中國(guó)產(chǎn)NDM-1細(xì)菌流行現(xiàn)狀及bla-(NDM-1)基因跨種屬轉(zhuǎn)移機(jī)制研究

中國(guó)產(chǎn)NDM-1細(xì)菌流行現(xiàn)狀及bla_(NDM-1)基因跨種屬轉(zhuǎn)移機(jī)制研究NDM-1型碳青霉烯酶是2009年發(fā)現(xiàn)的一種新型金屬p-內(nèi)酰胺酶,具有對(duì)頭孢菌素及碳青霉烯類抗生素的高效水解活性。至今,產(chǎn)NDM-1酶菌株已經(jīng)呈全球范圍播散,成為嚴(yán)重威脅人類健康的“超級(jí)細(xì)菌”。但是目前,我國(guó)NDM-1菌株的流行病學(xué)數(shù)據(jù)缺乏,blaNDM-1基因迅速播散的機(jī)制仍不明確。本研究第一部分對(duì)收集于2009年1月至2010年9月間來自全國(guó)18個(gè)省市,57家醫(yī)院的非重復(fù)革蘭陰性桿菌12024株,其中大腸埃希菌3439株、肺炎克雷伯菌2840株、不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌2835株以及銅綠假單胞菌2910株,運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)blaNDM-1基因進(jìn)行篩查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)13株菌攜帶有blaNDM-1基因,均為不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌。患者流行病學(xué)資料回顧性分析結(jié)果顯示：其中8位患者年齡>60歲、4位<7歲,13位患者中只有2例發(fā)生死亡；所有患者半年內(nèi)均未有出國(guó)旅游史。13株菌來自于10個(gè)不同的省份及9個(gè)不同的科室,7例來源于痰標(biāo)本、3例血液、2例分泌物及1例尿液標(biāo)本。篩查結(jié)果提示,在我國(guó)NDM-1菌株尚未出現(xiàn)流行,不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌為blaNDM-1基因的重要攜帶菌,這與國(guó)外眾多研究結(jié)果不同。由于不動(dòng)桿菌屬菌種數(shù)目多、菌種間性狀相似度高,該屬細(xì)菌的菌種鑒定一直是個(gè)難點(diǎn)。為對(duì)13株菌進(jìn)行準(zhǔn)確菌種鑒定,我們除使用生化鑒定外,依次采用了blaOXA-51-like基因、16S-23SrRNAITS區(qū)序列、ARDRA酶切分析及rpoB基因序列分析等四種方法。結(jié)果顯示13株菌中,A.baumannii4株,A.pittii3株,A.lwoffii、A.johnsonii、A.genospecies10、A.haemolyticus、A.junii及A.genospecies15TU各1株。運(yùn)用E-test藥敏條對(duì)菌株進(jìn)行抗菌藥物MIC值測(cè)試,結(jié)果顯示13株不動(dòng)桿菌菌株對(duì)包括碳青霉烯類在內(nèi)的所有p-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)出一致的體外耐藥表型,對(duì)氨基糖苷類(慶大霉素和阿米卡星)、喹諾酮類(環(huán)丙沙星)及單環(huán)酰胺類(氨曲南)等抗生素的藥敏表型有差異,對(duì)多粘菌素類(多粘菌素)、甘氨酰環(huán)素類(替加環(huán)素)及四環(huán)素類(米諾環(huán)素)均表現(xiàn)為敏感。在此基礎(chǔ)上,本研究的第二部分內(nèi)容通過S1-酶切后脈沖場(chǎng)凝膠電泳(S1-PFGE)聯(lián)合Southernblot雜交技術(shù)對(duì)13株不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌的blaNDM-1基因進(jìn)行定位,運(yùn)用質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性；通過酶切克隆研究blaNDM-1基因的周圍結(jié)構(gòu)；進(jìn)一步運(yùn)用第二代高通量測(cè)序技術(shù)完成了ABC8415菌株blaNDM-1質(zhì)粒的測(cè)序,并根據(jù)pABC8415質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCRmapping研究其余12株菌的blaNDM-1質(zhì)粒序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn),對(duì)blaNDM-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)與耐藥基因傳遞間的關(guān)系進(jìn)行了深入探討。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,所有菌株blaNDM-1基因均定位于質(zhì)粒上,質(zhì)粒大小30-55kb。除菌株ABC207外,其余12株菌的blaNDM-1質(zhì)粒均通過接合成功進(jìn)入E.coliJ53接合受體菌中,藥敏結(jié)果提示E.coliJ53接合子對(duì)頭孢菌素類抗生素耐藥,但對(duì)碳青霉烯類仍表現(xiàn)為敏感,推測(cè)可能是由于供、受體菌間種屬的差異導(dǎo)致NDM-1酶不能在受體菌E.coliJ53中充分表達(dá)所致。9株非鮑曼不動(dòng)桿菌blaNDM-1質(zhì)粒均能通過轉(zhuǎn)化的方式進(jìn)入電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)菌A.baylyiADP1,轉(zhuǎn)化子成功獲得NDM-1酶介導(dǎo)對(duì)頭孢菌素類及碳青霉烯類抗生素的耐藥性。