表面彩虹上的超分辨率光譜位移傳感

一、引言基于成像的傳感技術(shù)是實現(xiàn)生物或化學方面一些重要信息可視化的主要工具。然而，由于經(jīng)典光學存在衍射極限，為了實現(xiàn)更好的成像能力，傳統(tǒng)的光學成像系統(tǒng)通常需要龐大的體積，并且價格昂貴。微型納米等離子體結(jié)構(gòu)中納米尺度上的超慢波可以改善光與物質(zhì)的相互作用，其獨特的潛力備受關(guān)注。特別地，超材料中光的“彩虹”儲存和漸變的等離子體光柵結(jié)構(gòu)，為在芯片上操縱光開辟了全新的、有吸引力的方法。近期對各種納米光子結(jié)構(gòu)的研究表明，可以通過系統(tǒng)地改變表面光柵的幾何參數(shù)（如凹槽深度和光柵周期）來調(diào)節(jié)光柵表面的色散特性。絕熱漸變光柵的色散關(guān)系隨空間位置單調(diào)變化，因此不同波長的入射光可以被“捕獲”或定位到光柵傳播方向的不同位置。我們相信，這種類型的芯片上波長分離功能將促使光譜儀平臺微型化，未來可應(yīng)用于光學集成。最近，一些漸變等離子體光柵結(jié)構(gòu)和全介電超表面也實現(xiàn)了類似的波長分離功能，并且人們設(shè)計了令人興奮的基于芯片成像的傳感系統(tǒng)。對于這些基于成像、強度調(diào)制和（或）波長調(diào)制的傳感機制，關(guān)鍵挑戰(zhàn)是如何精準確定空間信息，這與超分辨率成像所面臨的挑戰(zhàn)類似；也就是說，需要具備在空間位置或波長域檢測納米位移的能力。這是實現(xiàn)超靈敏片上成像和傳感技術(shù)的關(guān)鍵。二、設(shè)計原則在這里，我們展示了一種等離子體超表面去捕獲“彩虹”，以實現(xiàn)對等離子體共振引起的空間模式偏移的超分辨率識別，這可以通過低設(shè)置光學顯微鏡成像系統(tǒng)實現(xiàn)。如圖1（a）所示，在不透明金屬膜上制備了具有漸變幾何參數(shù)的淺金屬表面光柵（270nm厚；參見下一節(jié)的制備細節(jié)）。根據(jù)局部幾何形狀的不同，寬帶入射光的不同入射波長可以有效地耦合到漸變超表面上的表面等離子體激元（SPP），從而產(chǎn)生芯片上的“彩虹”共振分布。圖1.漸變“彩虹”捕獲超表面。（a）超表面捕獲“彩虹”的示意圖。（b）漸變光柵的SEM圖像。整體尺寸為30μm×64μm。底部插圖顯示了從樣本左邊緣到右邊緣的周期差異（比例尺：20μm）。（c）漸變光柵在白光照明下的反射圖像（用4×顯微鏡觀察；比例尺：20μm）。（d）不同入射波長（比例尺：20μm）下，單色光反射圖像俯視圖（上部面板）及其相應(yīng)的近場（下部面板）仿真電場分布側(cè)視圖。圖1（b）顯示了總尺寸為30μm×64μm的漸變表面光柵的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。根據(jù)原子力顯微鏡（AFM）圖像的表征，表面光柵的平均深度為35.6nm±0.4nm（表征結(jié)果見附錄A中的圖S1）。光柵的周期從250nm以5nm的變化步長漸變到850nm（SEM表征參見附錄A中的圖S2）。在白光照明下，我們記錄了光柵的反射圖像，圖像顯示出清晰的彩虹色，如圖1（c）所示（光學測量詳見附錄A第S3節(jié)和圖S3）。由于彩虹捕獲效應(yīng)引入的空間波長分離對局部介電環(huán)境擾動十分敏感，可以在片上進行空間位移成像和傳感。為了分析“彩虹”捕獲機制，通過液晶可調(diào)諧濾光片引入4個窄帶入射光（即500nm、530nm、590nm和650nm）來照亮樣品。它們相應(yīng)的灰度俯視圖（每個波長的圖像的上部面板）如圖1（d）所示。由于SPP模式的有效耦合，在不同位置可以清晰地觀察到暗條紋。