用于細胞療法的大尺寸裝載器械

一、引言基于天然或工程化細胞的細胞療法已被廣泛應(yīng)用于治療各種疾病，包括內(nèi)分泌失調(diào)、心血管疾病、癌癥和神經(jīng)性疾病。此類療法可直接以細胞為功能單元進行治療，或者利用細胞分泌的生物活性分子發(fā)揮治療作用。細胞療法具備徹底改變各種慢性疾病治療理念與策略的潛力。然而，細胞經(jīng)靜脈注射或局部注射進入體內(nèi)后，往往伴隨著在體內(nèi)或者病灶部位滯留時間短的問題，導(dǎo)致治療效果不理想，并可能引發(fā)嚴重的安全性問題。研究人員因此而設(shè)計了獨特的植入式器械，用于細胞遞送，以克服以上障礙，滿足疾病治療的多種需求。為達到以上目標(biāo)，裝載器械必須具備高效的物質(zhì)交換能力，為細胞提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如氧氣和氨基酸等；同時，在某些情況下，此類器械需要保護細胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊。此外，裝載器械也需要具備一定的機械強度和高的生物相容性，以保持功能結(jié)構(gòu)的完整以及避免引起不必要的免疫反應(yīng)。根據(jù)尺寸大小，該類器械一般可分為微尺寸裝載器械和大尺寸裝載器械。因為大尺寸裝載器械（某一維尺寸大于1000μm）很容易被改造以滿足治療各種疾病的不同需求，因此本文將重點介紹此類裝載器械（圖1）。例如，被研究得較為廣泛的膜控腔室型器械，其孔隙率、孔徑大小和膜厚度可以被精準(zhǔn)地調(diào)控。而另一類叫做微針陣列貼片（microneedlearraypatch,MN）的器械，其微針長度、幾何形狀、密度和硬度亦能被輕易調(diào)控。圖1.大尺寸器械的設(shè)計及其在治療1型糖尿病、心肌梗死和癌癥免疫中的應(yīng)用。CAR：嵌合型抗原受體；hES-βC：胚胎干細胞來源的β細胞；Electroβ

cells：電敏感的人源β細胞；aPDL1：抗程序性死亡受體配體1；PEG：聚乙二醇。大尺寸器械可以將需要移植的細胞封裝在器械內(nèi)部，便于追蹤其在體內(nèi)的分布。另外，在器械失效或引起炎癥反應(yīng)時，從身體中取出大尺寸器械亦較為方便。目前，大尺寸器械已被用來遞送胰島或者胰島素分泌細胞治療糖尿病。該類器械也被用來遞送抗體分泌細胞治療神經(jīng)退行性疾病，遞送心臟基質(zhì)細胞（cardiacstromalcell,CSC）治療心臟病，遞送嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞用于癌癥免疫治療，遞送外泌體分泌細胞治療帕金森癥。本文中，我們將從制備方法、材料選擇、器械特性及其對體外和體內(nèi)治療結(jié)果的影響等各方面對大尺寸器械進行論述。由于各種疾病的治療對大尺寸器械具有不同的要求，因此對器械的介紹將圍繞疾病的種類展開。進一步地，本文對大尺寸器械的設(shè)計策略和功能進行討論，對該領(lǐng)域存在的挑戰(zhàn)和機遇進行總結(jié)和展望。二、大尺寸器械用于糖尿病治療目前，由于異體胰島供應(yīng)量少且長期服用免疫抑制類藥物伴隨著炎癥和癌癥風(fēng)險增加，因此胰島移植僅限于治療病情嚴重的胰島素缺乏性糖尿病患者。利用大尺寸裝載器械將移植胰島限制在內(nèi)部的免疫豁免部位，可以保護植入的胰島免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，或可有效減少甚至免除免疫抑制藥物的使用。此外，此方法也可用于遞送異種胰島和人胚胎干細胞（humanembryonicstemcell,hES-βC）制備的β細胞，或能解決胰島供應(yīng)量不足的問題。這類大尺寸器械主要包括膜控釋放系統(tǒng)、凝膠支架器械和微針陣列貼片類器械。這些器械都具備易制備、易回收的優(yōu)點。然而，植入器械表面的成纖維細胞過度生長、血管化不良和宿主免疫反應(yīng)，都可能影響大尺寸器械的臨床轉(zhuǎn)化，我們將在下面進行一一討論。（一）膜控釋器械用于細胞封裝膜控釋儲庫系統(tǒng)是一類表面覆蓋薄膜的密閉腔室型器械。薄膜上分布著合適密度和尺寸的孔洞，允許機體與儲庫內(nèi)進行營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性分子的交換。膜控釋儲庫系統(tǒng)尺寸較大，因此可以比較方便地對其外在大小、膜厚度以及孔洞尺寸進行調(diào)控。迄今為止，膜控釋儲庫系統(tǒng)在細胞療法上已經(jīng)取得了重大進展。例如，一種裝載了胰島素分泌細胞的器械已被開發(fā)出來，用以治療不同類型的糖尿病。此外，研究人員正在研究應(yīng)用降低免疫反應(yīng)、提供氨基酸和氧氣的策略等以提高植入細胞的存活率和增強其治療功能。1.具有合適膜孔大小的生物相容性器械近來，利用兩層膜及其中間的腔室而制備的腔室型器件被研制出來。此類器械植入體內(nèi)后，若其表面不加以修飾，則易誘發(fā)機體的異物排斥反應(yīng)，造成器械被纖維化組織包裹。尤其是膜表面增生的纖維化組織易堵塞膜孔，從而影響膜兩側(cè)物質(zhì)的交換。因此，選擇具有較少異物反應(yīng)的膜材料，是保證移植物成活和器械在失效后被順利取出的關(guān)鍵。另外膜上孔徑的大小則決定膜兩側(cè)物質(zhì)的交換速率，從而影響到器械內(nèi)細胞的生存、活性及功能。然而，器械與外界所交換的物質(zhì)的尺寸通常介于細胞因子（約2nm）與細胞直徑（約10μm）的大小之間，何種孔徑大小的膜，既能保證良好的物質(zhì)交換，又能最大限度地減少宿主免疫系統(tǒng)對移植細胞的攻擊，仍然存在較大爭議。在最近的一項工作中，Chang等將兩層聚己內(nèi)酯（polycaprolactone,PCL）納米孔膜貼合，制備了柔性雙層U型器械[圖2（a）~（c）]。與聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene,PTFE）膜（孔徑為400nm）相比，研究人員所研發(fā)的膜孔徑為20nm和200nm的器械可以更有效地抑制免疫球蛋白通過，因此能更好地保護細胞免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[圖2（d）]。由于其較好的物質(zhì)交換能力，封裝在器械中的hES-βC可以在培養(yǎng)基中存活5周以上。盡管孔徑為20nm的膜比孔徑為200nm膜表現(xiàn)出對胰島素和C肽更明顯的跨膜運輸阻礙作用[圖2（e）]，但膜孔徑為20nm和200nm的器械均達到約為1.5的葡萄糖刺激指數(shù)（glucosestimulationindex,GSI）[圖2（f）]。將此膜控釋器械植入C57BL/6J小鼠皮下一個月后，該器械周圍沒有明顯的纖維化組織沉積。4個月后，器械周圍血管密度增加而巨噬細胞募集減少[圖2（g）]。值得注意的是，當(dāng)該器械的膜孔徑為200nm時，該器械可以將細胞封裝在內(nèi)長達6個月而不泄露。但是，該過程伴隨著大約75%的細胞損失[圖2（h）]。在免疫缺陷非肥胖糖尿病-重度聯(lián)合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠中植入此器械6個月后，經(jīng)腹腔給小鼠注射葡萄糖，可以觀察到葡萄糖刺激的C肽分泌[圖2（i）、（j）]，且GSI在2~7之間[圖2（k）]。圖2.一種用于hES-βC包封的PCL雙層膜器械。（a）雙層膜器械的示意圖。（b）PCL（聚己內(nèi)酯）膜的代表性掃描電子顯微鏡圖像。（c）具有納米多孔層和微孔層的PCL膜橫截面的代表性掃描電子顯微鏡圖像。（d）7天內(nèi)免疫球蛋白跨膜擴散率。（e）暴露于葡萄糖溶液（2mmol·L-1和20mmol·L-1）后，封裝在hES-βC中C肽的分泌量（n

