酶聯(lián)免疫吸附試驗的影響因素

關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附試驗的影響因素

實驗過程中的影響因素終止與讀數(shù)結(jié)果的判讀試劑加樣溫育樣本洗板顯色第2頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

一、標(biāo)本

排泄物血清唾液尿液、糞便分泌物體液第3頁,共48頁，2024年2月25日，星期天血清標(biāo)本脂血標(biāo)本溶血標(biāo)本標(biāo)本的保存標(biāo)本的離心采血試管第4頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

采血試管

1.使用非抗凝標(biāo)本（血清）；

肝素抗凝血漿會增加OD值;EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA檢測系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性;2.最好使用一次性玻璃試管或真空采血管.第5頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

標(biāo)本采集后，應(yīng)先將標(biāo)本37°放置30-60分鐘后采用3000r/min離心15-20分鐘，取

上清液加樣。15min3000r/min標(biāo)本的離心第6頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

標(biāo)本的離心

強(qiáng)行離心分離血清，會使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊或附著在酶標(biāo)板孔壁內(nèi)使酶標(biāo)記物不易洗掉，易造成假陽（陰）性結(jié)果。第7頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

標(biāo)本的保存

1.一周----2～4℃保存；2.超過一周----建議-20℃保存。3.冰凍血清融解后，蛋白質(zhì)會出現(xiàn)局部濃縮而分布不均，加樣前應(yīng)充分混勻。

第8頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

標(biāo)本的保存

4.混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或

過濾，澄清后再檢測。5.作多次檢測，宜少量分裝冰存;6.血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測盡量避免細(xì)

菌污染。第9頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

避免細(xì)菌污染A.如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性的HRP會產(chǎn)生假陽性；

B.細(xì)菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用（如明膠酶等蛋白水解酶）；

C.一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。第10頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

溶血標(biāo)本

1.ELISA以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗原或

抗體；2.紅細(xì)胞破壞后可釋放出大量的具有過

氧化物酶活性的血紅蛋白；3.殘留的過氧化物酶催化底物產(chǎn)生非特

性顯色導(dǎo)致結(jié)果假陽性。第11頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

脂血標(biāo)本

1.脂質(zhì)小粒粘附在反應(yīng)孔內(nèi)壁；2.非離子型洗滌劑很難洗掉反應(yīng)板上干

擾性物質(zhì)的非特異性吸附，引起吸光

度A值升高，易造成假陽性結(jié)果。

餐后抽血、高甘油三脂血癥患者、標(biāo)本離心時間、離心速度不合適等，都可使分離的血清標(biāo)本中殘留著大量的脂質(zhì)小粒。第12頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

二、試劑1.試劑盒保存于2-8℃2.使用前應(yīng)先將檢測試劑盒放置室溫平衡15-30分鐘，保證酶等液體的初始反應(yīng)溫度及活性劑的溶解。3.觀察外包裝和內(nèi)組份有無漏液。第13頁,共48頁，2024年2月25日，星期天三、加樣仔細(xì)注意加樣全部過程移液器的使用及時放入孵育箱標(biāo)本較多時，請分批操作試劑的滴加第14頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

加樣過程應(yīng)注意：

A.加樣不可太快；B.要避免加在孔壁上部；C.不可濺出；D.避免產(chǎn)生氣泡；E.盡可能使用同一加樣器，裝緊槍頭，加樣后充分混勻。第15頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

試劑的滴加

從滴瓶中滴加，應(yīng)注意滴加的角度和速度。滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。第16頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共48頁，2024年2月25日，星期天移液器的使用移液的方法及注意事項槍頭的裝配量程的調(diào)節(jié)第18頁,共48頁，2024年2月25日，星期天量程的調(diào)節(jié)

1.從大體積調(diào)為小體積2.從小體積調(diào)為大體積

在該過程中，千萬不要將按鈕旋出量程，否則會卡住內(nèi)部機(jī)械裝置而損壞了移液槍第19頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

槍頭（吸液嘴）的裝配

使勁地在槍頭盒子上敲幾下——錯誤

將移液槍（器）垂直插入槍頭中，稍微用力左右微微轉(zhuǎn)動即可使其緊密結(jié)合——正確槍頭卡緊的標(biāo)志是略為超過O型環(huán)，并可以看到連接部分形成清晰的密封圈。第20頁,共48頁，2024年2月25日，星期天移液的方法前進(jìn)移液法反向移液法

一般用于轉(zhuǎn)移高粘液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量的液體，其原理就是先吸入多于設(shè)置量程的液體，轉(zhuǎn)移液體的時候不用吹出殘余的液體。重復(fù)操作移液法

適用于快速、簡便地重復(fù)轉(zhuǎn)移等量的同種液體。全血移液法第21頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

移液的注意事項

1.吸取液體時，移液器保持豎直狀態(tài)，將槍頭插入液面下1厘米。

注意吸液體時，一定要緩慢平穩(wěn)的松開拇指，絕不允許突然松開，以防將溶液吸入過快而沖入移液器內(nèi)腐蝕柱塞而造成漏氣。第22頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

