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02四月2024高效液相色譜法01四月2024高效液相色譜法12一、

概述

高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相柱色譜裝置高效液相色譜儀經(jīng)典液相色譜HPLC固定相粒徑流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)方式流動(dòng)相流速150-200μm重力或低壓泵很慢3-10μm高壓泵快(1-10mL/min)例：分離20種氨基酸柱長(zhǎng)：170cm柱徑：0.9cmF：30mL/ht分離:>20h經(jīng)典柱色譜HPLCt分離：1h2一、概述高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相柱色譜裝23二、基本理論1、色譜柱柱效的基本關(guān)系式2、分離度3二、基本理論1、色譜柱柱效的基本關(guān)系式2、分離度343、速率方程溶質(zhì)在液相流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，約為氣相中擴(kuò)散系數(shù)的萬(wàn)分之一43、速率方程溶質(zhì)在液相流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，約為氣相中擴(kuò)散45流動(dòng)相流速對(duì)板高的影響小顆粒填料，填充均勻；選擇較低的流動(dòng)相流速；選擇粘度小的溶劑作流動(dòng)相，改善傳質(zhì)。修正的速率方程：提高柱效途徑5流動(dòng)相流速對(duì)板高的影響小顆粒填料，填充均勻；修正的速率方程56三、高效液相色譜分離方法1、吸附色譜法分離原理Kad值越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。6三、高效液相色譜分離方法1、吸附色譜法分離原理Kad值67固定相硅膠－強(qiáng)極性氧化鋁－弱極性活性炭－非極性分子篩－強(qiáng)極性高分子多孔微球(GDX)固體吸附劑7固定相硅膠－強(qiáng)極性固體吸附劑782、離子交換色譜法陽(yáng)離子交換樹脂陽(yáng)離子交換陰離子交換分離原理82、離子交換色譜法陽(yáng)離子交換樹脂陽(yáng)離子交換陰離子交換分離89固定相陽(yáng)離子：－SO3H(強(qiáng))－CO2H(弱)陰離子：－N+R3(強(qiáng))－NH2(弱)基質(zhì)合成樹脂纖維素硅膠離子交換劑9固定相陽(yáng)離子：基質(zhì)合成樹脂離子交換劑910流動(dòng)相水相緩沖液+有機(jī)改性劑調(diào)節(jié)選擇性的主要參數(shù)鹽種類及濃度pH值各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序：用檸檬酸離子洗脫比用氟離子洗脫快10流動(dòng)相水相緩沖液+有機(jī)改性劑調(diào)節(jié)選擇性的主要參數(shù)鹽種類1011應(yīng)用：離子及可離解的化合物如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等11應(yīng)用：離子及可離解的化合物11123、化學(xué)鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因此它適用于種類繁多樣品的分離。特點(diǎn)123、化學(xué)鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜固定相非常穩(wěn)1213鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相硅膠十八烷基氯硅烷非極性硅烷化反應(yīng)使用pH范圍：2-813鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相硅膠十八烷基氯硅烷非1314鍵合固定相類型疏水基團(tuán)烷烴（C8和C18）、苯基等極性基團(tuán)丙氨基氰乙基醚和醇等離子交換基團(tuán)胺基、季銨鹽磺酸、羧酸14鍵合固定相類型疏水基團(tuán)極性基團(tuán)離子交換基團(tuán)1415鍵合相色譜法分類

反相鍵合相色譜:常用固定相：C18分離對(duì)象:非極性中等極性化合物常用流動(dòng)相甲醇-水乙睛-水反相鍵合相色譜疏溶劑分離機(jī)制固定相極性<流動(dòng)相極性15鍵合相色譜法分類反相鍵合相色譜:常用固定相：C18分離1516