=4）。（f）在膜孔徑為20nm(NID-20)和200nm(NID-200)的材料中負載的hES-βC的葡萄糖刺激指數(shù)（GSI）。該裝置依次暴露在2mmol·L-1和20mmol·L-1的葡萄糖溶液中30min。GSI：在20mmol·L-1和2mmol·L-1中C肽釋放量的比值，并定義為葡萄糖刺激指數(shù)。（g）PCL膜皮下植入C57BL/6J小鼠4個月后，細胞核（DAPI）、膠原蛋白（COL1A1）、新生血管（vWF）和巨噬細胞（F4/80）標(biāo)志物的免疫熒光染色圖像。白色虛線表示PCL膜的位置。（h）器械植入6個月后細胞的損耗量，Radiance：生物發(fā)光強度。（i）腹腔糖耐量實驗中血清C肽的釋放量。實驗組小鼠分別植入NID封裝的hES-βC1周和6個月，未移植的小鼠作為對照（CTRL），并在實驗前禁食（n

=4）。（j）植入NID封裝的hES-βC6個月并禁食過夜的小鼠（n

=4）在糖耐量實驗前和60min后的血清C肽水平。（k）植入NID封裝的（NID組）或裸露的hES-βC（CTRL組）6個月后的小鼠的GSI（n

=4）。*P

<0.05,**P

<0.01,***P

<0.001。ns：無統(tǒng)計學(xué)意義。在另一項研究工作中，研究人員制備了一種異物反應(yīng)較弱、對抗體和細胞因子具有高滲透性但同時又能夠限制細胞滲漏的器械。該器械由兩部分組成：①深度為150μm的聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane,PDMS）儲庫；②具有不同孔徑的多孔聚碳酸酯（PCTE）膜[圖3（a）、（b）]。隨后，研究人員將能夠分泌小鼠促紅細胞生成素的工程化HEK293T細胞（HEKepo細胞）封裝到該器械中。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞能夠穿透孔徑為1μm的膜而浸潤到器械內(nèi)腔。將孔隙減小到0.8μm，該PCTE膜則可以較好地阻止免疫細胞進入器械內(nèi)。值得注意的是，在經(jīng)各組器械治療的小鼠體內(nèi)，均檢測到抗HEKepo細胞的抗體，但均未引起明顯的移植物損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)，將膜孔徑縮小到0.4μm，能夠更加有效地阻止免疫細胞浸潤到器械內(nèi)部，同時又實現(xiàn)了氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性分子的交換。圖3.用于細胞和胰島遞送的膜控腔室型器械。（a）微孔裝置的示意圖。（b）裝置的代表性圖像：用于小鼠實驗的代表性裝置圖片（左上）；典型的橫截面掃描電子顯微鏡圖像（右），偽彩顯示膜、細胞和硅膠體的位置；膜的偽彩圖像（左下）。（c）膜表面的改性方法。（d）用負載有胰島細胞（200~300當(dāng)量）的裝置治療的1型糖尿病小鼠的血糖水平，n

