豬塞內(nèi)卡病毒病防控技術規(guī)程

1DB13/TXXXX—XXXX豬塞內(nèi)卡病毒病防控技術規(guī)程本標準規(guī)定了豬塞內(nèi)卡病毒病的診斷和防控。本標準適用于養(yǎng)豬場（戶）和動物疾病防治單位對塞內(nèi)卡病毒病的診斷和防治。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T388畜禽場環(huán)境質(zhì)量標準NY5027無公害食品畜禽飲用水水質(zhì)NY5032無公害食品生豬飼養(yǎng)飼料使用準則NY5031無公害食品生豬飼養(yǎng)獸醫(yī)防疫準則NY/T5033無公害食品生豬飼養(yǎng)管理準則NY/T3790塞內(nèi)卡病毒感染診斷技術3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。豬塞內(nèi)卡病毒病是由A型塞內(nèi)卡病毒引起的豬的一種高度接觸傳染性疾病。各品種和日齡豬均可感染，成年豬感染后受到的危害較輕，母豬表現(xiàn)為口、蹄部位出現(xiàn)水泡，育肥豬生產(chǎn)停滯，飼料轉化率降低，仔豬感染后可表現(xiàn)為腹瀉及神經(jīng)癥狀，死亡率高。4診斷4.1流行病學4.1.1流行特點一年四季均可發(fā)生，但多發(fā)生于春秋季節(jié)。4.1.2易感動物主要感染豬，不同年齡段的豬均可感染，成年豬與母豬臨床癥狀更為典型，也可以感染牛、羊、鼠等其他動物。4.1.3傳染源病豬和帶毒豬是主要傳染源,尤其是處于病毒血癥期的感染豬。4.1.4傳播途徑主要通過易感動物與帶有水泡或水泡破裂發(fā)病豬的直接接觸感染；也可通過病豬唾液、糞便、尿液等分泌物和排泄物、污染的飼料、飲水、圈舍間接接觸感染；豬場內(nèi)蒼蠅和鼠類在該病的傳播過程中也起著非常重要的作用。2DB13/TXXXX—XXXX4.2臨床癥狀母豬感染后表現(xiàn)為精神不振，采食量減少，體溫升高，嗜睡，站立困難，跛行，病豬鼻鏡、鼻孔、口腔黏膜和蹄部冠狀帶形成水泡。育肥豬癥狀與母豬類似，死亡率極低，臨床多見跛行癥狀。新生仔豬感染后的癥狀與大豬不同，臨床上一般很少見鼻吻部及蹄部出現(xiàn)水泡，主要表現(xiàn)為腹瀉、神經(jīng)癥狀及高死亡率等。4.3病理變化4.3.1解剖病理學母豬多在感染后2周內(nèi)康復，大多愈后良好，病豬很少死亡。解剖病理變化主要表現(xiàn)為豬心臟出血、充血，肺氣腫，肝臟出現(xiàn)局灶性壞死。育肥豬感染后病理變化與母豬類似。仔豬感染后病理病變化主要表現(xiàn)為豬胃內(nèi)殘留大量乳汁，腸內(nèi)充滿黏稠狀液體，腸黏膜無明顯可見病變。4.3.2組織病理學大腦組織出現(xiàn)“衛(wèi)星”和“嗜神經(jīng)”現(xiàn)象，腎臟出現(xiàn)局灶性淋巴細胞、單核細胞浸潤，小腸黏膜壞死、脫落。4.4實驗室診斷4.4.1樣品采集水泡液采集利用無菌注射器吸取臨床發(fā)病動物的水泡液，注入保存管，加入青霉素1000IU/mL、鏈霉素500IU/mL，加蓋密封，-20℃保存。水泡皮采集用PBS清洗水泡皮表面，然后用滅菌手術剪剪取水泡皮2-5g，裝入樣品保存管中，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面沒過樣品，加蓋密封，-20℃保存。組織樣品采集對于沒有典型水泡癥狀的發(fā)病動物，可采集病灶周圍潰破組織2-5g，裝入樣品保存管中，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面沒過樣品，加蓋密封，-20℃保存。臨床表現(xiàn)健康，仍需檢測塞內(nèi)卡病毒的動物，可在屠宰時采集淋巴結、扁桃體組織2-5g，裝入樣品保存管中，加蓋密封，-20℃保存。4.4.2病原學診斷3DB13/TXXXX—XXXX病毒分離參照NY/T3790進行。間接免疫熒光試驗（IFA方法）按附錄B規(guī)定的方法執(zhí)行。聚合酶鏈式反應（PCR方法）按附錄C規(guī)定的方法執(zhí)行。實時熒光定量PCR檢測方法參照NY/T3790進行。4.4.3血清學診斷間接酶聯(lián)免疫吸附試驗參照NY/T3790進行。病毒中和試驗參照NY/T3790進行。5預防5.1強化生物安全措施強化生物安全措施，控制和消滅傳染源，豬場堅持自繁自養(yǎng)、全進全出，引種要明確來源，加強檢疫，不從疫區(qū)引進種豬和仔豬，新引進豬嚴格實行隔離觀察。外來人員、車輛、物品等入場必須嚴格執(zhí)行消毒措施，做好防蠅、滅鼠工作，同時控制其他非豬動物入場，防止病原傳入。豬場如有發(fā)生SVA感染情況，盡早對患病豬進行隔離、診斷、淘汰等工作，切實做好豬場環(huán)境衛(wèi)生，保持圈舍清潔，防止病毒擴散傳播。5.2加強生豬飼養(yǎng)管理加強飼養(yǎng)管理，增強生豬的抵抗力。