移液的注意事項

2.設(shè)定加樣體積，不能大于加樣槍標(biāo)定的移液范圍

3.加樣吸嘴的潔凈和裝配

4.吸取液體和排出液體動作都一定要慢。

第23頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

移液的注意事項

5.加樣槍嚴(yán)禁吸取有強(qiáng)揮發(fā)性、強(qiáng)腐蝕性的液體（如濃酸、濃堿、有機(jī)物等）

6.不要用大量程的加樣槍移取小體積的液體，以免影響準(zhǔn)確度。

第24頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

移液的注意事項

7.如不使用，要把移液槍的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保護(hù)彈簧，并將其豎直掛在移液槍架上。8.表面清潔：用10%的次氯酸鈉溶液或70%的酒精溶液清潔后，自然晾干。

9.微量加樣槍必須按要求定期進(jìn)行校準(zhǔn)。第25頁,共48頁，2024年2月25日，星期天四、溫育

1.抗原抗體反應(yīng)必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時間。2.溫育所需時間與溫度成反比。3.最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。

第26頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

實際操作中應(yīng)注意：

溫育溫度的選擇足夠的反應(yīng)時間“邊緣效應(yīng)”的排除第27頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

溫育溫度的選擇

1.微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間；2.在臨床實驗室中，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。第28頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

“邊緣效應(yīng)”的排除1.“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深;2.有研究證實在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因。3.聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，板從室（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。第29頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，應(yīng)盡量采用水浴。

溫育中讓微孔板浮于水面上（浸入1/3），或?qū)⒔杆纳巢挤湃胍淮箫埡兄行纬蓾窈?，然后放于溫箱中，這樣可使微孔板板孔底部直接與37℃水或濕布接觸，而且水浴箱或濕盒內(nèi)溫度較高，可使反應(yīng)溶液的溫度迅速與溫室平衡。第30頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

五、洗板

血清中殘留的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針孔全阻塞或半阻塞，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”造成假陽性或假陰性。第31頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

洗板的注意事項1.要有適當(dāng)?shù)慕輹r間（30-60秒）。2.洗板機(jī)吸液要徹底，殘余量低于5ul。3.洗液應(yīng)調(diào)至適當(dāng)?shù)淖⒊隽浚靠讘?yīng)在350ul-450ul之間，但不要溢出孔外。第33頁,共48頁，2024年2月25日，星期天4.洗板次數(shù)應(yīng)與說明書要求一致，盡量不要私自增加或減少洗板次數(shù)。5.稀釋洗液應(yīng)使用蒸餾水或去離子水，pH值不宜過酸或過堿，保證配出的洗液pH值為7.4±0.2，水質(zhì)宜新鮮，長菌或有沉淀不宜使用，且用非金屬容器保存。第34頁,共48頁，2024年2月25日，星期天6.由于洗滌液系高濃度磷酸鹽，會形成結(jié)晶，配制洗液時應(yīng)完全溶解。7.稀釋好的洗液4℃下可保存3—5天。8.洗板后，拍干包被板，應(yīng)垂直扣在備好的干凈吸水紙或毛巾上，且每次拍板應(yīng)換掉前次拍過的毛巾或吸水紙，避免交叉污染。第35頁,共48頁，2024年2月25日，星期天9.操作洗板機(jī)過程中要不時觀察洗板

機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時糾

正，洗板機(jī)不用時應(yīng)用去離子水清

洗幾遍后關(guān)機(jī)。10.每周要進(jìn)行保養(yǎng)清洗。第36頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

六、顯色

注意事項：1.檢查底物溶液的有效性；2.試劑顯色時先加A液，后加B液，二者不要顛倒。3.前后加入的間隔時間不超過10分鐘。第37頁,共48頁，2024年2月25日，星期天4.若把A液和B液先混合，再加樣顯色，需要求二者等體積混合。5.A、B液應(yīng)避免接觸污染物。6.不同廠家顯色液不得混用。第38頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

七、終止和讀數(shù)

肉眼判斷結(jié)果時，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須使用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果，以保證結(jié)果一致性。第39頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

注意事項1、酶標(biāo)儀的波長是否合適或濾光片是否正確。2、單波長或雙波長比色選擇的問題。

ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色

3、加完終止液后30分鐘內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。4、保證酶標(biāo)板的底部是清潔干燥的。第40頁,共48頁，2024年2月25日，星期天雙波長比色？

雙波長比色測定能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響，一般不必設(shè)空白孔。

ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性；在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。

第41頁,共48頁，2024年2月25日，星期天八、結(jié)果的判讀灰區(qū)的定義

灰區(qū)又稱灰色帶反應(yīng)。就是把OD值在Cutoff值正負(fù)20%這個范圍內(nèi)的標(biāo)本稱為灰區(qū)標(biāo)本。這個范圍稱為灰區(qū)。第42頁,共48頁，2024年2月25日，星期天