=5。（e）健康小鼠和裝置治療15天的糖尿病小鼠在糖耐量實驗后的血糖水平。（f）對（e）數(shù)據(jù)的分析結(jié)果。ATRP：原子轉(zhuǎn)移自由基聚合；ARGET：通過電子轉(zhuǎn)移再生的激活劑；CBMA：甲基丙烯酸羧基乙酯；SBMA：甲基丙烯酸磺基乙酯；MPC：2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿；AUC：曲線下面積。隨后，研究人員進一步用三種兩性離子聚合物和四氫吡喃苯三唑（tetrahydropyranphenyltriazole,THPT）衍生聚合物對器械膜進行修飾，以減少異物反應(yīng)[圖3（c）]。將器械植入C57BL/6J小鼠體內(nèi)后，THPT衍生聚合物修飾的膜在預(yù)防纖維化和維持細胞存活方面優(yōu)于兩性離子聚合物修飾膜。研究人員將胰島與海藻酸鈉凝膠混合并封裝在器械中，然后將其植入鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）誘導(dǎo)的糖尿病C57BL/6J小鼠的腹腔內(nèi)。經(jīng)THPT修飾的器械可以維持小鼠正常血糖的平均時間為75天，遠高于未修飾器械的21天[圖3（d）]。此外，在葡萄糖篩查試驗中，經(jīng)THPT修飾的器械治療的小鼠與健康小鼠一樣，能夠在120min內(nèi)將小鼠血糖恢復(fù)到正常范圍[圖3（e）和（f）]。2.可重復(fù)充填氧氣的器械充足的氧氣供應(yīng)對植入細胞的生存至關(guān)重要，因此在設(shè)計器械時需要將其納入考量范圍內(nèi)。其中，研究人員證明，向器械中吹入氧氣是一種可行的方法。Ludwig等開發(fā)了一款名為“β-Air”的器械。該器械內(nèi)包含一個可反復(fù)充填富氧空氣的儲罐。氧氣可以緩慢地穿過PTFE隔膜，到達胰島細胞所在的隔室。將德國長白母豬胰島封裝在“β-Air”器械中，隨后植入到G?ttingen小型豬皮下，并取出檢驗。當(dāng)將該器械先后暴露于3.3mmol·L?1和16.7mmol·L?1的葡萄糖溶液中時，植入前和13天后取出的器械的GSI分別為3.5和6.7。隨后，研究人員將該裝置與生長激素釋放激素（growthhormone-releasinghormone,GHRH）激動劑結(jié)合，以增強植入后β細胞的生存和細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，包裹胰島的凝膠的表面積、輸送氣體方法、氣體成分均會影響細胞活力。例如，當(dāng)胰島密度為每平方厘米1000個且厚度為500μm時，頻繁的空氣輸注或者開放型腔室均可有效地維持細胞活性。然而，當(dāng)胰島密度超過每平方厘米2000個時，在無空氣輸送或者僅輸送含氧量為20%或30%的空氣時，正常血糖的維持時間不會超過兩天。研究人員進一步將器械推進到臨床試驗，且給藥劑量設(shè)定為每千克體重2100個胰島。如果每天更新空氣，移植的器械可以將功能維持10個月以上。然而，由于植入胰島數(shù)量不足，C肽的基線水平僅為(0.04±0.03)mmol·L-1，遠低于健康個體的平均水平。移除器械后，植入部位有一個薄的纖維囊，血管化情況良好且無炎癥跡象。值得注意的是，在取出的移植物中，胰島仍保持著正常的形態(tài)，分布著正常形態(tài)與功能的α和β細胞。3.預(yù)血管化器械預(yù)血管化是另一種增強氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)的有效策略。Pepper等發(fā)現(xiàn)，將植入部位預(yù)血管化，可以顯著提高植入胰島的存活率。他們設(shè)計了一種生物相容性的細胞袋（cellpouch,CP）器械作為胰島移植的免疫隔離區(qū)和預(yù)血管化部位。將CP預(yù)植入小鼠皮下4~5周，促使擬植入部位預(yù)先血管化。隨后，利用負載胰島的CP器械治療糖尿病小鼠，可將小鼠的血糖逐漸恢復(fù)到水平正常。移植100天后，95%的小鼠血糖恢復(fù)到正常水平。若此時將CP器械移除，則小鼠在1周內(nèi)又會回到高血糖水平。胰島移植到CP中后其功能依然正常。相反，直接進行細胞移植不能逆轉(zhuǎn)糖尿病。然而，本研究中沒有對未預(yù)血管化的CP的治療效果進行評估。間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcell,MSC）和富血小板血漿（platelet-richplasma,PRP）也可以促進血管生成。受此啟發(fā)，研究人員以生物相容性較高的聚乳酸（polylacticacid,PLA）為原料，利用3D打印技術(shù)制備出腔室型器械。微通道均勻分布在器械表面，保證新形成的血管能夠滲透到細胞庫中。在該器械中先裝入PRP和MSC，然后再將器械移植到大鼠和非人靈長類動物的皮下組織中。預(yù)裝載了PRP和MSC的器械表面形成了密集的血管網(wǎng)絡(luò)，從而能夠提供一個快速進行氧氣交換的微環(huán)境，為提高隨后裝載的胰島或能夠分泌睪酮的Laydig細胞的存活率提供了條件。此外，免疫抑制分子誘導(dǎo)的局部免疫抑制微環(huán)境可以與血管網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用，進一步提高所移植的同種異體細胞的存活率。Paez-Mayorga等設(shè)計了一種皮下可植入的雙儲庫器械。該器械包含一個中央的細胞儲庫。中央儲庫兩側(cè)的空間則裝載了MSC和免疫抑制劑CTLA4Ig。這種設(shè)計不僅可以增強血管生成，還能夠建立免疫抑制微環(huán)境來保護包裹在裝置內(nèi)的同種異體Leydig細胞。Song等則開發(fā)了一種微血管網(wǎng)篩。將該網(wǎng)篩覆蓋于器械表面，可促進細胞附著，加速新生血管生成，促進氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供給。在該研究中，纖維蛋白基質(zhì)中培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC）可以在微柱基質(zhì)上自組裝形成血管網(wǎng)。兩周后，該血管網(wǎng)狀物可在器械表面誘導(dǎo)形成致密的具有正常功能的血管網(wǎng)。將裝載了胰島和覆蓋了微血管網(wǎng)的器械移植到SCID-Beige小鼠的皮下后，小鼠的血糖可以保持在正常水平達3個月。4.無線生物電子器械上述器械的糖響應(yīng)胰島素釋放功能均建立在β細胞內(nèi)在的糖響應(yīng)控制機制之上。若想利用外部刺激來操縱這個信號環(huán)路，從而控制胰島素釋放，仍面臨較大挑戰(zhàn)。在機體內(nèi)，朗格漢斯（Langerhans）胰島內(nèi)的β細胞能夠響應(yīng)血糖波動，并相應(yīng)地調(diào)整其胰島素的分泌速率。其機制如下：當(dāng)血糖升高時，經(jīng)葡萄糖轉(zhuǎn)運體運輸，葡萄糖加速流入β細胞，隨后在細胞內(nèi)產(chǎn)生大量三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate,ATP），導(dǎo)致三磷酸腺苷/二磷酸腺苷（adenosinediphosphate,ADP）比值升高。然后，ATP敏感的K+通道關(guān)閉，導(dǎo)致細胞膜去極化，誘導(dǎo)電壓門控鈣離子通道（Cav）打開，促使鈣離子加速流入，刺激胰島素分泌?；谶@一原理，Krawczyk等設(shè)計了一種電子器械，并裝載了電壓敏感的人β細胞（electrosensitivehuman