飼料要求按照NY5032的規(guī)定執(zhí)行；飲水要求按照NY5027的規(guī)定執(zhí)行；飼養(yǎng)管理按照NY/T5033的規(guī)定執(zhí)行；環(huán)境控制應符合NY/T388的規(guī)定；疫病防控按照NY/5031的規(guī)定執(zhí)行；提高警惕，對口蹄疫免疫后仍出現(xiàn)類似癥狀的可疑病例，應及時向當?shù)孬F醫(yī)部門報告。6治療6.1隔離和消毒對發(fā)病豬群進行隔離、并做好消毒工作；對病死、剖檢豬尸體應進行無害化處理。加強場內(nèi)消毒，并用2％氫氧化鈉溶液、10％石灰乳或20％草木灰溶液徹底消毒用具和豬舍。6.2抗病毒4DB13/TXXXX—XXXX使用黃芪多糖注射液聯(lián)合使用豬用干擾素，進行混合肌肉注射，1次/d，連續(xù)使用3d；可在豬飼料中添加一些微生物和營養(yǎng)物質(zhì)來增加動物的抵抗力，從而降低疾病的發(fā)生。6.3對癥治療為了避免豬感染該病后水泡發(fā)生破裂和潰瘍，可以肌肉注射頭孢噻呋鈉注射液，1次/d，連續(xù)使用3d；如果病豬鼻部、蹄部和口唇部位出現(xiàn)潰瘍的話，可以使用一定量的高錳酸鉀溶液清洗，之后涂抹碘甘油，每天處理一次即可。5DB13/TXXXX—XXXX附錄A（規(guī)范性附錄）相關試劑的配制A.11.0%瓊脂糖凝膠稱取瓊脂糖1.0g，放入100mL1×TAE電泳緩沖液中，加熱融化，溫度降至60℃時，加入5μL核酸染料，均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。A.250×TAE電泳緩沖液A.2.10.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）稱取EDTA18.61g，加滅菌雙蒸水至100mL，后用氫氧化鈉調(diào)pH至8.0。A.2.2TAE電泳緩沖液（50×)Tris242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA100mL，加滅菌雙蒸水至1000mL。A.3溴化乙錠（EB）溶液溴化乙錠20mg，加滅菌雙蒸水至20mL。A.4DEPC水焦碳酸二乙酯（DEPC）50μL，加滅菌雙蒸水至100mL，室溫放置6h～8h，121℃±2℃高壓滅菌20min，分裝到1.5mLDEPC處理過的離心管。A.5PBS緩沖液A.5.1A液（0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液NaH2PO4·H2O27.6g先用適量蒸餾水溶解，最后用蒸餾水稀釋至1000mL。A.5.2B液（0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液Na2HPO4·7H2O53.6g或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用適量蒸餾水溶解，最后用蒸餾水稀釋至1000mL。A.5.30.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液的配制：A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，最后用蒸餾水稀釋至1000mL。A.6細胞培養(yǎng)用溶液A.6.12×104U/mL青霉素鏈霉素液（雙抗青霉素、鏈霉素各2×106U溶于100mL三蒸水中，過濾除菌，分裝后，-20℃凍存?zhèn)溆?。A.6.2500mmol/LHepes貯存液：1.2gHepes溶于10mL三蒸水中，經(jīng)121℃高壓滅菌15min，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?DB13/TXXXX—XXXXA.6.37.5%NaHCO3：7.5gNaHCO3溶于100mL三蒸水中，115℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆?。A.6.45×DMEM濃縮液：將DMEM粉劑按廠家說明書配制，過濾除菌，4℃保存，使用時進行5倍稀釋。A.6.5含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基（生長液于264mL三蒸水中加入80mL5×DMEM溶液，40mLFBS（胎牛血清2mL2×104U/mL青鏈霉素液，4mL500mmol/LHepes貯存液，用7.5%NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4左右，4℃保存?zhèn)溆?。