高效液相色譜法原理與應用-

關于高效液相色譜法原理與應用-12第1章色譜基本原理一、色譜法概述色譜法的定義與特點色譜法的分離原理色譜法的特點色譜法的分類第2頁,共136頁，2024年2月25日，星期天31.色譜法的定義茨維特的實驗第3頁,共136頁，2024年2月25日，星期天4

色譜分離效果圖第4頁,共136頁，2024年2月25日，星期天5因此色譜法是一種分離方法。它的特點是：有兩相，一是固定相，一是流動相，兩相作相向運動。Chromatography將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。色譜分析是一種分離、分析法。第5頁,共136頁，2024年2月25日，星期天62、色譜法分離原理當流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發(fā)生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質和結構上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。第6頁,共136頁，2024年2月25日，星期天73、色譜法的分類

按流動相狀態(tài)的不同，可分為氣相色譜法(GC)液相色譜法(LC)超臨界流體色譜(SFC)第7頁,共136頁，2024年2月25日，星期天8什么是氣相色譜法？以氣體為流動相的色譜法GasChromatogaphy，簡稱GC適合分離分析易汽化（在-190℃-500℃范圍內(nèi)有0.2-10mmHg的蒸氣壓的）穩(wěn)定、不易分解、不易反應的樣品，特別適合用于同系物、同分異構體的分離。第8頁,共136頁，2024年2月25日，星期天9應用舉例（GC）第9頁,共136頁，2024年2月25日，星期天10什么是液相色譜法？以液體為流動相的色譜法LiquidChromatogaphy，簡稱LC適合分離分析高沸點、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。第10頁,共136頁，2024年2月25日，星期天11按固定相使用的形式可液相色譜法又可分為：柱色譜（ColumnChromatography）將固定相裝在色譜柱內(nèi)紙色譜（PaperChromatography）用濾紙做固定相或固定相載體的色譜薄層色譜（ThinLayChromatography）固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上第11頁,共136頁，2024年2月25日，星期天12TLC的應用123456789BandsDescription1PseudoginsenosideF112AmericanGinseng3GinsenosideRg14GinsenosideRf5Ginseng6GinsenosideRc7GinsenosideRb18Notoginseng9NotoginsenosideR1人參、西洋參和三七藥材的鑒別第12頁,共136頁，2024年2月25日，星期天13丹參藥材有效成分的HPLC圖譜1.Danshensu;2.Protocatechuicacid;3.Protocatechualdehyde;4.Caffeicacid;5.SalvianolicacidF;6.SalvianolicacidD;7.SalvianolicacidJ/isomer;8.SalvianolicacidE;9.Rosmarinicacid;10.Lithospermicacid;11.SalvianolicacidB;12.SalvianolicacidB/E/isomer;13.SalvianolicacidA;14.DihydrotanshinoneI;15.Tetrahydrotanshinone/isomer;16.Cryptotanshinone;17.TanshinoneI;18.TanshinoneIIA123456871091112161514131718第13頁,共136頁，2024年2月25日，星期天14第14頁,共136頁，2024年2月25日，星期天15拖尾峰伸舌峰鬼峰、假峰畸峰峰底基線漂移基線噪聲譜帶擴張第15頁,共136頁，2024年2月25日，星期天16死時間(tM):完全不保留組分流出系統(tǒng)的時間保留時間(tR):調整保留時間(t’R):死體積(VM):保留體積(VR):

調整保留體積(V’R):第16頁,共136頁，2024年2月25日，星期天17R:分離度tR:保留時間t0：死時間W：峰底寬度2.色譜分離基本方程第17頁,共136頁，2024年2月25日，星期天18不同R值的峰重疊情況示意圖R>1.5可以得到基線分離分離度R反映的是相鄰兩個峰的分開程度R太小，兩個峰無法徹底分離R太大，分離時間過長，工作效率低下一般要求R>1.5，也可遵循行業(yè)特殊規(guī)定第18頁,共136頁，2024年2月25日，星期天19根據(jù)該公式優(yōu)化試驗條件，提高分離度R。從數(shù)學推導來看，分別增大n，α，k值，都可以提高分離度。色譜分離基本方程第19頁,共136頁，2024年2月25日，星期天20分離選擇性（α）對分離度（R）的影響

