蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的方法

關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的方法第2頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)國內(nèi)外研究動態(tài)在國際上,美國首先提出大規(guī)模測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計劃,現(xiàn)在已經(jīng)進入第二期的產(chǎn)出階段.其他發(fā)達國家(歐盟和日本)也相繼啟動自己的結(jié)構(gòu)基因組計劃.我國根據(jù)美國第一期的試驗計劃,發(fā)現(xiàn)X射線晶體學(xué)仍然是測定結(jié)構(gòu)的主要手段,這與預(yù)期的結(jié)果相符.過去和現(xiàn)在情況都是這樣,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的80%的結(jié)構(gòu)來自X射線衍射.其他有重要貢獻的手段有核磁共振和低溫冷凍電鏡(cryo2EM).由于這三種方法的重要性,最近幾年,它們都有很大的改進.

理論方法的進展也非?？?與實驗的結(jié)合也越來越緊密.尤其是蛋白質(zhì)折疊的機制成為研究的熱點和焦點.第3頁,共26頁，2024年2月25日，星期天預(yù)測蛋白質(zhì)構(gòu)象的理論方法蛋白質(zhì)折疊的成核理論同源模型方法分子動力學(xué)蒙特卡羅方法折疊識別法線索化方法混合方法從頭預(yù)測法等。。。。。。第4頁,共26頁，2024年2月25日，星期天同源模型方法任何兩種蛋白質(zhì)，如果它們的序列等同部分超過30％，它們就具有相似的空間結(jié)構(gòu)，即兩個蛋白質(zhì)的基本折疊相同，只是在非螺旋和非折疊區(qū)域的一些細節(jié)部分有所不同。據(jù)此，同源模型法的基本思想是：對一個未知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，首先通過同源分析找到一個已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)，然后，以該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)為模板，為未知蛋白質(zhì)建立空間結(jié)構(gòu)模型。分子動力學(xué)蛋白質(zhì)動態(tài)構(gòu)象模擬的最常用的計算方法是分子動力學(xué).分子動力學(xué)是在相空間(位置和動量空間)中計算系統(tǒng)隨時間變化的軌跡.對系統(tǒng)的系綜平均就是對系統(tǒng)在時間軌跡上的平均.第5頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

測定蛋白質(zhì)構(gòu)象的實驗方法方法提供的結(jié)構(gòu)信息主要指標應(yīng)用X-光衍射除了氫以外肽鏈所有原子排布衍射點的強度和位置最重要NMR溶液蛋白構(gòu)象；構(gòu)象動力學(xué)化學(xué)位移；譜線強度；自璇耦合常數(shù)越來越多很重要CD二級結(jié)構(gòu)及變化橢圓度很多熒光光譜芳族氨基酸微區(qū)；構(gòu)象變化發(fā)射、激發(fā)光譜量子產(chǎn)率很多紫外差光譜芳族氨基酸微區(qū)；構(gòu)象變化吸收變化很多STM表面原子結(jié)構(gòu)分布隧道電流及其變化較多氫同位素交換規(guī)則二級結(jié)構(gòu)；氫鍵數(shù)目與環(huán)境水不可交換的肽鍵氫的數(shù)目較少激光拉曼光譜二級結(jié)構(gòu)拉曼光譜尚不成熟小角中子衍射肽鏈所有原子排布散射強度的角分布起步不久第6頁,共26頁，2024年2月25日，星期天一溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的研究方法:利用各種光譜學(xué)方法測定不同條件下蛋白質(zhì)溶液光譜性質(zhì)的差異，來確定其構(gòu)象，以及與功能的關(guān)系

（一）吸收光譜：用不同波長光照射蛋白，檢測透光強度，以吸光度A~波長λ作圖。常溫，低溫蛋白質(zhì)吸收來自兩個部分：可見光區(qū)(400-770nm)：來自配基，如CytcTrp=280nm

紫外區(qū)(200-400nm)：蛋白本身Tyr=275nmPhe=257nm

肽基團=190~225nm可見光吸收譜，紫外吸收光譜第7頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（二）熒光光譜法

（fluorescencespectrum):有些物質(zhì)吸收入射光后經(jīng)過一段很短時間,

（10-9~10-8s）又發(fā)射出波長比原來長的光——熒光激發(fā)能的耗散：①熱運動②傳遞給相鄰分子③發(fā)熒光形式蛋白自身的熒光:λTrp=348nm；λPhe=282nm；

