得出的原子模型為功能意義提供了線索。CPV的3.88-?結(jié)構(gòu)說明了近原子分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)如何解決有趣的生物學問題。CPV在呼腸孤病毒科中是獨一無二的，因為它在多面體包涵體中僅包含單層衣殼，但仍然完全能夠進入細胞和復制。先前對CPV的冷凍電鏡研究提供了有關(guān)其結(jié)構(gòu)組織、轉(zhuǎn)錄酶復合物和基因組RNA組織以及分子相互作用和互補性的大量信息。然而，由于缺乏完整CPV衣殼的原子模型，許多基本問題仍然難以捉摸，包括RNA包裝、轉(zhuǎn)錄、加工和釋放的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，以及CPV多面體包埋獨特性質(zhì)的機制。盡管與高分辨率X射線晶體結(jié)構(gòu)相比，3.88?的分辨率仍然有限，但它讓我們能夠明確追蹤主鏈并構(gòu)建CPV蛋白的Cα模型，以幫助解決分子相互作用并提供功能解釋。圖3.CPV結(jié)構(gòu)說明（3.88?)解決三個生物學問題。（a）根據(jù)粒子半徑著色的全圖。（b）由蛋白質(zhì)亞基著色的不對稱單元，顯示分子相互作用。（c）突出說明三個生物學問題的結(jié)構(gòu)的示意圖。順時針方向為TurretProtein中多面體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的識別（右上CSP亞基結(jié)構(gòu)模型中對應位置從CSP-A的螺旋結(jié)構(gòu)到CSP-B的