為了揭示這種漸變超表面的物理性質(zhì)，我們進行了二維（2D）時域有限差分（FDTD）仿真，以繪制SPP模式發(fā)射的近場分布，該仿真清楚地顯示出沿漸變表面光柵的“彩虹”耦合。如圖1（d）中的下部面板所示，2D電場分布圖表明，SPP可以在漸變超表面的不同區(qū)域發(fā)射和定位（即用于捕獲“彩虹”；仿真細節(jié)參見附錄A中的第S4節(jié)）。結(jié)果表明，表面光柵的遠場反射圖像中出現(xiàn)了一個暗區(qū)域，這與實驗觀測結(jié)果能夠很好地吻合。有趣的是，遠場中的反射暗紋[即圖1（d）中的上部暗紅色箭頭]對應(yīng)于漸變光柵表面上的局部SPP模式[即圖1（d）的底部紅色箭頭]。當入射波長或表面折射率改變時，近場和遠場特性都會發(fā)生相應(yīng)改變（見第S4節(jié)）。最敏感的傳感區(qū)域位于漸變超表面上的捕獲SPP模式區(qū)域內(nèi)，由于超表面捕獲“彩虹”的獨特耦合和散射特性，該區(qū)域與遠場散射暗區(qū)略有不同（詳見附錄A第S4節(jié)和圖S4）。因此，通過使用簡單且廉價的光學元件監(jiān)測遠場反射暗紋的空間偏移，可以實現(xiàn)新穎且強大的片上光譜分析和表面?zhèn)鞲袘?yīng)用。三、材料和方法熔融二氧化硅晶圓（SemiconductorWafer,Inc.）分別用丙酮、甲醇和去離子水在超聲波清洗機中依次超聲清洗10min。隨后使用電子束蒸發(fā)設(shè)備（AXXIS,KurtJ.LeskerCompany）以0.02nm?s-1的沉積速率在熔融石英晶片上沉積5nm厚的鈦（Ti）黏附層，然后再沉積270nm厚的金（Au）膜。使用AURIGACrossBeam（CarlZeissAG）聚焦離子束（FIB）-SEM進行FIB刻蝕和SEM表征。所有凹槽寬度均設(shè)置為180nm。利用這種結(jié)構(gòu)的“彩虹”捕捉超表面，我們隨后開發(fā)了一種超分辨率位移光譜成像儀。四、結(jié)果與討論（一）捕獲“彩虹”超分辨率位移光譜成像儀這里，我們首先展示了一種片上的“彩虹”光譜成像儀，通過選擇5個窄帶波長來照亮樣品[圖2（a）]。由于SPP模式取決于入射光的入射角，因此需要保證入射光的準直，以控制入射光的耦合。因此，我們引入了一個4×物鏡來觀察反射圖像，其數(shù)值孔徑（NA）為0.13（對應(yīng)最大入射角為7.47°）。在這種情況下，由于SPP模式的有效耦合，可以清楚地觀察到暗條紋[圖2（b）]。有趣的是，當入射波長從560nm以30nm的步長調(diào)整到680nm時[圖2（a）]，暗條紋也相應(yīng)地發(fā)生了移動[圖2（b）]。因此，通過解析暗條紋的空間位置，可以實現(xiàn)片上光譜分析。在這種基于成像的設(shè)備中，傳統(tǒng)光譜儀中用于獲得高光譜分辨率的光學衍射光柵和長光路被片上的“彩虹”捕獲超表面所取代，該超表面可以通過電荷耦合器件（CCD）或互補金屬氧化物半導(dǎo)體器件（CMOS）相機直接成像。值得注意的是，如下文所演示的，這種片上成像光譜儀的光譜分辨率遠遠超過成像系統(tǒng)的衍射極限。圖2.4×物鏡觀察到的用于光譜分析的捕獲“彩虹”定位圖像。（a）用常規(guī)光纖光譜儀測量入射光譜（a.u.：任意單位）；（b）5種特定波長照射下的反射圖像；（c）每個波長50幀的質(zhì)心定位。所有質(zhì)心均位于0.02像素范圍內(nèi)。右側(cè)面板：在每個波長觀察到的50個質(zhì)心的放大視圖。在傳統(tǒng)的光譜位移應(yīng)用中（例如，等離子體生物傳感的波長調(diào)制），通過共振峰或谷位置變化的擬合來顯示傳感器表面折射率的痕量變化。因此，在更靈敏的光譜分析和傳感應(yīng)用中，波長偏移識別需要更高的分辨率。在圖2（b）所示的實驗中，圖像通過4×物鏡的顯微鏡獲得。在此放大倍數(shù)下，每個像素對應(yīng)約1.6μm的空間尺寸。