λTyr=303nm

配基的熒光:如葉綠素，F(xiàn)AD、藻膽素等結(jié)合人工熒光探針的熒光量子產(chǎn)率（量）：Q=發(fā)射的熒光光子數(shù)吸收的光子數(shù)

第8頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（三）圓二色譜(CD)

原理:偏振面：電場矢量的平面。平面偏振光（planepolarizedlight)：僅在固定方向上有振動的光。圓偏振光：兩個電場矢量互相垂直、位相相差1/4的平面偏振光加成的光，電場矢量的尖端沿螺旋線前進，從光的傳播方向看好似做圓周運動——circularlypolarizedlight右圓偏振光：面對光源電場矢量順時針轉(zhuǎn)動左圓偏振光：面對光源電場矢量逆時針轉(zhuǎn)動EH入傳播方向第9頁,共26頁，2024年2月25日，星期天光源自然光單色器

單色光起偏振器平面偏光電光調(diào)制器左、右園偏振光照射樣品記錄CD譜應(yīng)用：游離aa無圓二色性，所以

CD譜只與構(gòu)象有關(guān)。

圓二色性（CD，circulardichroism）

旋光物質(zhì)對左、右圓偏振光吸收不同，導(dǎo)致振幅變化，從而產(chǎn)生橢圓偏振光的現(xiàn)象。第10頁,共26頁，2024年2月25日，星期天意義：核磁共振波譜技術(shù)是能夠在原子分辨率下測定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的唯一方法應(yīng)用：(Ⅰ)研究生物大分子及其復(fù)合物在溶液中的三維結(jié)構(gòu)和功能;(Ⅱ)研究動態(tài)的生物大分子之間以及與配基的相互作用;(Ⅲ)研究生物大分子的動態(tài)行為;(Ⅳ)用固體核磁共振或液體核磁共振技術(shù)研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能;(Ⅴ)研究蛋白質(zhì)折疊,折疊動力學(xué);(Ⅵ)用于藥物篩選與設(shè)計;(Ⅶ)研究代謝組學(xué);(Ⅷ)研究活細胞中的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用;(Ⅸ)核磁成像用于認知科學(xué)研究.（四）核磁共振(NMR，nuclear

magneticresonance)：第11頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

原理:

自旋量子數(shù)I≠0的原子核可旋轉(zhuǎn)并帶電，因此而產(chǎn)生磁矩(

)，在外加電場作用下沿磁場方向取向，同時發(fā)生能級分裂（占有能級數(shù)為2I+1），相鄰能級能量差都是△E。當能量為△E=h

電磁波通過時，低能核可吸收電磁波而產(chǎn)生躍遷——核磁共振

第12頁,共26頁，2024年2月25日，星期天NMR譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系：化學(xué)位移:

電子云→感生磁場→對核形成屏蔽由于電子云產(chǎn)生的感生磁場的屏蔽作用，引起共振時外加磁場強度的移動?；瘜W(xué)位移大小反映出原子核所處的化學(xué)環(huán)境、在分子中的排布，從而確定基團的性質(zhì)自旋耦合：

自旋核的磁距通過成鍵電子影響鄰近的核，引起后者共振譜線分裂而增多，這種相互作用——自旋耦合產(chǎn)生核磁共振的方法：掃描頻率：固定外加磁場，改變射頻電磁波頻率磁場掃描：固定射頻電磁波頻率，改變外加磁場強度第13頁,共26頁，2024年2月25日，星期天NMR類型：

1H-NMR；13C-NMR等一維譜:吸收峰強度對一個頻率變量作圖多維譜（二維、三維）NMR技術(shù)在測定生物大分子結(jié)構(gòu)方面的優(yōu)點:①不破壞生物分子的結(jié)構(gòu)

②能在溶液環(huán)境下測定大分子空間結(jié)構(gòu)，測定結(jié)構(gòu)更接近生物分子的天然狀態(tài)③能研究大分子內(nèi)部的構(gòu)象動力學(xué)④分辨率較高，是測定溶液中大分子構(gòu)象的最佳的方法，與X-光晶體衍射法互為補充