如果t0=1minα=1.64/1.58=1.04α

=1.15/0.85=1.35α

=0.95/0.63=1.50

改變分離選擇性α的方法改用不同的流動相改變流動相的組成α并非必須大于1.5！改變流動相pH值盡量優(yōu)化前幾種實驗條件提高a值，改變柱溫避免改變固定相（買新柱子），以便降低成本應用特殊的化學效應改變固定相第20頁,共136頁，2024年2月25日，星期天21柱效（n）對分離度（R）的影響以上兩張譜圖k，,α值完全相同，僅僅由于柱效高低不同使得它們具有不同的分離度。直觀的看，峰的尖銳程度代表了柱效高低，峰越尖銳，其柱效越高，通常使用理論塔板數(shù)（n）的大小衡量柱效的高低第21頁,共136頁，2024年2月25日，星期天22理論塔板數(shù)和理論塔板高度的計算方法理論塔板數(shù)理論塔板高度HETP=L/n理論塔板數(shù)n越大，柱效越高；理論塔板數(shù)HETP越效，柱效越高第22頁,共136頁，2024年2月25日，星期天23容量因子（k）對分離度（R）的影響容量因子越大，分離度越大。

k135791113∞k/k+10.500.750.830.880.900.920.931.00但當容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將大大延長。因此，k的最佳范圍是1<k<20。改變?nèi)萘恳蜃拥姆椒ㄓ校焊淖冎鶞馗淖冎荔w積，其中死體積對k/(k+1)的影響很大。改變流動相的配比是最簡便、最有效的方法梯度洗提容量因子第23頁,共136頁，2024年2月25日，星期天24梯度洗提梯度洗脫即程序控制流動相的組成，使在整個分離過程中，溶劑強度按照特定的變化規(guī)律增加。優(yōu)點：分離復雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內(nèi)。缺點：檢測器的使用受到限制，分析結果的重復性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進行再生處理。第24頁,共136頁，2024年2月25日，星期天25第25頁,共136頁，2024年2月25日，星期天26裝置低壓梯度（內(nèi)梯度）：溶劑在常壓下混合，再用高壓泵輸送至柱系統(tǒng)。簡單、經(jīng)濟，只需一個泵，所用溶劑的元數(shù)沒有限制。高壓梯度（外梯度）：一般由兩臺高壓泵構成，每臺泵輸送一種溶劑。溶劑在混合室混合后，在輸入柱系統(tǒng)。流量精密度高，溶劑的可壓縮性和熱力學體積的變化可能影響輸入柱子中溶劑的組成。第26頁,共136頁，2024年2月25日，星期天27溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A

高壓泵B混合室低壓溶劑梯度方框圖高壓溶劑梯度方框圖第27頁,共136頁，2024年2月25日，星期天28實現(xiàn)方式對于復雜樣品，線性梯度是最好的。正相色譜中，常用二氯甲烷加入正己烷來實現(xiàn)。反相色譜中，乙腈，甲醇加入水中是最常用的。第28頁,共136頁，2024年2月25日，星期天29溫度的影響n，α，k都會受到柱溫的影響不要使用過高溫度，以保護柱子，60度算高溫溫度對平衡常數(shù)有影響，有時會影響出峰順序，注意對化合物進行定性后再定量升溫通?？梢约铀俜蛛x，縮短分析時間，但也不絕對第29頁,共136頁，2024年2月25日，星期天30三、色譜定性與定量方法第30頁,共136頁，2024年2月25日，星期天311.色譜定性分析(1)純物對照定性各物質在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標。第31頁,共136頁，2024年2月25日，星期天32實現(xiàn)方法利用保留時間和保留體積定性

第32頁,共136頁，2024年2月25日，星期天33用相對保留值定性

用已知物增加峰高法定性

第33頁,共136頁，2024年2月25日，星期天34應用范圍：適用于簡單混合物，對該樣品已有了解并具有純物質的情況。優(yōu)點：應用簡便，不需要其他儀器。缺點：定性結果的可信度不高。提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性第34頁,共136頁，2024年2月25日，星期天35(2)與其它儀器或化學方法聯(lián)合定性離線聯(lián)用方式化學法儀器法在線聯(lián)用方式化學法儀器法第35頁,共136頁，2024年2月25日，星期天36離線聯(lián)用方式收集方法：餾分收集器應用范圍：無標準物時，可對較為復雜的混合物進行定性分析缺點：麻煩第36頁,共136頁，2024年2月25日，星期天37在線聯(lián)用方式與其它儀器聯(lián)用定性

