基本原理與主要分離類型

HPLC液-固吸附液-液分配反相色譜一般反相色譜離子對(duì)色譜離子抑制色譜離子交換色譜一般離子交換色譜氨基酸分析空間排斥色譜凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜假相色譜膠束色譜環(huán)糊精色譜親合色譜，手性色譜，毛細(xì)管電泳鍵合相色譜2024/4/1一、液-固吸附色譜

liquid-solidadsorptionchromatography

固定相：固體吸附劑如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑，相似相溶，即極性大的試樣用較強(qiáng)的流動(dòng)相，反之亦然。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；2024/4/1

吸附劑含水量是控制吸附劑活性，影響溶質(zhì)保留的重要因素。2024/4/1

當(dāng)流動(dòng)相通過固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相（溶劑分用）于是，在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附:2024/4/1二、液-液分配色譜

liquid-liquidpartitionchromatography固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；

流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2024/4/1按結(jié)構(gòu)分，鍵合相可分為四種鍵型：（1）硅酸酯型（≡Si-O-C≡）鍵合相（2）硅氮型（≡Si-N≡）鍵合相（3）硅碳型（≡Si-C≡）鍵合相（4）硅氧烷型（≡Si-O-Si-C≡）鍵合相

2024/4/1按極性分，鍵合相可分為三種（1）非極性鍵合相（2）弱極性鍵合固定相（3）極性鍵合相2024/4/1（1）非極性鍵合相

表面基團(tuán)為非極性羥基，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基（C1）、苯基等。常用于反相色譜非極性鍵合相的烷基鏈越長，穩(wěn)定性越好，溶質(zhì)的K越大，載樣量越高，分離選擇性越好。2024/4/1時(shí)間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對(duì)反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯2024/4/1（2）弱極性鍵合固定相常見的有醚基和二羥基鍵合相可用于正相或反相色譜（3）極性鍵合相氨基鍵合相：硅膠-氨丙硅烷基[－Si－(CH2)3NH2]氰基鍵合相：硅膠-氰乙硅烷基[－Si－(CH2)2CN]一般用于正相色譜2024/4/1表示方法：國產(chǎn)：YWG-C18H37

YQG-C18H37

YWG-CN

YQG-NH2

YWG-C6H5進(jìn)口：SpherisorbODS

Lichrosorb-CN

2024/4/1特點(diǎn)：

1）不易流失；2）熱穩(wěn)定性好；3）化學(xué)性能好：可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；

4）載樣量大；5）適于梯度洗脫存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；使用時(shí)應(yīng)注意：1）流動(dòng)相pH應(yīng)在2～8，否則會(huì)引起硅膠溶解2）不同廠家，不同批號(hào)的同一類型鍵合相也可能表現(xiàn)不同的色譜特性。2024/4/12024/4/12024/4/1三、離子交換色譜

ion-exchangechromatography

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

流動(dòng)相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。2024/4/1

離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：陽離子交換：陰離子交換：2024/4/1

凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。2024/4/1四、離子色譜

ionchromatography

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。2024/4/1五、2024/4/1

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；

陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；

色譜條件：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+

X-后；在兩相間分配。2024/4/1六、排阻色譜色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離2024/4/1七、親和色譜(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。

先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。2024/4/1八、液相色譜的流動(dòng)相

mobilephasesofLC

液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；

1、流動(dòng)相特性1）與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。2）對(duì)試樣有適宜的溶解度。使k在1-10范圍內(nèi)。3）與檢測(cè)器相適應(yīng)。例如用紫外檢測(cè)器時(shí)，選用截止波長小于檢測(cè)波長的溶劑。對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)到最高靈敏度。2024/4/14）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時(shí)可使截止波長增加；5）低的粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。2024/4/12.流動(dòng)相類別

按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。2024/4/13.流動(dòng)相選擇

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。

常用溶劑的極性順序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2024/4/12024/4/11、相對(duì)分子量①分子量＞2000，凝膠色譜柱②分子量<2000，但同時(shí)分子量相