β-cells,

Electroβ

cells）和定制的生物電子接口，旨在遠程控制胰島素釋放以治療1型糖尿?。╰ype1diabete,T1D）[圖4（a）]。研究人員選擇HEK293T細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，在細胞膜上表達一個L-型電壓門控鈣離子通道，并使其能夠分泌人胎盤堿性磷酸酶（humanplacental-secretedalkalinephosphatase,SEAP）作為報告蛋白。與只表達電壓門控鈣離子通道的細胞相比，表達電壓門控鈣離子通道Cav1.2和內(nèi)向整流鉀離子通道Kir2.1的HEK293T細胞表現(xiàn)出較低的SEAP本底水平，并能夠?qū)崿F(xiàn)膜去極化觸發(fā)的SEAP釋放[圖4（b）和（c）]。隨后，選擇具有正常胰島素分泌機制但沒有葡萄糖感應(yīng)能力的β細胞系變體INSVesc進行基因改造，獲得同時表達Cav1.2和Kir2.1通道以及proinsulin-NanoLuc的Electroβ細胞系，實現(xiàn)胰島素的可控分泌并方便對其進行監(jiān)測[圖4（d）~（f）]。隨之，一種用于體內(nèi)植入的無線電刺激器械也被設(shè)計和制備出來[圖4（a）]。在該大尺寸器械中，鉑電極被安裝在包裹Electroβ細胞的半透膜兩側(cè)，可以對細胞施加電脈沖刺激。此外，一個配電盤（switchboard）被連接到該設(shè)備，以產(chǎn)生用于電刺激的方形單極脈沖。在糖耐量測試中，體內(nèi)植入器械的糖尿病小鼠在電刺激60min后，其血糖迅速恢復(fù)到正常水平，并呈現(xiàn)出類似于經(jīng)人胰島治療的血糖反應(yīng)曲線[圖4（g）]。通過實時血糖監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，只要電刺激30min，器械在1h內(nèi)就能將糖尿病小鼠的血糖恢復(fù)至正常水平[圖4（h）]。將含有Electroβ細胞的器械移植后3周內(nèi)，器械表現(xiàn)出良好的生物相容性，其免疫細胞浸潤或器械相關(guān)的細胞毒性基本可以忽略不計。該系統(tǒng)的優(yōu)勢在于，它能對血液中葡萄糖水平進行實時監(jiān)測并依外部控制而做出響應(yīng)。然而，擴大這些設(shè)備的生產(chǎn)規(guī)模可能具有一定挑戰(zhàn)性。圖4.一種裝有β細胞的無線控制的生物電子大尺寸器械。（a）該器械的三維模型。（b）不同鈣離子通道的報告蛋白分泌量的比較。（c）表達Cav1.2的細胞或共同表達Cav1.2和Kir2.1的細胞的性能比較。Cav1.2、Cav1.3[42a]和Cav1.3[?42]是三種L型電壓門控鈣通道。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n

=3；**P

<0.01，***P

<0.001。（d）暴露在不同的葡萄糖溶液中，Electroβ細胞中胰島素釋放量。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n

=3；**P

<0.01，***P

<0.001。（e）在電刺激下，Electroβ細胞的胰島素分泌途徑。PhEF1α-α2/β1-P2A-β3-pA和PhEF1α-α1C-P2A-Kir2.1-pA是表達Cav1.2和Kir2.1的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)域。（f）Electroβ細胞的代表性透射電子顯微鏡圖像。白色箭頭指向含有胰島素的囊泡。（g）葡萄糖耐量實驗。植入48h后，裝置中的Electroβ細胞被電刺激60min（紅色區(qū)域）；然后，腹腔注射葡萄糖后監(jiān)測小鼠的血糖水平。野生型（wildtype），n

=8；1型糖尿病小鼠，植入物電刺激（T1D,implantelectrostimulated），n

=6；1型糖尿病小鼠，空植入物（T1D,empty），n

=10；胰島（islets），n

=3。（h）血糖的實時監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)。植入裝置的空腹1型糖尿病小鼠被電刺激30min，并監(jiān)測血糖水平。綠色區(qū)域表示正常血糖范圍。野生型（wildtype），n