混合物經(jīng)色譜分離后，將各組分直接由接口導入其它儀器中進行定性。常用的聯(lián)用方法有：LC-FTIR、LC-MS……

其它儀器相當于色譜儀的檢測器。使用范圍：復雜樣品的定性。優(yōu)點：不需要標準物，定性結果可信度高，操作方便。缺點：需要特殊儀器或設備。第37頁,共136頁，2024年2月25日，星期天382色譜定量分析(1)色譜定量基礎

色譜定量分析是基于被測物質的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有：第38頁,共136頁，2024年2月25日，星期天39（2）定量要解決的問題峰面積的測量和計算校正因子的測量與計算色譜定量方法及其應用第39頁,共136頁，2024年2月25日，星期天40峰面積的測量與計算積分儀或色譜工作站簡便、速度快，精度高，可達0.2-2%，對小峰及不對稱峰的結果準確，是色譜發(fā)展趨勢。手動測量與計算第40頁,共136頁，2024年2月25日，星期天41峰高乘半峰寬法：適于對稱峰峰高乘峰底寬度法：適于矮寬峰峰高乘平均峰寬法：適于不對稱峰峰高乘保留值法：適于狹窄峰，快速簡便，常用于工廠控制分析。第41頁,共136頁，2024年2月25日，星期天42重疊峰的測量切線分峰垂線分峰第42頁,共136頁，2024年2月25日，星期天43連線分峰計算機擬合分峰第43頁,共136頁，2024年2月25日，星期天44校正因子的測量與計算相對校正因子由于絕對校正因子與儀器的靈敏度有關，又由于靈敏度與實驗條件相關，且每一檢測器的靈敏度都是不同的，它不容易測量準確，亦無通用性，所以實際工作中使用相對校正因子。第44頁,共136頁，2024年2月25日，星期天45質量校正因子摩爾校正因子相對響應值被測組分的質量標準物質量分子量第45頁,共136頁，2024年2月25日，星期天46定量方法校正歸一化法——含歸一化內(nèi)標法——含內(nèi)標標準曲線法外標法——含單點校正第46頁,共136頁，2024年2月25日，星期天47

校正歸一化法推導：第47頁,共136頁，2024年2月25日，星期天48應用范圍：當試樣中各組分都能流出色譜柱，且在檢測器上均有響應，各組分峰沒有重疊時，可用此法。優(yōu)點：簡便、準確，當操作條件如進樣量等變化時，對定量結果影響很小，該法適合于常量物質的定量。缺點：對該法的苛刻要求限制了它的使用。第48頁,共136頁，2024年2月25日，星期天49面積歸一化法若各組分的定量校正因子相近或相同，則上式可簡化為：第49頁,共136頁，2024年2月25日，星期天50

內(nèi)標法推導將一定量的純物質作為內(nèi)標物，加入到準確稱量的試樣中。單點校正第50頁,共136頁，2024年2月25日，星期天51適用范圍：當只需測定試樣中某幾個組分，且試樣中所有組分不能全部出峰時可用。優(yōu)點：受操作條件的影響較小，定量結果較準確，使用上不象歸一化法那樣受到限制，此法適合于微量物質的分析。缺點：每次分析必須準確稱量被測物和內(nèi)標物，不適合于快速分析。第51頁,共136頁，2024年2月25日，星期天52內(nèi)標標準曲線法（多點校正內(nèi)標法）fi,sms/m為常數(shù)K，此時Ci%=K·(Ai/As)，以Ci%對Ai/As作標準曲線。優(yōu)點：不必測校正因子，消除了某些操作條件的影響，方法簡便，適合液體試樣的常規(guī)分析。。第52頁,共136頁，2024年2月25日，星期天53

外標法（標準曲線法）用于常規(guī)分析優(yōu)點：操作簡單，計算方便。缺點：結果的準確度取決于進樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。該法必須定量進樣。第53頁,共136頁，2024年2月25日，星期天54單點校正當被測試樣中各組分的濃度變化范圍不大時而用單點校正法。即配制一個與被測組分含量十分接近的標準溶液，定量進樣，計算被測物的含量。第54頁,共136頁，2024年2月25日，星期天55（3）定量中的誤差問題樣品的代表性（樣品的前處理）進樣系統(tǒng)的影響柱系統(tǒng)的影響測量誤差定量結果的誤差分析第55頁,共136頁，2024年2月25日，星期天56HPLC主要類型及其選擇