因此，低配置成像系統(tǒng)限制了這種片上光譜儀的物理分辨率。特別地，由于光柵耦合器的帶寬相對較寬，這些暗條紋的共振谷位置不清晰（附錄A中的圖S5）。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，我們借用超分辨率成像的概念來識別圖案的物理或幾何質(zhì)心（例如，使用點擴散函數(shù)來提取熒光染料分子的質(zhì)心）。對于圖2（a）所示的每個波長，我們捕獲了50幀（每幀0.2s）的圖像，并計算了它們的質(zhì)心（詳見附錄A第S6節(jié)）。如圖2（c）所示，每個波長的50個質(zhì)心都位于沿x軸的0.02個像素區(qū)域內(nèi)。值得注意的是，5幅圖像的標準差（SD）都在35nm以內(nèi)[見圖2（c）的右側(cè)面板]。因此，波長分辨率不受實際像素大?。ù蠹s為1.6μm）或衍射極限[λ/(2NA)，對于從560nm調(diào)整到680nm的入射波長，衍射極限范圍從2.04μm到2.50μm]的限制，而是受提取的質(zhì)心定位區(qū)域（即小于35nm×85nm）限制，該區(qū)域遠遠超過此4×光學顯微鏡系統(tǒng)的光學分辨率。例如，波長為560nm和590nm的兩個定位位置的空間距離約為8.8μm[如圖2（c）中的虛線和箭頭所示]?？紤]到這兩個波長的質(zhì)心定位SD，可以獲得該成像儀的波長分辨率。接下來，我們將進行更精細的控制實驗，以揭示“彩虹”定位成像光譜儀的波長識別能力。為了揭示捕獲“彩虹”對質(zhì)心定位的潛力，我們制造了一種周期變化小得多的新結(jié)構(gòu)（即從460nm以1nm的步長變化到540nm）。如圖3（a）所示，我們將入射光的峰值波長從548.0nm調(diào)諧到549.5nm，步長為0.3nm。這種波長偏移分辨率接近本實驗中使用的光纖光譜儀的極限。在這6個精細分離的波長的照明下，我們使用4×物鏡記錄了漸變光柵的暗條紋，如圖3（a）的右側(cè)面板所示。這些原始圖像展示了用肉眼很難分辨的暗條紋的空間偏移（詳細圖像見附錄A中的圖S7）。相比之下，圖3（b）中繪制了暗條的質(zhì)心位置。值得注意的是，這些質(zhì)心定位可以清晰地分開，沒有空間重疊，如圖3（b）的下部面板所示。當入射波長從548.0nm調(diào)整至549.5nm時，質(zhì)心偏移約0.74像素，預(yù)估波長偏移分辨率為0.032nm（詳見附錄A第S8節(jié)中的表S1）。檢測的空間極限（即SD的3倍）約為0.0766μm，遠小于該4×顯微鏡的像素大小或衍射極限（分別約為1.61μm和2.12μm），這表明用質(zhì)心數(shù)據(jù)處理方法揭示“彩虹”捕獲光柵結(jié)構(gòu)的超分辨能力。為了進一步揭示波長分辨率，我們使用了一個20×的遠距離工作物鏡來觀察捕獲的“彩虹”。在這種情況下，每個像素對應(yīng)約0.32μm的尺寸。透鏡的NA為0.25，對應(yīng)于約14.48°的最大入射角。因此，由于耦合和收集角度不同，暗條紋區(qū)域與4×物鏡觀察到的區(qū)域略有不同，如圖3（c）所示。為了將暗條紋調(diào)整到樣品的中心，我們將入射光的峰值波長從539.0nm以0.3nm的步長調(diào)諧到540.5nm。相應(yīng)的質(zhì)心定位如圖3（d）所示，結(jié)果表明當入射波長調(diào)諧1.5nm時，總空間位移約為0.39μm。值得注意的是，該圖像中質(zhì)心定位區(qū)域的SD優(yōu)于4×成像系統(tǒng)。在該20×物鏡下觀察到的波長分辨率約為0.029nm（詳見附錄A第S8節(jié)中的表S2）。這一結(jié)果表明，使用高倍物鏡可以提高分辨率。圖3.捕獲“彩虹”定位顯微光譜儀的光譜位移分辨率。