=6；無刺激（nostimulation），n

=6；電刺激（electrostimulated），n

=7。（二）微針陣列貼片用于細胞遞送微針陣列貼片是另一種大尺寸器械，已經(jīng)被廣泛研究用于無痛地遞送胰島素、疫苗、抗癌藥物、活細胞和其他種類的藥物，治療多種疾病。貼片表面均勻地分布著微針，這些微針能夠刺入皮膚，因此賦予微針陣列貼片經(jīng)皮給藥的能力。此外，微針陣列貼片可以承擔(dān)通信功能，讓微針陣列貼片上負載的細胞能夠感知微針?biāo)诮M織的生理環(huán)境的變化。Ye等利用微針陣列貼片負載能夠產(chǎn)生胰島素的β細胞，用于治療Ⅰ型糖尿病[圖5（a）]。在該方法中，微針陣列貼片以甲基丙烯酸酯化的透明質(zhì)酸（hyaluronicacid,HA）為原料制備而成[圖5（b）]，并在脫模后進行紫外線交聯(lián)。為了維持β細胞的活性，細胞被包裹在海藻酸鈉微凝膠中，然后再貼合于微針陣列貼片的背面[圖5（c）]。另外，微針中還額外整合了葡萄糖信號放大器（glucose-signalamplifier,GSA）。將該貼片貼于皮膚后，微針能夠插入真皮組織中，使整個器械獲得實時感知血糖波動并響應(yīng)釋放藥物的能力。在Ⅰ型糖尿病小鼠模型中，負載細胞的微針陣列貼片能夠感知高血糖并隨之釋放胰島素，使血糖維持在正常范圍的時間達到10h以上[圖5（d）]。重要的是，連續(xù)使用兩個微針陣列貼片并不會導(dǎo)致小鼠低血糖[圖5（e）]。在該器械中，微針陣列貼片和海藻酸鈉微凝膠能夠?qū)ⅵ录毎c宿主的免疫系統(tǒng)隔離，減少免疫排斥反應(yīng)。此外，微針陣列貼片的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠幫助β細胞感受組織液的葡萄糖濃度變化。然而，要想將該器械推到臨床應(yīng)用，還需要做很多工作，包括如何擴大化生產(chǎn)。圖5.用于細胞和胰島遞送的微針陣列貼片。（a）葡萄糖響應(yīng)機制示意圖。[Glucose]和[O2]分別代表葡萄糖和O2的濃度。GOx：葡萄糖氧化酶；AM：淀粉酶；GA：葡糖淀粉酶。（b）代表性掃描電子顯微鏡圖像。（c）負載細胞的微針貼片的熒光圖像。GSAs用羅丹明標(biāo)記，細胞用鈣-α-淀粉酶標(biāo)記。（d）使用微針貼片的1型糖尿病小鼠的在體血糖調(diào)節(jié)能力。MNw/oGRS：空MN；MNL-GRS：微針貼片與細胞凝膠；MNS-GRS：無細胞微針貼片；MNL-SGRS：裝有凝膠的微針貼片；MNL-SGRS(w/oGOx)：MNL-SGRS不使用葡萄糖氧化酶（GOx）；MNL-SGRS（不使用AM）。MNL-SGRS：不使用直鏈淀粉。（e）1型糖尿病小鼠在接受兩次連續(xù)的微針貼片治療后的血糖水平。（三）中空多孔纖維理想的大尺寸器械表面應(yīng)具備致密的血管網(wǎng)絡(luò)，使器械內(nèi)與周圍生理環(huán)境之間可以順暢地進行物質(zhì)交換。與此相似，增加裝置的比表面積也可以促進物質(zhì)交換。為此，Tan等利用膜表面孔徑為(0.27±0.02)μm的中空微孔聚醚砜纖維制備了一種大尺寸器械。纖維的外表面修飾了抗炎細胞因子白細胞介素-4（IL-4），可以誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化。此外，利用纖維連接蛋白（fibronectin,FN）修飾纖維的內(nèi)表面構(gòu)建仿生微環(huán)境，促進β細胞在纖維膜內(nèi)表面黏附并形成單細胞層。修飾前后，纖維的孔隙大小沒有發(fā)生明顯變化，卻使纖維內(nèi)的β細胞數(shù)量增加了10倍，證明這一策略具有較高的可行性。類似地，Wang等設(shè)計了一種納米纖維器械，可用于自體、同種異體或異種胰島移植，治療Ⅰ型糖尿病。該裝置由表面的納米纖維膜和核心的海藻酸鈉水凝膠組成。納米纖維膜由熱塑性硅樹脂-聚碳酸酯-聚氨酯制成。納米纖維膜的孔徑小于500nm，可防止免疫細胞浸潤。在Ⅰ型糖尿病小鼠模型中，腹腔植入該器械能夠逆轉(zhuǎn)免疫缺陷和免疫正常小鼠的糖尿病癥狀。另外，通過微創(chuàng)手術(shù)將該器械移植到實驗狗的腹腔中。兩周后，在取出的器械中仍能觀察到存活的人β細胞，但同時也觀察到免疫排斥反應(yīng)。（四）水凝膠水凝膠是一種能夠在水或生物流體中膨脹的交聯(lián)高分子網(wǎng)絡(luò)。水凝膠的親水鏈可以容納大量的水分子，因此有足夠的空間成為藥物、蛋白質(zhì)和細胞的“儲庫”。水凝膠可以由天然大分子如海藻酸鈉和明膠，或者合成聚合物如聚乙二醇[poly(ethyleneglycol),PEG]和聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯）[poly(2-hydroxyethylmethacrylate),PHEMA]制備。目前針對水凝膠的研究主要集中在改善其機械強度，減少異物反應(yīng)及促進水凝膠與機體間的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交換速率，目標(biāo)是提高細胞的存活率和維持器械性能。1.聚合物線增強海藻酸鈉水凝膠強度海藻酸鈉是目前應(yīng)用最廣泛的水凝膠原料，具有良好的生物相容性。但是，海藻酸鈉水凝膠存在一些局限性。例如，海藻酸鈉不可避免地含有脂多糖、肽聚糖和脂磷壁酸，而這些物質(zhì)可能被免疫系統(tǒng)識別為外來分子，導(dǎo)致異物反應(yīng)和器件表面纖維化。此外，海藻酸鈉水凝膠的機械強度較低，導(dǎo)致水凝膠器械不易植入或移除。目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)了一些策略，來提高海藻酸鈉水凝膠的機械強度。此外，新的生物相容性材料也在開發(fā)中，以替代海藻酸鈉并解決其體內(nèi)應(yīng)用面臨的局限性。An等開發(fā)了一種能夠釋放鈣離子的納米多孔聚合物線。將聚合物線做成螺紋線結(jié)構(gòu)，并在其表面覆蓋封裝有胰島的海藻酸鈉水凝膠，從而獲得螺紋線增強的海藻酸鈉凝膠纖維[圖6（a）]。海藻酸鈉水凝膠能夠牢固地黏附在納米多孔線上[圖6（b）]，且胰島能夠在該器械中存活[圖6（c）]。在葡萄糖溶液中，該器械能夠模擬胰島功能，實現(xiàn)胰島素的動態(tài)糖響應(yīng)分泌。在I型糖尿病小鼠實驗中，將負載大鼠胰島的海藻酸鈉凝膠纖維植入小鼠腹腔中，兩天后血糖即恢復(fù)至正常范圍內(nèi)，且在4周內(nèi)將血糖維持在正常水平[圖6（d）]。移植后第28天，進行腹腔葡萄糖耐量試驗（intraperitonealglucosetolerancetest,IPGTT）（2g·kg-1），糖尿病小鼠和健康小鼠的血糖在2h內(nèi)均回到正常水平[圖6（e）]。負載人胰島的海藻酸水凝膠纖維能夠逆轉(zhuǎn)免疫缺陷型的糖尿病SCID-Beige小鼠的高血糖[圖6（f）]，并維持正常血糖超過4個月。在實驗狗中，將10in（注：1in=2.54cm）長的海藻酸鈉水凝膠纖維放置在肝臟和隔膜之間，移植的胰島能夠存活，并實現(xiàn)糖響應(yīng)型的胰島素分泌[圖6（g）]。圖6.一種用于細胞和胰島遞送的螺紋線增強型海藻酸鈉水凝膠。（a）該器械的示意圖。TRAFFIC：用于封裝胰島的線增強海藻酸纖維。（b）代表性的胰島裝載器械圖像。（c）封裝在纖維中的胰島的活/死染色。（d）糖尿病的C57BL/6J小鼠移植封裝大鼠胰島器械后的血糖水平，n