化學鍵合相色譜法液固色譜法離子對色譜法離子色譜法體積排阻色譜法第56頁,共136頁，2024年2月25日，星期天57一、化學鍵合相色譜法1.分類正相鍵合相色譜法(Normalphasechromatography)：固定相的極性大于流動相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性或強極性化合物反相鍵合相色譜法(Reversedphasechromatography)：固定相的極性大于流動相的極性，適于分離非極性、極性和離子性化合物。應用最廣泛第57頁,共136頁，2024年2月25日，星期天58正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法反相色譜法固定相極性高～中中～低流動相極性低～中中～高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出第58頁,共136頁，2024年2月25日，星期天592.固定相

疏水基團如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等極性基團如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。第59頁,共136頁，2024年2月25日，星期天60類型分離方式應用特點C-18反相、離子對普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物C-8反相、離子對與C-18類似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，適合肽類和蛋白質苯基反相保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物-CN反相、正相選擇性與硅膠類似，保留小，用途廣-NH2反相、正相、離子交換分離糖類、核苷酸、固醇等二醇基正相分離有機酸、排阻分蛋白質等醚基反相、正相分離酚類、芳硝基化合物，保留比C-18強聚苯乙烯基反相PH使用范圍廣，對部分分離峰形好，壽命長常用固定相第60頁,共136頁，2024年2月25日，星期天61第61頁,共136頁，2024年2月25日，星期天62不同廠商固定相的比較第62頁,共136頁，2024年2月25日，星期天633.流動相

溶劑具有穩(wěn)定的化學性質溶劑的選擇與使用的檢測器要有相容性溶劑的粘度要小溶劑的沸點不能太低溶劑的純度要高且價格便宜正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，加入質子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質子給予體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，加入質子接受體甲醇，質子給予體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃。第63頁,共136頁，2024年2月25日，星期天644.影響保留值的因素溶質結構對保留值的影響：正相：溶質極性越強，官能團越多，保留值越大反相：溶質極性越弱，疏水性越強，保留值越大。溶質的保留值與其分子非極性部分的總面積有關，面積大，保留值大。第64頁,共136頁，2024年2月25日，星期天65第65頁,共136頁，2024年2月25日，星期天66烷基鍵合固定相特性對保留值的影響：反相：鍵合相烷鏈長，k大，選擇性好。第66頁,共136頁，2024年2月25日，星期天67溶劑性質：正相：溶劑極性越弱，保留越大反相：流動相表面張力大、介電常數(shù)大，則極性越強。其斥力越大，溶質與固定相鍵合越強，保留值越大。第67頁,共136頁，2024年2月25日，星期天68鹽的影響：通常加入醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無機鹽使流動相表面張力增大，對非離子性溶質，使k增加，對離子型溶質，k下降。對堿性有機物有改善峰形的作用。pH值：加入酸、堿或緩沖液，控制PH，抑制溶質的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿。第68頁,共136頁，2024年2月25日，星期天695應用第69頁,共136頁，2024年2月25日，星期天70二.液固色譜法

LiquidSolidChromatography1.固定相極性：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等非極性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等2.流動相

硅膠為固定相時：以弱極性的正構烷烴為主體，加入二氯甲烷等中等極性溶劑調節(jié)合適的洗脫強度?？捎盟畬枘z進行減活處理，或加入四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑第70頁,共136頁，2024年2月25日，星期天713.影響保留值的因素樣品分子結構溶質分子的官能團極性增加，保留值增加溶質分子的官能團數(shù)目增加，保留值增加保留值與溶質的空間效應有關保留值與吸附中心的幾何分布有關b．吸附劑吸附劑的孔徑越小，表面積越大，保留值越大吸附劑的活性越強，保留值越大，活性由流動相中的含水量來控制c．流動相第71頁,共136頁，2024年2月25日，星期天724.應用中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物結構異構體和幾何異構體混合物的分離第72頁,共136頁，2024年2月25日，星期天73第73頁,共136頁，2024年2月25日，星期天74三、離子對色譜法

Ion-pairchromatography

1.基本原理將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A+）相反的離子(B-)（稱為對離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動相中，使其與樣品離子結合生成弱極性的離子對（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對色譜

