酶免疫組化實(shí)驗(yàn)

關(guān)于酶免疫組化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握免疫組化技術(shù)的基本原理。2、掌握檢測(cè)T細(xì)胞表面分子CD3的實(shí)驗(yàn)原理及檢測(cè)方法。3、掌握SABC免疫放大技術(shù)原理。第2頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistrytechnique,IHCT）是指在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，借助可見(jiàn)的標(biāo)記物，對(duì)抗原抗體進(jìn)行定位、定性和定量檢測(cè)的一種免疫檢測(cè)方法。

抗原抗體反應(yīng)的特異性組織化學(xué)的可見(jiàn)性第3頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天分類(lèi)酶免疫組化技術(shù)熒光免疫組化技術(shù)親和免疫細(xì)胞組化技術(shù)免疫金（銀）細(xì)胞染色組化技術(shù)免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)雜交免疫細(xì)胞組化技術(shù)第4頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶免疫組化技術(shù)酶免疫組化技術(shù)是直接以細(xì)胞或組織切片為抗原相，以酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)抗原或抗體的存在與否或定位的一類(lèi)酶免疫技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)以酶免疫組化技術(shù)檢測(cè)CD3為例。以親和素-生物素-過(guò)氧化物酶（ABC或SABC）技術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群為例驗(yàn)證酶免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)組織抗原的方法。第5頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶免疫組化染色中常用的酶及顯示底物最常用的酶是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）常用的供氫體：

二氨基聯(lián)苯胺（DAB）—反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）—反應(yīng)產(chǎn)物呈橘紅色

4-氯-1-萘酚—反應(yīng)產(chǎn)物呈灰藍(lán)色第6頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天生物素-親和素放大技術(shù)是一種以生物素(biotin，B)和親和素(avidin，AV)具有的多級(jí)放大結(jié)合特性為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它既能偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，又可被熒光素、酶、放射性核素等材料標(biāo)記，與標(biāo)記免疫技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，極大提高了分析測(cè)定的靈敏度。特點(diǎn)：靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、適用性常見(jiàn)類(lèi)型：BAB法和ABC法第7頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天ABC法原理1、預(yù)先按一定比例將親和素（或鏈霉親和素）與酶標(biāo)生物結(jié)合，形成可溶的親和素（或鏈霉親和素）-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC或SABC）。2、當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化二抗（間接法）相遇時(shí)，ABC（或SABC）中未飽和的親和素結(jié)合部位就可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原-抗體反應(yīng)與ABC（或SABC）標(biāo)記體系連成一體進(jìn)行檢測(cè)。第8頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)

一個(gè)親和素（A）有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)過(guò)氧化物酶可結(jié)合多個(gè)生物素分子，ABC法將親和素作為“橋”把生物素化的抗體與生物素結(jié)合的酶連接起來(lái)，形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)狀復(fù)合物，其中網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，因此應(yīng)用于檢測(cè)體系時(shí)，極大提高酶在抗原-抗體反應(yīng)中的濃度，提高檢測(cè)敏感性。第9頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)原理將分離得到的淋巴細(xì)胞制成涂片，加入的CD3單克隆抗體與待檢單個(gè)核細(xì)胞涂片作用。

CD3陽(yáng)性的細(xì)胞就會(huì)與CD3單克隆抗體特異性結(jié)合，再用生物素化抗鼠IgG檢測(cè)CD3單抗與待檢細(xì)胞結(jié)合的情況。最后加入鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶(ABC橋聯(lián)法)，與生物素化抗鼠IgG結(jié)合，酶遇到底物時(shí)，能催化底物產(chǎn)生有色不溶性產(chǎn)物。根據(jù)細(xì)胞被底物著色的情況可以判定CD3陰性和陽(yáng)性的細(xì)胞，測(cè)定其陽(yáng)性百分率。第10頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天SABCB-山羊抗鼠IgG抗體鼠抗CD3單抗CD3T淋巴細(xì)胞間接ABC法：CD3——鼠抗CD3單抗——B-山羊抗鼠IgG抗體——SABC第11頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)器材與試劑1、5%BSA

2、抗CD3單克隆抗體3、生物素化羊抗鼠IgG(二抗)4、鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶(SABC)5、3,3,-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)6、0.0lmol/LpH7.2PBS7、淋巴細(xì)胞分離液8、丙酮9、玻片、吸水紙、顯微鏡等第12頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)步驟1、無(wú)菌采集靜脈血3ml/2人，注入盛有肝素的無(wú)菌試管中（肝素濃度為20U/ml全血），立即輕輕搖勻，使血液抗凝。2、用無(wú)菌吸管加入等體積即3ml的室溫PBS液，使血液等倍稀釋。第13頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、取10ml試管2支，分別加入1.5ml淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll），將離心管傾斜45

角，在距分層液界面上1cm處將稀釋血液沿試管壁緩慢加至分層液上面，每管3ml，注意保持兩者界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)。第14頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、2000轉(zhuǎn)/分離心30min，離心后另取1只10ml試管，加入6mlPBS液，用毛細(xì)吸管輕輕插到白膜層，取吸淋巴細(xì)胞層至此試管中，1500轉(zhuǎn)/分離心10min洗滌2次。5、第2次洗滌后棄去上清，用移液器將沉淀細(xì)胞和試管壁所剩PBS液（約200ul）混勻，吸取20ul細(xì)胞懸液于潔凈載玻片上，制成涂片，自然干燥。第15頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天6、純丙酮固定20min，雙蒸水洗去多余丙酮，自然干燥。7、在標(biāo)本處滴加5%BSA封閉液50ul，室溫封閉10min，甩去多余液體，不洗。8、滴加鼠抗人CD3單抗50ul，置濕盒中37℃作用1h。第16頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定的目的使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，細(xì)胞內(nèi)分解酶反應(yīng)終止，以防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。保存組織細(xì)胞抗原性防止標(biāo)本脫落除去妨礙抗體結(jié)合的類(lèi)脂，便于保存抑制組織中細(xì)菌的繁殖，防止組織腐敗和后續(xù)組織制備中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分的改變第17頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天9、PBS洗3次，每次2min，用吸水紙將細(xì)胞周?chē)粮伞?0、加B-山羊抗小鼠IgG抗體50ul，置濕盒中37℃作用20min。11、重復(fù)9。12、加SABC50ul，置濕盒中37℃作用20min。13、重復(fù)9。第18頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天14、加DAB50ul，室溫10～13分鐘，雙蒸水洗。（DAB需現(xiàn)配現(xiàn)用，即將A、B、C液各1滴加入1ml雙蒸水中混合）15、加蘇木素染液復(fù)染30s。16、加蓋玻片鏡檢。第19頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定陽(yáng)性細(xì)胞染成棕黃色，陰性