高效液相色譜法簡介

關(guān)于高效液相色譜法簡介12

液相色譜分析是在經(jīng)典的液體柱色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論；在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，實現(xiàn)了分析速度快、分離效率高和操作自動化，這種柱色譜技術(shù)被稱做高效液相色譜法。高效液相色譜分析概述第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3慢中等快色譜分離Temporalcourse淋洗液第3頁,共43頁，2024年2月25日，星期天4

葉綠素的柱色譜第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天5三組分混合物的分離第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天6在C18柱中，三組分混合物流出色譜柱的順序為：萘，聯(lián)二苯、蒽。

當(dāng)試樣混合物進(jìn)入色譜柱后，就在固定相和流動相之間不斷地進(jìn)行分配平衡。不同的化合物，分子結(jié)構(gòu)不同，存在理化性質(zhì)的差異，所以在兩相中存在的濃度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，沖洗出柱子的時間就長，反之則短。這與分配系數(shù)有關(guān)：

K=化合物在固定相中的濃度C固化合物在流動相中的濃度C流

K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用強(qiáng)，后流出柱子。第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天7第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天8

鍵合相-反相色譜第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天9§1.概述色譜法：(chromatography)：以試樣組分在固定相和流動相間的溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的差異為依據(jù)而建立起來的各種分離分析方法稱色譜法。幾個概念色譜柱：進(jìn)行色譜分離用的細(xì)長管。固定相：管內(nèi)保持固定、起分離作用的填充物。流動相：流經(jīng)固定相的空隙或表面的沖洗劑。第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天10§1-4高效液相色譜法的特點一高壓

液相色譜以液體作為流動相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。在現(xiàn)代液體色譜中供液壓力和進(jìn)樣壓力都很高，一般可達(dá)到150～300kg／cm2，甚至可達(dá)700k／cm2以上。第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天11二高速

高效液相色譜所需的分析時間較之經(jīng)典液體色譜快得多，一般可達(dá)l—10mL／min，

個別可高達(dá)100mL／min以上，這已近似于氣相色譜的流速。

三高效

氣相色譜的分離效能很高，高效液相色譜的柱效則更高，一般約可達(dá)

60000理論塔板／米；第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天12四高靈敏度

紫外檢測器的最小檢測量可達(dá)毫微克數(shù)量級(10-9g)；熒光檢測器的靈敏度可達(dá)10-11g。高效液相色譜的高靈敏度還表現(xiàn)在所需試樣很少；微升數(shù)量級的樣品就足以進(jìn)行全分析。

第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天13§1-5高效液相色譜流程和設(shè)備

高效液相色譜儀一般可分為5個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天14第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天15樣品吸收度測定—吸收池示圖第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天16紫外檢測器工作原理第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天17第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天18開始分析廢液樣品

淋洗液至分離柱進(jìn)樣閥樣品裝樣廢液

淋洗液至分離柱定量環(huán)進(jìn)樣（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）樣品環(huán)第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天19液相色譜動畫演示第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天20二、色譜圖（chromatogram）

試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后，按先后次序經(jīng)過檢測器時，檢測器就將流動相中各組分濃度變化轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號，由記錄儀所記錄下的信號——時間曲線或信號——流動相體積曲線，稱為色譜流出曲線，或色譜圖。如圖12-2常用術(shù)語：1.基線:在操作條件下，僅有純流動相進(jìn)入檢測器時的流出曲線。第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天212.色譜峰:當(dāng)組分隨流動相進(jìn)入檢測器時，其響應(yīng)信號大小隨時間變化所形成的峰形曲線。正常的色譜峰呈正態(tài)分布。3.峰高與峰面積峰高：色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離稱為峰高(peakheight)。用h表示。峰面積：峰與峰底之間的面積稱為峰面積(peakarea)，用A表示。第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天22§2－1保

留

值

一、保留時間（tR）從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時間為保留時間，用tR表示。第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天23§2-2色譜柱的分離效率及柱效能的評價

一、塔板理論塔板理論認(rèn)為，一根柱子可以分為n段，在每段內(nèi)組分在兩相間很快達(dá)到平衡，把每一段稱為一塊理論塔板。設(shè)柱長為L，理論塔板高度為H，則

H=L/n式中n為理論塔板數(shù)。第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天24

色譜柱的分離效率（簡稱柱效），可定量地用理論塔板數(shù)N來表示。

理論塔板數(shù)一N還與柱長有關(guān)，當(dāng)比較兩不同長度的色譜柱的柱效時，應(yīng)當(dāng)比較它們在相同柱長下的V值。理論塔板數(shù)N第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天25

可用半峰高處的峰寬(半峰寬）和保留時間的關(guān)系來表示理論塔板數(shù)N，這時關(guān)系式為：

N＝5．54(tR/Wt1/2)2﹙2﹚式中：Wt1/2-------------半峰寬例如，從圖2-3，測得tR=105mm、Wt1/2=4mm，求得N=3789，若此柱長為250mm,折成每米的理論塔板數(shù)約為15200.

第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天26§2-3分離度及影響因素一

分離度（分辨率)

研究色譜中有關(guān)分離問題時，首先就是要能定量地確定相鄰兩峰的分離程度。

從圖8-3可以看出，為了獲得較好的分離，就必須使最大峰值之間的距離增加，峰寬減小。第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天27第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天28一般用Rs來定量表達(dá)相鄰兩峰的分離程度，所以Rs是色譜中兩個組分分離好壞程度的標(biāo)志。要求RS>1.5

tR1－tR2Rs=————————1/2(W1+W2)

式中tR1、tR2分別為兩組分的保留時間，W1

、W2為色譜峰的峰底寬度

.

第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天29§5高效液相色譜的定性和定量分析

§5-1定性分析

在液相色譜中保留值定性的方法主要是用直接與已知標(biāo)準(zhǔn)物對照的方法。當(dāng)未知峰的保留值（tR′或VR′）與某一已知標(biāo)準(zhǔn)物完全相同時，則未知峰可能與此已知標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)，特別是在改變色譜柱或改變洗脫液的組成時，未知峰的保留值與已知標(biāo)準(zhǔn)物的保留值仍能完全相同，則可以基本上認(rèn)定未知峰與標(biāo)準(zhǔn)物是同一物質(zhì)。第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天30§5-2定量分析

HPLC色譜定量的基本方法有內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法等。

外標(biāo)法———標(biāo)準(zhǔn)曲線法是一種簡便、快速的絕對定量方法（歸一化法則是相對定量方法）。首先用欲測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天31具體作法是：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確量進(jìn)樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線應(yīng)是通過原點的直線。若標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點，說明測定方法存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率即為絕對校正因子。第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天32

目前已普及于幾乎所有重要的分析學(xué)科領(lǐng)域和許多科研生產(chǎn)部門，高效液相色譜能較理想地分離和分析與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)的大分子和離子型物質(zhì)，易變質(zhì)的天然產(chǎn)物，各種高分子化合物和不穩(wěn)定化合物。

例如：蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖、顏料極性類脂肪化合物、藥物、染料、表面活性劑、農(nóng)藥、甾族化合物、多環(huán)芳烴、合成聚合物、瞟吟、維生素、除銹劑、防老劑等等。

§6高效液相色譜的應(yīng)用第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天33

高效液相色譜，特別適用于分離沸點高和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)，目前已廣泛用于化工、食品、醫(yī)藥、生化、衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)和高能化合物等生產(chǎn)和科研工作中。第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天34

第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天35第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天36第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天37第37頁,共43頁，2024年2月2