（a）~（d）在空氣中觀察：（a）左側(cè)面板是測量的入射光光譜，峰值范圍為548.0~549.5nm，右側(cè)面板是6個入射波長照明下的4×物鏡的顯微反射圖像；（b）每個波長50幀的質(zhì)心定位（上部面板）和平均質(zhì)心位置及其對應(yīng)的SD（下部面板；詳見表S1）；（c）左側(cè)面板是峰值范圍為539.0~540.5nm的入射光的測量光譜，右側(cè)面板是20×顯微反射圖像；（d）每個波長的質(zhì)心定位（上部面板）和平均質(zhì)心位置（下部面板）。（e）~（h）在水中觀察：（e）左側(cè)面板為測量的入射光光譜，峰值范圍為696.0~701.0nm，右側(cè)面板為4×物鏡的顯微反射圖像；（f）質(zhì)心定位（上部面板）和平均質(zhì)心位置（下部面板）；（g）左側(cè)面板是峰值范圍為636.0~641.0nm的入射光的測量光譜，右側(cè)面板是20×物鏡的顯微反射圖像；（h）這6個入射波長的質(zhì)心定位（上部面板）和平均質(zhì)心位置（下部面板）。（i）不同濃度的甘油（G）-水溶液在4×（藍色曲線）和20×（紅色曲線）物鏡下“彩虹”表面光柵圖案的實時質(zhì)心運動響應(yīng)。作為對照實驗，我們還對商用光纖光譜儀測量的光譜的質(zhì)心定位進行了表征。測量光譜的SD約為0.047nm（對應(yīng)于約0.020nm的波長偏移分辨率；詳見附錄A第S9節(jié)中的表S5）。因此，我們的“彩虹”光柵結(jié)構(gòu)在進行質(zhì)心處理時，可以實現(xiàn)與商用光譜儀相似的波長位移分辨率。重要的是，它們的區(qū)別在于基于成像的片上光譜儀可以解析來自非常小區(qū)域（30μm×64μm~50μm×250μm范圍內(nèi)的“彩虹”光柵區(qū)域，即0.00192~0.0125mm2）的光譜信息，這表明我們的“彩虹”光柵結(jié)構(gòu)具有2D光譜成像的應(yīng)用潛力，而使用傳統(tǒng)的光纖光譜儀去實現(xiàn)這一目標仍有很大挑戰(zhàn)。（二）折射率傳感為了演示這種“彩虹”捕獲芯片如何應(yīng)用于表面生物傳感，我們制造了一個周期從400nm漸變到490nm的新型漸變光柵[觀察到的結(jié)果如圖3（e）~（h）所示]。如圖3（e）和（g）中的右側(cè)面板所示，在696~701nm入射光[4×物鏡，圖3（e）]和636~641nm入射光[20×物鏡，圖3（g）]的照射下，水環(huán)境中的暗條紋被調(diào)整到結(jié)構(gòu)的中心。由此可估算波長偏移分辨率大約為0.047nm[圖3（f）中的4×物鏡，詳見附錄A第S8節(jié)表S3）]和0.033nm[圖3（h）中的20×物鏡；詳見附錄A第S8節(jié)表S4]，由于液體環(huán)境波動較大，因此分辨率略低于空氣環(huán)境中的計算分辨率[即圖3（b）和（d）]。接下來，我們引入了一系列甘油-水溶液（即濃度分別為0、3%、6%和9%）來調(diào)節(jié)液體環(huán)境的折射率（實驗細節(jié)見附錄A第S10節(jié)）。如圖3（i）所示，當空間折射率在0~9%之間變化時，質(zhì)心位置會移動。20×物鏡（紅色曲線）觀測數(shù)據(jù)的噪聲為0.0131μm，略優(yōu)于4×物鏡觀測數(shù)據(jù)的噪聲（即0.0405μm，藍色曲線）。由于每個幀的數(shù)據(jù)采集時間（即每幀0.2s）與相鄰幀之間的等待時間（即15s）都快于空間折射率的變化速度，所以結(jié)果可以準確地反映空間折射率的變化曲線。因此，測量的體折射率傳感分辨率分別為3.29×10-4折射率單位（RIU；對于4×物鏡而言）和9×10-3