第14頁,共26頁，2024年2月25日，星期天STM的工作原理：掃描隧道顯微鏡的工作原理是基于量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。對于經(jīng)典物理學(xué)來說，當一個粒子的動能E低于前方勢壘的高度V0時，它不可能越過此勢壘，即透射系數(shù)等于零，粒子將完全被彈回。而按照量子力學(xué)的計算，在一般情況下，其透射系數(shù)不等于零，也就是說，粒子可以穿過比它能量更高的勢壘，這個現(xiàn)象稱為隧道效應(yīng)。（五）掃描隧道顯微技術(shù)（STM，

scanningtunnelingmicroscope）：第15頁,共26頁，2024年2月25日，星期天掃描隧道顯微鏡的基本原理是將原子線度的極細探針和被研究物質(zhì)的表面作為兩個電極，當樣品與針尖的距離非常接近(通常小于1nm)時，在外加電場的作用下，電子會穿過兩個電極之間的勢壘流向另一電極。（隧道探針一般采用直徑小于1mm的細金屬絲，如鎢絲、鉑-銥絲等，被觀測樣品應(yīng)具有一定的導(dǎo)電性才可以產(chǎn)生隧道電流）第16頁,共26頁，2024年2月25日，星期天結(jié)構(gòu)分析用的是單色X-射線，其波長在1A數(shù)量級，相當于分子中原子之間的距離。用于結(jié)構(gòu)分析用的儀器是X-射線儀。由X-射線管、濾波器、高壓系統(tǒng)（30-50KV)、真空系統(tǒng)(10-4-10-5mmHg柱）和照相機組成。工作原理：由X-射線管產(chǎn)生的各種波長的X-射線，經(jīng)過濾波器（如鎳片等）得到一定波長的單色X-射線。單色X-射線通過晶體，產(chǎn)生衍射線，用照相機記錄下來，得到衍射圖，然后，通過對衍射斑點的位置與強度的測定與計算，并參照化學(xué)分析的結(jié)果，就可確定晶體結(jié)構(gòu)。即：光學(xué)-實像，通過FT轉(zhuǎn)變。二蛋白晶體結(jié)構(gòu)研究

——x光晶體衍射技術(shù)第17頁,共26頁，2024年2月25日，星期天1基本知識:(1)X-射線：波長0.01~10nm的電磁波(單色X-ray0.1~1nm)

高能電子(50kv)轟擊Cu靶產(chǎn)生CuX-ray（主要

=1.52A°）。最大分辨率=

/2；而原子間距離為0.1nm，所以能分辨原子之間的相互關(guān)系。（2）晶胞（unitcell）:*晶體：離子晶體、原子晶體或分子晶體*晶胞：平面六面體所形成的重復(fù)單位*晶胞參數(shù)：包括a,b,c三個邊長及三者的夾角

,,

abc第18頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（3）布拉格（Bragg）方程：

d波程差=BD+CD=2d·sinθ=n·

X-rayX-ray在空間的三個方向上都符合該方程，可以求出晶胞的三個邊長θθBCDθθ第19頁,共26頁，2024年2月25日，星期天(4)分辨率:分辨率：所能分清的兩相鄰質(zhì)點的最小間距分辨力:儀器或肉眼所能分清的兩相鄰質(zhì)點的最小間距的能力

若分辨率小于0.6nm：只能反映蛋白的大致輪廓小于0.45nm：可分辨多肽鏈的走向小于0.25nm：可分辨?zhèn)孺溞螒B(tài)和方向

0.15nm以下：可分辨原子間的相互關(guān)系第20頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

2衍射分析方法：

單晶回轉(zhuǎn)法；粉末法；纖維法等單晶回轉(zhuǎn)法基本原理：

(1)制備蛋白單晶:

要求均一,大小>0.1mm(2)重原子同晶衍生物:

把蛋白晶體浸在重原子（Pt、

Au、Hg、Pb等）緩沖液中，使重原子進入到蛋白晶體中。

(3)X-射線衍射及數(shù)據(jù)的收集（衍射點的亮度、位置等）

(4)衍射數(shù)據(jù)的分析（晶胞體積、結(jié)構(gòu)振幅、衍射相角）從而繪制電子云密度圖

(5)蛋白結(jié)構(gòu)解析和校正:密度大的地方即原子所在部位

入射線Rr第21頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)蛋白質(zhì)結(jié)晶過程像其他小分子物質(zhì)一樣，是一個有序化過程，即在溶液中處于隨機狀態(tài)的分子轉(zhuǎn)變成有規(guī)則排列狀態(tài)的固體。一般認為要使這種有序化過程開始必須要形成一定大小的晶核，并使分子不斷地結(jié)合到形成的晶核上。而一個蛋白質(zhì)溶液能開始形成晶核，就必須使溶液達到過飽和，并保持一定的條件，使溶液中的分子失去自由運動的能量