=6~10，*P

<0.05。（e）在取回裝置前，接受葡萄糖注射后的糖尿病小鼠的血糖水平，n

=4~5，*P

<0.05（糖尿病對照vs大鼠胰島器件），#P

>0.05（非糖尿病對照vs器件治療的大鼠）。（f）糖尿病SCID-Beige小鼠移植各種類型的人胰島后的血糖水平，n

=4~21，*P

<0.05（人胰島器械vs糖尿病對照），#P

>0.05（人胰島-腎膠囊vs人胰島器械）。（g）封裝在纖維凝膠中的胰島植入前和植入后，小鼠體外葡萄糖刺激的胰島素分泌情況，n

=3，*P

<0.05。所有數(shù)據(jù)都是以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2.盤狀三唑兩性離子水凝膠另一種提高水凝膠機械強度的方法是研制大塊狀水凝膠。在眾多水凝膠中，三唑兩性離子水凝膠具有較高的拉伸性能和機械穩(wěn)定性，因此受到研究者的青睞。Liu等開發(fā)了多種基于三唑兩性離子水凝膠的盤狀水凝膠用于胰島移植，其原料包括聚季銨化三唑羧基甜菜堿丙烯酰胺[poly(quaternizedtriazolecarboxybetaineacrylamide),P(qTR-CB)]、聚三唑羧基甜菜堿丙烯酰胺[poly(triazolecarboxybetaineacrylamide),P(TR-CB)]和聚三唑磺基甜菜堿丙烯酰胺[poly(triazolesulfobetaineacrylamide)或P(TR-SB)]。通過提高合成過程中的單體濃度，可以促進強離子鍵的形成，因此能夠增強凝膠的機械強度。三唑磺基甜菜堿丙烯酰胺（triazolesulfobetaineacrylamide,TR-SB）制備的P(TR-SB)水凝膠，具有比聚羧基甜菜堿（polycarboxybetaine,PCB）水凝膠高20倍的斷裂應(yīng)變，且其在健康小鼠皮下植入后幾乎沒有異物反應(yīng)。在糖尿病小鼠植入負載大鼠胰島的P(TR-SB)凝膠后，小鼠的血糖可以維持在正常水平長達一個月。與之對比，包裹于海藻酸鈉凝膠中的胰島則無法持續(xù)維持血糖正常。取出該凝膠后，將其先后置于2.8mmol·L-1和16.7mmol·L-1的葡萄糖溶液中并培養(yǎng)60min，發(fā)現(xiàn)胰島素分泌量增加約1.5倍。此外，P(TR-SB)凝膠在植入小鼠后，其周圍的血管化程度也增長明顯。3.不可降解的聚乙二醇水凝膠為了促進器件周圍的血管化，Weaver等制備了一種蛋白酶促降解型聚乙二醇水凝膠，并在水凝膠中加入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）和血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）。RGD為胰島細胞提供黏附位點，而VEGF則可刺激器件周圍血管網(wǎng)絡(luò)的形成。此外，研究人員利用這些材料制造了一個多層胰島封裝器械。該器械主要包括兩部分：①器械核心為封裝了胰島的不可降解聚乙二醇水凝膠；②核心外部則包裹了一層促血管網(wǎng)絡(luò)生成的可降解聚乙二醇凝膠。相比于傳統(tǒng)的海藻酸鈉水凝膠，該聚乙二醇水凝膠能夠更好地維持胰島活性。將包裹了雄性Lewis大鼠胰島的器械植入雌性Lewis大鼠腹腔脂肪墊中，可以發(fā)現(xiàn)，外層修飾有VEGF聚乙二醇水凝膠的器械能夠更好地促進血管密度的增加。4.多孔管狀水凝膠如前所述，增加器械的比表面積可以促進器械內(nèi)的胰島與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換。制備了一種由聚丙烯乙二醇（polypropyleneglycol,PPG）和親水聚氨酯（hydrophilicpolyurethane,HPU）構(gòu)成的可移除式多孔管狀器械，用于β細胞或胰島移植。HPU-PPG水凝膠剛度范圍為100~400kPa，可提供機械支撐。為了獲得該器械，首先需要制備氯化鈉顆粒預(yù)填充的水凝膠，再用水沖洗除去氯化鈉晶體，從而獲得多孔結(jié)構(gòu)。這些孔洞中可以填充海藻酸鈉水凝膠，用于進一步負載β細胞系或胰島細胞簇。實驗發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉水凝膠與內(nèi)部細胞具有良好的生物相容性。體外實驗結(jié)果表明，相比于普通RPMI1640培養(yǎng)基，含33mmol·L?1葡萄糖溶液的HEPES緩沖液[Krebs-RingerBicarbonate

N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-2-ethanesulfonicacidbuffer]可以更好地刺激負載在器械中的胰島釋放出胰島素，使24h內(nèi)胰島素釋放量翻倍。結(jié)果表明，胰島可能比β細胞系具有更好的糖響應(yīng)胰島素釋放性能。此外，水凝膠不易降解，在植入后可以完整取出。三、大尺寸器械用于心血管疾病治療心肌梗死（myocardialinfarction,MI）會造成心肌細胞損傷，致使約36%的MI幸存者面臨較高的心衰風(fēng)險。干細胞療法能夠通過旁分泌機制，分泌再生因子治療MI，改善心臟功能，預(yù)防心力衰竭。因此，延長MI部位干細胞的滯留時間，具有改善干細胞治療MI療效的潛力。其中，可注射支架和心臟貼片已被開發(fā)用于提高細胞遞送效率。可注射支架可為植入的細胞提供生理支持，誘導(dǎo)血管形成，緩解纖維化。心臟補片可以提供直接的機械支持來增強心臟功能，并構(gòu)建一個適合細胞生長的微環(huán)境。（一）心臟補片用于MI治療將脫去細胞的細胞外基質(zhì)（decellularizedcell-derivedextracellularmatrice,CDM）沖壓在聚乙烯醇（polyvinylalcohol,PVA）水凝膠上，獲得可拉伸的細胞外基質(zhì)薄膜，用于干細胞的遞送。CDM能夠促進細胞黏附，提高NIH-3T3成纖維細胞在器械內(nèi)的增殖速度。在大鼠MI模型中，負載間充質(zhì)干細胞器械的治療效果優(yōu)于直接注射或與FN/PVA水凝膠共用的間充質(zhì)干細胞，顯示了該器械的優(yōu)越性?；谛募〖毎饣|(zhì)和甲基丙烯酸明膠（gelatinmethacrylate,GelMA），也設(shè)計了一種生物打印的心臟補片，用于遞送心臟祖細胞。這種心臟補片具有足夠的機械強度，能夠有效促進新血管再生，并能在體內(nèi)保留14天以上。開發(fā)了一種引入導(dǎo)電高分子聚丙烯酸的氧化海藻酸鈉-明膠水凝膠，具有良好的自愈性、生物相容性、導(dǎo)電能力以及機械穩(wěn)定性。在凝膠內(nèi)培養(yǎng)的新生兒心肌細胞表現(xiàn)出改善的分化肌節(jié)和細胞間接觸，以及組織良好的肌節(jié)α-肌動蛋白和定向分布的肌節(jié)。該貼片能夠顯著抑制心肌纖維化，增加左室壁厚度，促進血管生成。也利用重編程的成纖維細胞制備了預(yù)血管化的心臟補片。此外，為了避免因器械內(nèi)細胞活力降低導(dǎo)致的治療功能減弱或喪失、增加貼片的保存時間與擴展應(yīng)用場景，研制了一種可以冷凍保存的、負載并能夠分泌細胞因子的心臟補片用于MI后的心臟修復(fù)。（二）微針陣列貼片用于MI治療如何實現(xiàn)貼片與MI部位的物質(zhì)交換效率以提高治療效果仍具有較大挑戰(zhàn)。為了促進微針貼片與MI給藥部位的物質(zhì)交換，Tang等制備了一種負載CSC的微針陣列貼片，方便CSC與MI部位細胞的物質(zhì)交換，促進細胞再生因子向受損心肌的運輸[圖7（a）]。微針陣列貼片由易結(jié)晶的PVA制備而成[圖7（b）]。貼片上的微針可以刺入心肌組織，吸收組織間隙液發(fā)生微腫脹，在凝膠內(nèi)部形成微米級通道，允許貼片與宿主心肌細胞直接進行物質(zhì)交換和信息傳遞。CSC被包裹在位于MN貼片背面的生物相容性纖維蛋白凝膠中[圖7（c）]，并保持良好的存活率[圖7（d）]。與直接進行心肌組織內(nèi)注射相比，這種方法延長了CSC在損傷部位的滯留時間。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，整合在貼片頂部的細胞在7天內(nèi)存活狀況良好[圖7（e）]。另外，CSC能夠從纖維蛋白凝膠遷移到微針貼片的腔中[圖7（f）]，并分泌再生因子到培養(yǎng)基中，從而證明其具備提高心肌細胞活力的能力[圖7（g）]。在大鼠MI模型中[圖7（h）]，將含有1×106個基質(zhì)細胞的MN貼片貼在新形成的MI區(qū)[圖7（i）和（j）]，并在MI區(qū)放置7天以上[圖7（k）]。與對照組相比，治療后心肌細胞凋亡數(shù)量減少，血管生成密度顯著增加[圖7（j）]，心臟的梗死壁和存活組織較厚[圖7（j）]。治療三周后，接受MN-CSC移植的心臟纖維化程度降低[圖7（l）]。圖7.微針陣列貼片遞送心臟基質(zhì)細胞用于MI治療。（a）細胞整合的微針貼片的設(shè)計示意圖。（b）微針貼片的代表性圖像，比例尺：500μm。（c）細胞整合的微針貼片的熒光圖像，比例尺：500μm。（d）細胞活/死染色的代表性圖像，比例尺：200μm。（e）細胞存活率的定量分析，n