第74頁,共136頁，2024年2月25日，星期天75第75頁,共136頁，2024年2月25日，星期天76第76頁,共136頁，2024年2月25日，星期天772.固定相、流動相和離子對試劑固定相多為C18,C8反相鍵合相流動相是以水為主的緩沖液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶劑離子對試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClO4-，十二烷基磺酸根等第77頁,共136頁，2024年2月25日，星期天783.影響保留值的因素pH的影響：改善分離選擇性的有效方法。反相中，對于陰離子的分離，pH下降，k減小。離子對試劑的性質與濃度：反相中，離子對試劑烷基鏈越長，疏水性越大，k越大。溶劑的極性：反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脫強度增大，k下降。洗脫強度與極性參數(shù)、介電常數(shù)同時相關離子強度：反相中，離子強度增加，溶質k下降第78頁,共136頁，2024年2月25日，星期天794.應用有機酸、有機堿特別是強酸強堿的分析，如羧酸、磺酸、胺類、酚類、藥物、染料等反相離子對色譜分析有機酸固定相：C18烷基鍵合相流動相：0.03mol/L四丁基銨+戊醇

1.4-氨基苯甲酸；2.3-氨基苯甲酸；3.4-羥基苯甲酸；4.3-羥基苯甲酸；5.苯磺酸；6.苯甲酸；7.甲苯-4-磺酸第79頁,共136頁，2024年2月25日，星期天80色譜類型（Mode）固定相（StationaryPhase）流動相(MobilePhase)主要適用范圍(CompoundSepatated)正相色譜（Normal-Phase）硅膠、氰基、氨基有機溶劑在水中絕對不溶解的物質或同分異構體反相色譜色譜(Reversed-Phase)C-18,C-8,C-4,C-2水/有機溶劑中性、弱酸性、弱堿性物質離子對色譜(Ion-Pair)C18,C-8水/有機溶劑離子對試劑離子離子交換色譜(IonExchange)陰離子和陽離子交換劑水相/緩沖鹽對離子離子體積排阻色譜(SizeExclusion)聚酯、硅膠水相(GPC)有機相(GPC)大分子量化合物聚合物液相色譜常用類型總結：第80頁,共136頁，2024年2月25日，星期天81第3章高效液相色譜法的建立與應用第81頁,共136頁，2024年2月25日，星期天82我國藥典收載高效液相色譜法項目和數(shù)量比較表：

第82頁,共136頁，2024年2月25日，星期天83

高效液相色譜儀的分析原理高效液相色譜儀的結構色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產(chǎn)生原理高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱第83頁,共136頁，2024年2月25日，星期天84HPLC有以下特點

高壓——壓力可達150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。高速——流速為0.1~10.0ml/min。高效——可達10000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。第84頁,共136頁，2024年2月25日，星期天85HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：

速度快——通常分析一個樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。柱子可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

第85頁,共136頁，2024年2月25日，星期天86Inwhichmaterials?Inwhatconcentration?Whichsample?Withwhichtechnique?一.高效液相色譜法的建立1.了解樣品第86頁,共136頁，2024年2月25日，星期天87Whatisthesample?ConcentrationoftheinterestedcomponentContaminantCharacteristicsofthesampleStructureMolecularweightpKaSolubility第87頁,共136頁，2024年2月25日，星期天88

溶于水——排阻色譜，水為流動相相對分子質量＞2000不溶于水——排阻色譜，非水流動相同系物——分配色譜不溶于水異構體——吸附色譜樣品分子大小差異——排阻色譜反相液一液色譜相對分子質量溶于水，不離解＜2000排阻色譜，水為流動相堿——陽離子交換色譜溶于水，可離解酸——陰離子交換色譜溶于水，離子與非離子—反相離子對色譜

第88頁,共136頁，2024年2月25日，星期天892.選擇合適的分析方法AnalyticaltechniqueColumnMobilephaseDetectorSamplepreparation第89頁,共136頁，2024年2月25日，星期天903.分析條件的優(yōu)化流動相種類與配比梯度溫度流速檢測波長進樣量第90頁,共136頁，2024年2月25日，星期天91二、高效液相色譜法的應用