正相鍵合相色譜

固定相極性>流動(dòng)相極性

離子性鍵合相色譜將各種離子交換基團(tuán)化學(xué)鍵合到硅膠基質(zhì)表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相。其分離原理與離子交換色譜類同。16正相鍵合相色譜離子性鍵合相色譜1617例：甲苯和苯酚的分離。流動(dòng)相：甲醇-水出峰順序：苯酚，甲苯出峰順序：甲苯，苯酚十八烷基鍵合相二醇基鍵合相17例：甲苯和苯酚的分離。流動(dòng)相：甲醇-水出峰順序：苯酚，甲1718保留時(shí)間：<例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇-水為流動(dòng)相分離以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。沒(méi)食子酸3,4-二羥基苯甲酸固定相:非極性;流動(dòng)相:極性組分極性:3,4-二羥基苯甲酸<沒(méi)食子酸18保留時(shí)間：<例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇-水為流動(dòng)相分離18194、尺寸排阻(凝膠)色譜法排阻色譜分離示意圖相對(duì)分子質(zhì)量差別大于10％的化合物才可以分離分離原理194、尺寸排阻(凝膠)色譜法排阻色譜分離示意圖相對(duì)分子質(zhì)1920四、高效液相色譜儀20四、高效液相色譜儀2021高壓泵流動(dòng)相溶劑廢液色譜柱進(jìn)樣口檢測(cè)器21高壓泵流動(dòng)相溶劑廢液色譜柱進(jìn)樣口檢測(cè)器21221、高壓輸液系統(tǒng)高壓泵要求輸出壓力高平穩(wěn)、脈沖小流量穩(wěn)定可調(diào)耐腐蝕221、高壓輸液系統(tǒng)高壓泵要求2223梯度洗脫裝置低壓梯度高壓梯度通過(guò)改變流動(dòng)相的組成來(lái)調(diào)整組分的k值，改變分離因子α值，以達(dá)到最短時(shí)間內(nèi)得到最佳分離的目的。梯度洗脫23梯度洗脫裝置低壓梯度高壓梯度2324等度洗脫與梯度洗脫24等度洗脫與梯度洗脫2425貯液瓶及流動(dòng)相1)對(duì)樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。2)適用于所選擇的檢測(cè)器。3)化學(xué)惰性好，以免破壞固定相。4)低粘度，增加樣品的擴(kuò)散系數(shù)，提高柱效。5)純度高。溶劑不純會(huì)增加檢測(cè)器噪聲，產(chǎn)生偽峰。對(duì)流動(dòng)相溶劑的一般要求25貯液瓶及流動(dòng)相1)對(duì)樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生25262、進(jìn)樣系統(tǒng)

準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)

六通閥進(jìn)樣裝置

自動(dòng)進(jìn)樣器

262、進(jìn)樣系統(tǒng)準(zhǔn)備狀態(tài)26273、色譜柱內(nèi)徑：1～6mm，柱長(zhǎng)：5～30cm；柱填料粒徑：1~5μm

分離柱273、色譜柱內(nèi)徑：1～6mm，柱長(zhǎng)：5～30cm；分27284、檢測(cè)系統(tǒng)紫外吸收檢測(cè)器(a)可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(b)二極管陣列檢測(cè)器氘燈光柵流通池測(cè)量光電二極管參比光電二極管二極管陣列檢測(cè)器284、檢測(cè)系統(tǒng)紫外吸收檢測(cè)器(a)可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(2829兩種檢測(cè)器的色譜圖(a)：可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器；(b)：二極管陣列檢測(cè)器(b)(a)29兩種檢測(cè)器的色譜圖(b)(a)2930紫外檢測(cè)器靈敏度高，精密度及線性范圍較好，可用于梯度洗脫。流動(dòng)相選擇有限制。一些常用溶劑的紫外截止波長(zhǎng)溶劑CS2氯仿四氫呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止波長(zhǎng)（nm）38024521221019020518730紫外檢測(cè)器靈敏度高，精密度及線性范圍較好，可用于梯度洗