=3，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。（f）細胞（綠色）與微針貼片整合3天后的代表性共聚焦圖像。（g）用增殖標(biāo)志物Ki67和α-肉瘤肌動蛋白（α-SA）對新生大鼠心肌細胞（NRCM）進行的定量分析。NRCM單獨培養(yǎng)或在有MN或MN-CSC補丁的情況下培養(yǎng)，n

=3，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。（h）動物研究的整體設(shè)計示意圖。（i）用細胞貼片處理的心臟的代表性圖像。（j）用細胞貼片處理的心臟的蘇木精和伊紅（H&E）染色，LV：左心室。（k）用微針貼片處理后7天的心臟的熒光圖像，比例尺：400μm。（l）使用Masson's三色染色的心肌切片的代表性圖像，心臟是在心肌梗塞三周后獲得的，藍色表示疤痕組織；紅色表示存活的心肌。（三）可填充式細胞儲庫用于MI治療在另一項研究中，制備了一種治療型細胞儲庫，主要通過干細胞分泌的旁分泌因子治療心肌梗死。該器械主要由三個部分組成：附著于心臟的細胞儲庫、植入皮下的通路端口和連接它們的管道。儲庫的可透膜面向心臟表面，而不透膜向外。體外實驗表明，儲存在器械內(nèi)的小鼠間充質(zhì)干細胞能夠在培養(yǎng)基中存活28天，并持續(xù)向培養(yǎng)基中釋放熒光素酶。此外，該研究證實，通過填充管道，可向細胞儲庫補充干細胞。由于間充質(zhì)干細胞的生存時間較短，這種多次反復(fù)給藥的策略可以在多個時間尺度上向MI部位遞送細胞相關(guān)因子，包括細胞因子、趨化因子和旁分泌因子。四、大尺寸器械用于CAR-T細胞療法CAR-T細胞療法在治療pre-B型急性淋巴細胞白血病或B細胞淋巴瘤方面取得較好的效果，但是應(yīng)用于實體瘤治療時仍面臨多重挑戰(zhàn)。CAR-T細胞是發(fā)揮抗癌活性的直接功能介質(zhì)，因此在設(shè)計用于實體腫瘤治療的CAR-T細胞遞送器械時，必須考慮提升CAR-T細胞停留在腫瘤部位的能力和數(shù)量，并為細胞提供物理支持，提高CAR-T細胞的生存能力和抗癌活性。為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，Coon等開發(fā)了用于CAR-T細胞遞送的鎳鈦合金薄膜（thin-filmnitinol,TFN）。薄膜上設(shè)計有微型圖像，允許金屬膜在外力作用下發(fā)生形變，單軸拉伸形變可超過100%。通過將纖維蛋白凝膠層覆蓋在器械表面，可以促進CAR-T細胞的黏附和遷移。此外，抗CD3、CD28和CD137的抗體亦被結(jié)合到纖維蛋白凝膠上，用以刺激CAR-T細胞的擴增。在體外培養(yǎng)實驗中，TFN上的CAR-T細胞能夠保持功能達6天。在不可切除的卵巢癌模型中，通過TFN遞送的CAR-T細胞能夠根除70%的小鼠腫瘤，延長平均生存時間至80天，遠遠高于靜脈注射或瘤內(nèi)注射CAR-T細胞的小鼠的生存時間。這種方法為增強CAR-T細胞對實體瘤的抗腫瘤活性提供了一種選擇。GFOGER修飾的海藻鈉水凝膠也被用于增強T細胞在腫瘤部位的增殖和滯留能力，并對切除的4T1腫瘤和多灶性卵巢癌具有顯著的抗癌活性。開發(fā)了一種可注射、生物相容、功能化的聚異氰酸多肽水凝膠。當(dāng)T細胞與其一同注射到腫瘤部位后，該凝膠可改善T細胞在腫瘤部位的停留時間并持續(xù)釋放出細胞。此外，將能夠分泌IL-15的CAR-T細胞與PEG-殼聚糖水凝膠聯(lián)合注射至視網(wǎng)膜母細胞瘤中，可以顯著提高CAR-T細胞的抗癌活性，從而保住了小鼠的視力。這些治療策略均取得了令人鼓舞的治療結(jié)果。然而，免疫抑制和低氧的腫瘤微環(huán)境仍可能會阻礙CAR-T細胞對實體腫瘤的抗癌活性。因此，研究人員又發(fā)展了一些新的策略來解決這些問題。為了逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境，設(shè)計了一種可生物降解的HA水凝膠儲庫，用于同時遞送硫酸軟骨素蛋白聚糖4（chondroitinsulfateproteoglycan4,CSPG4）靶向的CAR-T細胞、抗程序性細胞死亡配體1抗體（anti-programmedcelldeathligand1antibody,aPDL1）修飾的血小板（P-aPDL1）和細胞因子IL-15包裹的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA]納米顆粒[圖8（a）和（b）]。將水凝膠植入術(shù)后腫瘤部位，局部腫瘤的復(fù)發(fā)和遠端腫瘤生長均得到了抑制。水凝膠儲庫能夠持續(xù)緩慢地向周圍腫瘤組織釋放CAR-T細胞，避免了因細胞突釋而導(dǎo)致的CAR-T細胞大量失活。同時，水凝膠中加載的IL-15能夠維持CAR-T細胞的活性[圖8（a）]。此外，術(shù)后炎癥環(huán)境能夠觸發(fā)血小板活化，加速抗aPDL1的釋放，抑制免疫檢查點通路，增強CAR-T細胞的殺傷作用。在體外實驗中，血小板能夠在96h內(nèi)完全地從水凝膠中釋放出來；與之對比，在相同條件下，只有50%的CAR-T細胞從水凝膠中釋放[圖8（c）]。在共體外培養(yǎng)實驗中，含有P-aPDL1和CAR-T細胞的水凝膠顯示出較好的抗癌活性[圖8（d）]。在體內(nèi)實驗中，裝載CAR-T細胞和P-aPDL1的水凝膠儲庫顯示出明顯高于其他組的腫瘤抑制活性[圖8（e）]。值得注意的是，這種水凝膠的全身抗癌活性證實了水凝膠的單側(cè)給藥可以抑制對側(cè)腫瘤的生長[圖8（f）]。圖8.一種用于同時遞送和緩慢釋放CAR-T細胞和偶聯(lián)了a-PDL1的血小板的水凝膠儲庫。（a）水凝膠用于手術(shù)后細胞免疫療法的機制示意圖。PMP：血小板衍生的微粒子；NP：納米粒子。（b）裝有細胞和血小板的水凝膠的典型冷凍掃描電子顯微鏡圖像，比例尺：10μm。（c）CAR-T細胞和血小板在體外的釋放，1×107個CAR-T細胞和1×107個血小板被裝入水凝膠，n