樣品測定1．流動相比例調整：由于我國藥品標準中沒有規(guī)定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時幾乎都須調整流動相（按經(jīng)驗，主峰一般應調至保留時間為6~15分鐘為宜）。所以建議第一次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質的流動相其重現(xiàn)性更不容易達到，請注意充分平衡柱。第91頁,共136頁，2024年2月25日，星期天92樣品測定

2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時應將玻璃容器進行硅烷化處理。

第92頁,共136頁，2024年2月25日，星期天93樣品測定3．記錄時間：第一次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質峰在較長時間內(nèi)才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。

第93頁,共136頁，2024年2月25日，星期天94樣品測定4．進樣量：藥品標準中常標明注入10

l，而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10

l、20

l和50

l），因此應注意進樣量是否一致。（可改變樣液濃度）

第94頁,共136頁，2024年2月25日，星期天95樣品測定5．計算：由于有些對照品標示含量的方式與樣品標示量不同，有些是復合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標示，檢驗時請注意。

第95頁,共136頁，2024年2月25日，星期天96方法研究

1．波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如最靈敏的測量波長并避開其它物質的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。2．流動相選擇：盡量采用不是弱電解質的甲醇-水流動相。

第96頁,共136頁，2024年2月25日，星期天97食品分析第97頁,共136頁，2024年2月25日，星期天98第98頁,共136頁，2024年2月25日，星期天99第99頁,共136頁，2024年2月25日，星期天1002.環(huán)境分析第100頁,共136頁，2024年2月25日，星期天101第101頁,共136頁，2024年2月25日，星期天1023.藥物分析第102頁,共136頁，2024年2月25日，星期天103第103頁,共136頁，2024年2月25日，星期天104

人參皂苷的分析第104頁,共136頁，2024年2月25日，星期天1055.農(nóng)藥分析第105頁,共136頁，2024年2月25日，星期天106第4章儀器使用細節(jié)第106頁,共136頁，2024年2月25日，星期天1071.HPLC用水專門的純水機或超純水機；去離子水重蒸；二次或三次重蒸水；采用類似家用的純水機；市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水；其它途徑；第107頁,共136頁，2024年2月25日，星期天1082.樣品溶解樣品用溶劑最好是流動性，或者用溶劑強度與流動相相近的溶劑。進樣樣品要求無微粒，樣品溶液均要用0.45μm的濾膜過濾。第108頁,共136頁，2024年2月25日，星期天1093.流動相的配制流動相通常按體積比配制。流動相在使用前一般都需要過濾，尤其使用了加緩沖鹽的流動相時。如果沒有自動脫氣裝置，流動相配好后應該采用合適的方法脫氣，如超聲波脫氣，真空脫氣、氦氣脫氣等。第109頁,共136頁，2024年2月25日，星期天110在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側緊貼進樣器密封管內(nèi)側，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。盡快轉動閥，不能停留在中途，否則過高的壓力在柱頭上引起損壞。六通閥進樣器的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。使用部分裝液法進樣時，進樣量最多為定量環(huán)體積的75，并且要求每次進樣體積準確、相同；使用完全裝液法進樣時，進樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20μl的定量環(huán)最少進樣60至100μl的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達到所要求的精密度及重現(xiàn)性。4.六通閥的使用第110頁,共136頁，2024年2月25日，星期天111防止微粒阻塞進樣閥和減少對進樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質留在進樣系統(tǒng)中，每次結束后應沖洗進樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，在進樣閥的Load和Inject位置反復沖洗，。第111頁,共136頁，2024年2月25日，星期天1125.泵的保養(yǎng)使用流動相盡量要清潔；進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相交換時要防止沉淀；避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；第112頁,共136頁，2024年2月25日，星期天113色譜柱問題及解決方法：保留值和分離度的重現(xiàn)性：影響方法的準確度與精密度譜峰拖尾：分離質量下降，精密度下降色譜柱壽命6.色譜柱第113頁,共136頁，2024年2月25日，星期天114第114頁,共136頁，2024年2月25日，星期天115樣品溶劑對分離結果的影響第115頁,共136頁，2024年2月25日，星期天116柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；當柱子和色譜儀聯(lián)結時，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；進樣樣品要提純；嚴格控制進樣量；每天分析工作結束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗?；若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封閉；第116頁,共136頁，2024年2月25日，星期天117高效液相色譜柱發(fā)展史19世紀70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：10μm的無定型硅膠顆粒。70年代后期，發(fā)展了反相液相色譜。80年代，HPLC被廣泛應用于化合物的分離，主要填料：粒徑為5～10μm球形硅膠。90年代早期，粒徑為5μm的高純硅膠，即所謂的B型硅膠被發(fā)展，并成為這個行業(yè)填料的標準，這種B型硅膠含有微量的金屬。90年代后期，為了滿足快速分離的需求，發(fā)展了3μm或3.5μm的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認同和接受。21世紀早期，為適應超快速的分離要求，粒徑小于2μm的填料被開發(fā)出來，發(fā)展出了整體柱、無機和有機雜化硅膠。目前，市場上流行的分析用的HPLC硅膠基質填料主要為B型硅膠。第117頁,共136頁，2024年2月25日，星期天118PLC色譜柱及其填料的特征HPLC色譜柱的基質材料硅膠與聚合物現(xiàn)代高效液相色譜填料的特征色譜柱結構固定相鍵合相色譜柱接頭鍵合相穩(wěn)定性第118頁,共136頁，2024年2月25日，星期天119硅膠基質材料目前應用最為廣泛的基質材料。高機械強度和高的比表面積?？衫弥苯拥膹V泛的表面鍵合反應來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。高效。重現(xiàn)性好。pH適用范圍為pH2－8。具有容易導致強堿性物質拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基。第119頁,共136頁，2024年2月25日，星期天120聚合物基質材料交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。

