抗氧化三肽的定量構(gòu)效關(guān)系及抗氧化作用分子機(jī)理研究

抗氧化三肽的定量構(gòu)效關(guān)系及抗氧化作用分子機(jī)理研究自由基代謝失衡可誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。抗氧化肽清除自由基的作用已得到廣泛認(rèn)同,作為一種新型安全的抗氧化劑,抗氧化肽在功能性食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。但由于高活性抗氧化肽的序列特征、活性位點(diǎn)及抗氧化作用機(jī)理尚未完全弄清,難以指導(dǎo)高活性抗氧化肽的設(shè)計(jì)和篩選,阻礙了其大規(guī)模應(yīng)用。本論文以抗氧化三肽為研究對(duì)象,揭示抗氧化三肽的定量構(gòu)效關(guān)系（quantitativestructure-activityrelationship,QSAR）,用于預(yù)測(cè)抗氧化三肽的活性,繼而指導(dǎo)高活性抗氧化三肽的設(shè)計(jì),采用多種體外活性評(píng)價(jià)體系篩選高活性抗氧化三肽,并在兩種細(xì)胞模型中闡明其抗氧化作用機(jī)理,為開(kāi)發(fā)高活性抗氧化三肽奠定理論基礎(chǔ)。本文的主要研究結(jié)果如下:（1）針對(duì)高活性抗氧化三肽序列特征不明確的問(wèn)題,建立了2D-QSAR模型用于預(yù)測(cè)抗氧化三肽活性并指導(dǎo)高活性抗氧化三肽的設(shè)計(jì)。從文獻(xiàn)中篩選91條抗氧化三肽,基于天然氨基酸的134種物理化學(xué)性質(zhì),用逐步回歸（SWR）法篩選7種表征抗氧化三肽的結(jié)構(gòu)參數(shù),結(jié)合多元線性回歸（MLR）、偏最小二乘法（PLS）、支持向量機(jī)（SVM）和隨機(jī)森林（RF）算法建立了四種抗氧化三肽2D-QSAR模型。結(jié)果表明SWR-MLR、PLS、SWR-SVM、SWR-RF四種模型均具有良好的擬合能力和穩(wěn)定性(²_（64）9)>0.8,²>0.7,²₀)>0.8),其中PLS模型的擬合能力最好(²_（64）9)=0.902),SWR-MLR模型穩(wěn)定性最好(²=0.798,²_-17)（9）>0.792)。利用SWR-MLR模型的標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)預(yù)測(cè)了高活性抗氧化三肽各位點(diǎn)的有利氨基酸和不利氨基酸殘基,結(jié)果顯示C-端氨基酸為Pro、Tyr、Trp;N-端氨基酸為Cys、Tyr、Trp;2位氨基酸為Ile,Val,Lys,Leu是各位點(diǎn)的有利氨基酸殘基。合成19種抗氧化三肽對(duì)各模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)合成三肽的總抗氧化能力（ABTS法）實(shí)驗(yàn)值高于模型預(yù)測(cè)值,各位點(diǎn)有利氨基酸殘基對(duì)抗氧化三肽總抗氧化活性（ABTS法）的貢獻(xiàn)趨勢(shì)與SWR-MLR模型標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)預(yù)測(cè)的趨勢(shì)一致。（2）設(shè)計(jì)篩選高活性抗氧化三肽,進(jìn)一步確定高活性抗氧化三肽結(jié)構(gòu)特征。依據(jù)各位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)氨基酸設(shè)計(jì)合成27條抗氧化三肽及18條去掉C-端或N-端的二肽,采用亞油酸氧化抑制、DPPH法、ABTS法、ORAC法、FRAP法進(jìn)行體外活性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示在亞油酸氧化抑制、ABTS、ORAC評(píng)價(jià)體系中YXY（X=Ile,Val,Lys）為高活性抗氧化三肽特征序列。在亞油酸氧化抑制評(píng)價(jià)體系中,YVY的活性最高,其亞油酸氧化抑制率與同濃度α-tocopherol相當(dāng);在ORAC、ABTS評(píng)價(jià)體系中YIY的活性最高,ORAC值為4.53±0.12μMTE/μM,與GSH（4.85±0.13μMTE/μM）相當(dāng);ABTS值為6.56±0.33μMTE/μM,高于GSH（1.86±0.24μMTE/μM）。DPPH體系中YXC（X=Ile,Val,Lys）為高活性抗氧化三肽特征序列,YKC的活性最高(IC₅₀=76.235μM)。FRAP評(píng)價(jià)體系中PXY（X=Ile,Val,Lys）為高活性抗氧化三肽特征序列,PVY(3.75±0.33Fe²⁺μM/μM)顯示了最強(qiáng)的抗氧化活性。體外活性評(píng)價(jià)篩選出YIY、YVY、YKC、PVY四條高活性抗氧化三肽。（3）利用兔血紅細(xì)胞氧化損傷模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)YIY、YVY、YKC、PVY的抗氧化活性。YIY、YVY、YKC、PVY均能有效抑制AAPH誘導(dǎo)的兔血紅細(xì)胞溶血,濃度為2mg/mL的YIY、YVY、YKC、PVY使兔血紅細(xì)胞氧化損傷溶血率分別下降61.19%,51.14%,31.96%,45.81%。四種抗氧化三肽通過(guò)抑制兔血紅細(xì)胞脂質(zhì)氧化、減少細(xì)胞內(nèi)ROS生成、提高氧化損傷兔血紅細(xì)胞中SOD、GSH-Px酶的活性,提高兔血紅細(xì)胞中GSH/GSSG的比率,起到抗氧化作用,四種抗氧化三肽的保護(hù)作用呈現(xiàn)濃度依賴趨勢(shì)。依據(jù)抗氧化三肽對(duì)兔血紅細(xì)胞溶血抑制率,選擇抗氧化活性強(qiáng)的YIY和YVY進(jìn)行后續(xù)研究。（4）利用Caco-2細(xì)胞模型進(jìn)一步研究了YIY、YVY的抗氧化活性及其抗氧化作用的分子機(jī)理。采用細(xì)胞形態(tài)觀察、試劑盒檢測(cè)、流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)、Real-timePCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù),探究了YIY、YVY對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)理。發(fā)現(xiàn)濃度0.5³mg/mL的YIY、YVY對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)明顯毒性。YIY、YVY能顯著抑制氧化損傷Caco-2細(xì)胞活力下降,減少細(xì)胞中MDA的生成及LDH的泄漏,保護(hù)作用表現(xiàn)濃度依賴趨勢(shì)。YIY、YVY對(duì)氧化損傷Caco-2細(xì)胞中CAT、GSH-Px、SOD、GR酶活性下降有顯著抑制作用,能提高細(xì)胞中GSH/GSSG比率,恢復(fù)細(xì)胞氧化還原平衡。3mg/mLYIY、YVY可抑制氧化損傷Caco-2細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá),促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),抑制促凋亡蛋白Bax蛋白的表達(dá)。YIY、YVY預(yù)孵育可上調(diào)氧化損傷Caco-2細(xì)胞中Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路調(diào)控的下游抗氧化相關(guān)基因Ho-1,Nqo1和Gstm1的表達(dá),促進(jìn)HO-1、NQO1和GSTM1蛋白的表達(dá)。本論文結(jié)合生物信息學(xué)中QSAR理論建立了抗氧化三肽活性預(yù)測(cè)模型,基于SWR-MLR模型設(shè)計(jì)并篩選了YIY、YVY、YKC、