家蠶常用內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析及兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較的綜述報(bào)告

家蠶常用內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析及兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較的綜述報(bào)告引言：家蠶（Bombyxmori）是重要的經(jīng)濟(jì)性昆蟲(chóng)，被廣泛應(yīng)用于絲綢生產(chǎn)和生物學(xué)研究。在基因表達(dá)定量分析中，正確選擇穩(wěn)定內(nèi)參基因?qū)τ诳煽康慕Y(jié)果至關(guān)重要。然而，目前在家蠶中對(duì)于內(nèi)參基因穩(wěn)定性的研究相對(duì)較少，因此本文將對(duì)家蠶常用內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析及兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行比較的研究進(jìn)行綜述。一、內(nèi)參基因的選擇及穩(wěn)定性分析：內(nèi)參基因是指在不同組織、不同生長(zhǎng)階段、不同病理狀態(tài)下其表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定的基因，通常用于基因表達(dá)定量分析中。內(nèi)參基因的選擇需要滿足穩(wěn)定性、均一性、表達(dá)量適中等條件。在家蠶中較為常用的內(nèi)參基因包括β-actin、GAPDH、18SrRNA、rpl32和rps18等。為了確定這些內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，許多研究都采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行了分析。其中，一項(xiàng)研究使用生長(zhǎng)期不同的家蠶卵巢和家蠶胚胎進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)geNorm軟件計(jì)算出這些內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名。結(jié)果顯示，rpl32和rps18的穩(wěn)定性最高，而β-actin和18SrRNA的穩(wěn)定性最低（XiangZetal.,2013）。另一項(xiàng)研究則選擇了不同性別、不同組織中的家蠶進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，并使用NormFinder軟件計(jì)算內(nèi)參基因穩(wěn)定性指數(shù)。結(jié)果表明，rpl32和GAPDH的穩(wěn)定性最優(yōu)，而β-actin和18SrRNA的穩(wěn)定性最差（HuHetal.,2018）。綜合以上兩項(xiàng)研究的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)rpl32在家蠶中具有相對(duì)較高的穩(wěn)定性，因此可以作為家蠶基因表達(dá)定量分析的穩(wěn)定內(nèi)參基因。二、兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較1.相對(duì)定量法：相對(duì)定量法是實(shí)時(shí)熒光定量PCR中最常用的方法之一，通常采用ΔΔCt法來(lái)計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。該方法將待測(cè)得樣品與對(duì)照樣本進(jìn)行比較，以對(duì)照樣品為1作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算待測(cè)樣品的相對(duì)表達(dá)量。然而，該方法中需要選擇合適的內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行校正，如前文所述，內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要。2.絕對(duì)定量法：絕對(duì)定量法是另一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，與相對(duì)定量法不同的是，絕對(duì)定量法可以測(cè)定物質(zhì)的絕對(duì)量，而無(wú)需經(jīng)過(guò)內(nèi)參基因的校正。目前，常用的絕對(duì)定量方法有絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線法和絕對(duì)定量環(huán)境比值法。其中，絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線法需要構(gòu)建外標(biāo)曲線，以外標(biāo)曲線上的標(biāo)準(zhǔn)品為基礎(chǔ)，計(jì)算未知樣本中目標(biāo)序列的濃度。該方法的優(yōu)點(diǎn)是精確度高，但需要預(yù)備更多的標(biāo)準(zhǔn)品并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。絕對(duì)定量環(huán)境比值法則是利用參考基因和目標(biāo)基因的比值計(jì)算目標(biāo)基因的絕對(duì)表達(dá)量。不同于相對(duì)定量法，該方法不需要選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正，而是利用參考基因和目標(biāo)基因在同一生物樣品中的濃度比進(jìn)行計(jì)算。該方法不受到PCR效率和RNA提取效果等誤差的影響，但需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性?？偨Y(jié)：在家蠶基因表達(dá)定量分析中，選擇合適的內(nèi)參基因?qū)Y(jié)果的精確度至關(guān)重要。目前，較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因包括rpl32和GAPDH等，需要在具體實(shí)驗(yàn)中選擇。同時(shí)，在選擇實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法時(shí)，應(yīng)根據(jù)具體條件選擇合適的方法進(jìn)