pH穩(wěn)定性好：pH1－13。可以在很寬的范圍內(nèi)進行表面化學處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求。在中等pH條件下對強堿性物質具有更好的峰形。填料的體積隨著流動相的不同而改變，如膨脹或收縮。分離效率相對硅膠而言比較低重現(xiàn)性不好第120頁,共136頁，2024年2月25日，星期天121硅膠外形球形硅膠:現(xiàn)代HPLC填料粒徑小(5μm,3μm,<2μm)重現(xiàn)性好穩(wěn)定性好分離效率高無定型硅膠:最初的HPLC填料粒徑>5μm柱床穩(wěn)定性差比表面積較小價格便宜第121頁,共136頁，2024年2月25日，星期天122硅膠純度硅膠純度對強極性化合物的分離最重要。以前的純度較低的硅膠（稱為A型硅膠）,A型硅膠是以金屬硅酸鹽制備而來，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的分離。純度高、酸性較弱的硅膠(稱為B型硅膠)，這種硅膠是以無金屬的工藝制備而來，只含有微量的金屬，建議用于分離離子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化合物。金屬雜質引起對螯合劑和堿性化合物的分離產(chǎn)生不對稱峰或拖尾峰。第122頁,共136頁，2024年2月25日，星期天123硅膠純度M+表面金屬能與螯合化合物絡合MSiOH內(nèi)部的金屬對表面硅羥基具有活化作用強酸性A型硅膠C18B型硅膠C18第123頁,共136頁，2024年2月25日，星期天124硅膠孔徑孔徑作用和效能<60nm對HPLC分析沒有用，會引起峰形拖尾和較低的分離效率60–150nm對小分子的分離效果理想(MW<4,000to130,000),例如藥物分子、傳統(tǒng)的中藥和小分子的縮氨酸300–1,000nm對大分子的分離效果理想，如多肽、核苷和高分子>1,000nm對聚合物的分離效果理想，如DNA和生物大分子第124頁,共136頁，2024年2月25日，星期天125硅膠粒徑粒徑作用和效能5μm目前應用最廣泛，可以滿足從分析到半制備的分離3–3.5μm常用于分析柱上的快速分離，色譜柱短，節(jié)省溶劑<2μm常應用于超快速分離，highthroughput,分離度高7–10μm常用于半制備色譜柱10–20μm常用于制備色譜柱第125頁,共136頁，2024年2月25日，星期天126HPLC色譜柱結構類型內(nèi)徑D(cm)柱長(cm)粒徑(μm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制備柱0.8–1.010-255-20制備柱2.0–5.010-255-20第126頁,共136頁，2024年2月25日，星期天127鍵合相鍵合相:反相:70%;C18,65%;C8,15%;Cyano,5%,苯基柱<5%,正相:20%;

硅膠、-NH2、-CN其它(手性柱,離子交換柱):10%反相色譜是目前應用得最為廣泛的高效液相色譜方法。C18和C8在反相色譜終應用得最為廣泛。第127頁,共136頁，