A.6.6含2％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基（維持液于296mL三蒸水中加入80mL5×DMEM溶液，8mLFBS，2mL2×104U/mL青鏈霉素液，4mL500mmol/LHepes貯存液，用7.5%NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4左右，4℃保存?zhèn)溆?。A.6.710×Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%Na2EDTA0.2g，NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.89g，KH2PO40.2g，溶于90mL三蒸水中，再加入2.5g胰酶（NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆茫褂脮r1：10稀釋。7DB13/TXXXX—XXXX（規(guī)范性附錄）間接免疫熒光試驗B.1材料BHK-21細胞、生長液、維持液、0.25%胰酶溶液、豬塞內(nèi)卡病毒鼠源單克隆抗體、FITC熒光標記的羊抗鼠IgG、無水乙醇。B.2儀器設備倒置熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱B.3操作步驟B.3.1復蘇BHK-21細胞，于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長成良好的細胞單層后，用0.25%胰酶溶液進行消化。B.3.2將BHK-21細胞消化后，以約106個/mL的細胞密度轉入96孔細胞培養(yǎng)板，于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長成良好的細胞單層后，接種待檢病毒，同時設立陰陽性對照，于37℃吸附1h后，加入100μL維持液繼續(xù)培養(yǎng)。B.3.3接毒一定時間后，倒去上層液體，用-20℃預冷的無水乙醇室溫固定15min，棄掉無水乙醇，PBS清洗一遍，棄掉，自然干燥。B.3.4滴加一定濃度豬塞內(nèi)卡病毒鼠源單克隆抗體，37℃濕盒作用50min；PBS漂洗3次，每次5min；避光條件下滴加1:40稀釋的FITC熒光標記的羊抗鼠IgG，37℃濕盒作用50min；PBS漂洗3次，每次5min；吸干液體后立即于熒光顯微鏡下觀察。B.4結果判定陽性對照進行IFA后細胞漿中可見特異性綠色熒光，陰性對照進行IFA后細胞漿中未見特異性綠色熒光，陰陽性同時成立表明試驗有效，否則試驗無效。陰陽性同時成立的情況下，若待檢樣品進行IFA后細胞漿中可見特異性綠色熒光，則判定為待檢樣品豬塞內(nèi)卡病毒陽性。B.5.IFA鑒定熒光圖8DB13/TXXXX—XXXX9DB13/TXXXX—XXXX(規(guī)范性附錄)聚合酶鏈式反應C.1材料引物名稱引物濃度序列（5'-3'）SVA-decF10μmol/LGTGGGAAGGTATCTTTCGTGCTSVA-decR10μmol/LTCATAGTGGTGAGACTTTGGGCC.2儀器設備PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、臺式低溫高速離心機、電泳儀、電泳槽、冰箱、微量可調(diào)移液器（10μL、C.3樣品的采集與處理C.3.1樣品的采集采集痂皮、水泡液等，將采集好的樣品放入1.5mL離心管，加蓋，編號，放入塑料袋內(nèi)密封（一個采集點的樣品放一個塑料袋內(nèi)于保溫箱中加冰，密封24h內(nèi)送至實驗室。C.3.2樣品的處理將所采集的痂皮于潔凈、滅菌并烘干的搪瓷盤中，稱取組織按照質(zhì)量體積比（1:5）加入PBS緩沖液進行充分研磨，4℃,3000r/min離心15min，取上清轉入無菌1.5mL離心管，編號備用；將水泡液4℃,3000r/min離心15min，取上清轉入無菌1.5mL離心管，編號備用。C.4操作步驟C.4.1核酸提取采用商品化核酸提取試劑，按照說明書進行操作。同時進行陰陽對照樣品的核酸提取。C.4.2反轉錄反應（cDNA的合成）取上述步驟所得的核酸11μL，加入2μL10μmol//L的反轉錄引物（SVA-decR4μL5×反轉錄緩溶液，直接用于下面的PCR擴增或-20℃凍存?zhèn)溆?。C.4.3PCR反應DB13/TXXXX—XXXX在反應管中依次加入無核酸酶水6μL、2×TaqMasterMix10μL、所反轉錄的cDNA溶液1μL、10μmol/L的上游引物各0.5μL，反應體系共計20μL。經(jīng)充分混勻后瞬時離心使液體全部聚集于管底。PCR擴增條件：95℃預變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，延伸1min，循環(huán)30次；72℃延伸10min。擴增反應結束后立即進行電泳或置于4℃條件下備用。C.4.4擴增產(chǎn)物電泳檢測制備1.0%瓊脂糖凝膠板。在