=3。（d）腫瘤細胞和T細胞共培養(yǎng)72h后的細胞流式圖，n

=3，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。（e）治療三周后小鼠腫瘤的代表性圖像，小鼠接受了以下治療，1：生理鹽水；2：P-aPDL1@gel；3：CAR-T細胞；4：CAR-T+P-aPDL1；5：CAR-T@gel；6：CAR-T@gel+P-aPDL1；7：CAR-T-P-aPDL1，比例尺：1cm。（f）右側(cè)原發(fā)腫瘤治療后左側(cè)腫瘤的大小，n

=6，**P

=0.0023，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。為了改善腫瘤缺氧微環(huán)境，制備了一種多孔水凝膠包被的免疫芯片系統(tǒng)，用于同時遞送CAR-T細胞、IL-15和O2到實體腫瘤中。在實體瘤內(nèi)，凝膠層逐漸降解并向腫瘤微環(huán)境釋放氧氣，從而為CAR-T細胞提供氧氣，促進CAR-T細胞從免疫芯片遷移到腫瘤。該療法能夠增強T細胞對腫瘤基質(zhì)的浸潤并提高細胞的存活率，降低腫瘤細胞HIF-1α和Ki67的表達，展示出抑制腫瘤生長的能力。五、3D打印水凝膠以建立血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)實體器官包含相互穿插的血管網(wǎng)絡(luò)，具有物質(zhì)輸送功能?；谏锵嗳菪运z的3D打印血管網(wǎng)絡(luò)對于人工器官（包括復(fù)合血管骨骼、骨骼肌、心臟組織和肝臟）的細胞生存至關(guān)重要。采用質(zhì)地較硬的PLA和載細胞的柔性分別構(gòu)建骨支架和血管，將局部生物活性因子固定，并結(jié)合3D打印技術(shù)建立具有血管網(wǎng)絡(luò)的骨骼。此外，以內(nèi)皮細胞自促作用為基礎(chǔ)，利用3D打印技術(shù)制備基于水凝膠的含血管心肌組織，將血管形成和血管新生結(jié)合起來。最近，開發(fā)了一種3D打印策略，創(chuàng)建具有內(nèi)部纏繞血管網(wǎng)絡(luò)的生物相容性水凝膠，并通過血管內(nèi)3D流體混合器和二尖瓣進一步將其功能化。該研究發(fā)現(xiàn)，無毒的食品添加劑檸檬黃可吸收多余光子，從而增強立體投影在z軸的分辨率，使制備具有纏繞血管網(wǎng)絡(luò)的柔性水凝膠成為可能。此外，通過3D打印技術(shù)，在血管網(wǎng)絡(luò)中還進一步引入了功能性血管內(nèi)流體混合器和二尖瓣[圖9（a）]，證實這種3D打印技術(shù)能夠產(chǎn)生具有拓撲結(jié)構(gòu)的功能性血管。在該研究中，研究人員利用3D打印技術(shù)制備了非連續(xù)的立方晶格和纏繞環(huán)面[圖9（b）和（c）]，并證實血管間存在O2運輸[圖9（d）]。此外，該研究還進一步制備了具有類似肺泡拓撲結(jié)構(gòu)的水凝膠，用于研究呼吸過程中的氧氣交換過程[圖9（e）]，證實分支的血管網(wǎng)絡(luò)、水凝膠膨脹和血液重定向都能夠?qū)崿F(xiàn)更快的氧氣交換。研究人員還制備了包裹哺乳動物細胞的可植入水凝膠，驗證了這種打印策略與活細胞的相容性。該纖維蛋白水凝膠器械中含有肝臟組織聚集物、內(nèi)皮細胞嵌入的血管腔以及用于固定纖維蛋白凝膠的水凝膠錨栓，被用作肝臟模型進行研究[圖9（f）和（g）]。在慢性肝損傷小鼠模型中，該器械能夠在體內(nèi)存活超過14天，并在肝聚集物附近的微血管中發(fā)現(xiàn)了宿主血細胞。這種用于打印血管網(wǎng)絡(luò)的3D打印技術(shù)，可應(yīng)用于大型3D器械中，促進其與機體的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的交換。圖9.具備精密血管結(jié)構(gòu)功能的3D打印柔性水凝膠。（a）在由20wt%的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA；6kg?mol-1）制成的水凝膠中3D打印出纏繞的軸向血管和螺旋線，比例尺：3mm。（b）水凝膠內(nèi)的希爾伯特曲線，比例尺：3mm。（c）環(huán)狀物和環(huán)形結(jié)，比例尺：3mm。（d）軸向血管和包圍的螺旋，紅細胞從入口流向出口，比例尺：1mm。（e）有紅細胞流動的肺泡狀結(jié)構(gòu)的照片，DeoxyRBCs：脫氧紅細胞，oxyRBCs：含氧紅細胞，比例尺：1mm。（f）裝有肝細胞聚集物的多室水凝膠構(gòu)造，血管網(wǎng)絡(luò)中播種了內(nèi)皮細胞。（g）部分水凝膠的共聚焦顯微鏡圖像，Hep：肝細胞聚集物。六、討論與結(jié)論在過去的幾年里，人們用生物相容的惰性材料或可降解材料制備了具有各種結(jié)構(gòu)的大尺寸器械，用于遞送細胞以治療多種疾病（表1）。大尺寸器械通常被精心設(shè)計，滿足細胞對營養(yǎng)、氧氣、細胞因子和免疫豁免環(huán)境的需求，維持細胞（無論是異體還是異種細胞）的生存活性和治療功能。為了達到這些目標(biāo)，近年來發(fā)展起來的預(yù)血管化策略和構(gòu)建局部免疫抑制環(huán)境的策略，能最大限度地為移植