RIU（對于20×物鏡而言）?？紤]到傳感器面積為0.002mm2，該芯片有望應(yīng)用于生物傳感。更具體地說，在一個20×物鏡的觀察下，預(yù)計可以分辨大約500個外泌體（詳情見附錄A第S11節(jié)）。使用更高端的光源和噪聲更低的攝像頭可以獲得更好的傳感性能，此想法目前正在研究中。接下來，我們將使用這種片上成像儀來演示生物分子（即外泌體）的特異性傳感。（三）外泌體表皮生長因子受體的片上傳感用于肺癌診斷近期研究表明，外泌體表皮生長因子受體（EGFR）將作為肺癌診斷中的一個重要生物標記物，因為它在50%以上的肺癌病例中都存在過度表達。這里，我們展示了“彩虹”捕獲芯片在癌癥診斷中的潛在應(yīng)用，將肺癌作為疾病模型，外泌體EGFR作為生物標記物[圖4（a）；詳見附錄A第S12節(jié)]。如圖4（b）所示，在同一片上制造了一個2×2漸變光柵陣列（共4個傳感器單元，周期從400nm到490nm）。在650nm窄帶光照下，液體環(huán)境中同時觀察到4個光柵上的暗條紋。在傳感器表面頂部引入了一系列表面層，以實現(xiàn)外泌體EGFR的選擇性傳感[圖4（c）；表面處理詳情見第S12節(jié)]。在此過程中，遠場成像儀每隔15s記錄一次4個傳感器單元的反射圖像，以監(jiān)測是否發(fā)生表面結(jié)合。通過暗條紋的質(zhì)心位置提取，外泌體EGFR的表達通過以下公式計算：式中，Pwater、PPBS和PEGFR+exosome分別是水、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、EGFR和外泌體的質(zhì)心位置。Pwater和PPBS之間的差值作為歸一化因子，用于將不同芯片之間的差異最小化。我們首次測量了A549非小細胞肺癌（NSCLC）細胞外泌體中EGFR的表達[圖4（d）]。A549細胞衍生的外泌體以2×1010個?mL-1的濃度流過生物芯片?；谫|(zhì)心移動的分析，外泌體EGFR表達水平為0.3357，具有10.39的高信噪比。使用A549細胞衍生外泌體，“彩虹”捕獲芯片的分辨率為1.92×109個?mL-1。由于血清中的典型的外泌體濃度為5×1012個?mL-1，這表明檢測外泌體EGFR可能只需要1μL的血清樣本。圖4.肺癌診斷傳感器陣列。（a）將“彩虹”捕獲超表面用于肺癌診斷的示意圖。（b）具有4個相同漸變超表面結(jié)構(gòu)的傳感器陣列的SEM圖像。（c）帶有捕獲EGFR和外泌體（PEG：聚乙二醇）的表面光柵示意圖。（d）、（e）質(zhì)心位移的實時響應(yīng)。（d）A549和（e）健康對照1（藍色曲線）和患者1（紅色曲線）樣本外顯體吸附在傳感器表面時的實時響應(yīng)。（f）通過片上的4個傳感器單元測量健康對照組和NSCLC患者樣本的EGFR外泌體表達。（g）健康對照組和NSCLC患者樣本的平均外泌體EGFR表達。橙色和綠色條表示每組3個樣本的平均值。NSCLC患者樣本中的外泌體EGFR表達顯著高于健康對照組（n

=3;*p

<0.05）。接下來，測量了三名健康對照組和三名NSCLC患者血清樣本中的外泌體EGFR水平（人類受試者的特征見附錄A第S13節(jié)中的表S6）。從80μL人血清樣本中分離出外泌體，再重新懸浮在100μLPBS中，并以6×1010

mL-1的外泌體濃度流過生物芯片。圖4（e）顯示了來自一個傳感器單元的一個健康對照組和一個NSCLC患者具有代表性的實時質(zhì)心運動曲線（也可參見附錄A第S14節(jié)中的所有數(shù)據(jù)）。NSCLC患者樣本觀察到明顯的質(zhì)心偏移，而健康對照樣本觀察到很小的質(zhì)心移動。利用這種2×2漸變光柵陣列，對每個樣品同時從4個傳感器單元進行4次測量，以提高傳感精度。如圖4（f）所示，所有6份人類血清樣本的4個傳感器單元的結(jié)果一致性良好（變異系數(shù)小于20%）。NSCLC患者血清中的外泌體EGFR平均表達為0.99[如圖4（g）中的綠線所示]，約為健康對照組血清中的8.25倍（如圖4中的橙色線所示）。因此，使用外泌體E