blaNDM-1基因周圍結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示該基因位于具有轉(zhuǎn)移功能的大片段轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)Tn125上,該完整的Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)為9個(gè)基因的串聯(lián)排列,順序?yàn)椋篒SAba125-blaNDM-1-bleo-trpF-dsbc-cutA1-groES-groEL-ISAba125。在13株菌中發(fā)現(xiàn)了5種不同大小的轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)(命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu))。此5種轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別是blaNDM-1基因下游序列發(fā)生了不同長(zhǎng)度的截短,推測(cè)下游拷貝的ISAba125轉(zhuǎn)座酶是參與轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的主要原因；而上游拷貝的ISAba125與blaNDM-1基因關(guān)系密切,構(gòu)成穩(wěn)定的ISAba125-blaNDM-1基因簇,是介導(dǎo)blaNDM-1基因在不同菌種間傳遞的主要轉(zhuǎn)移酶。為明確ISAba125對(duì)blaNDM-1基因轉(zhuǎn)移的作用以及blaNDM-1基因在不同種屬細(xì)菌(包括腸桿菌科細(xì)菌及非發(fā)酵菌)中的進(jìn)化關(guān)系,我們從NCBI上公布的、來源于不同菌屬菌種的、帶有ISAba125-blaNDM-1基因簇的參考序列中挑選出了9條序列,與本研究中13條序列進(jìn)行基因相似性聚類分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析親緣關(guān)系。納入的參考序列來源菌種分別為大腸埃希菌2株、弗氏構(gòu)櫞酸桿菌1株、普羅威登菌屬2株、鮑曼不動(dòng)桿菌2株以及銅綠假單胞菌2株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)22條序列分為兩簇ClusterⅠ及Ⅱ,9條參考序列與8條本實(shí)驗(yàn)序列均歸入ClusterI簇,另外5條歸入ClusterⅡ簇,兩簇間親緣關(guān)系非常近,序列相差最多6bp。也就是說ISAba125-blaNDM-1基因簇在不同種屬細(xì)菌中具有穩(wěn)定性,不同種屬細(xì)菌間ISAba125-blaNDM-1的進(jìn)化關(guān)系是平行的。pABC8415質(zhì)粒全長(zhǎng)39365bp,具有31個(gè)CDS,其中已知蛋白20個(gè),未知蛋白11個(gè),未找到質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)蛋白。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)包括了兩個(gè)部分：骨架區(qū)及可變區(qū)。骨架區(qū)編碼與質(zhì)粒復(fù)制、轉(zhuǎn)移及毒力等功能相關(guān)的基本蛋白,GC含量為37.26%；可變區(qū)則即blaNDM-1基因所在Tn125轉(zhuǎn)座區(qū),GC含量高達(dá)61.42%。PCRmapping結(jié)果揭示其余12株細(xì)菌blaNDM-1質(zhì)粒與pABC8415質(zhì)粒結(jié)構(gòu)非常相似,該類未知型別質(zhì)粒僅在NDM-1不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中特異性存在。根據(jù)Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)區(qū)的GC含量變化推測(cè)該區(qū)域外源性的可能性大,攜帶有blaNDM-1基因的Tn125轉(zhuǎn)座子以大片段水平轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)入質(zhì)粒。通過比對(duì)Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)序列在不動(dòng)桿菌屬與腸桿菌科細(xì)菌間的差異,我們推測(cè)blaNDM-1基因是從其他未知高GC物種經(jīng)由不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌進(jìn)入腸桿菌科細(xì)菌中的進(jìn)化順序。本部分研究可以得出以下幾個(gè)結(jié)論：blaNDM-1質(zhì)粒及ISAba125轉(zhuǎn)座酶是介導(dǎo)blaNDM-1基因在不動(dòng)桿菌屬不同菌種間水平轉(zhuǎn)移的重要轉(zhuǎn)座元件；而不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌是blaNDM-1基因進(jìn)入腸桿菌科細(xì)菌的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié)。鑒于國(guó)外有關(guān)blaNDM-1基因廣泛存在于腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒上的報(bào)道,為了解blaNDM-1質(zhì)粒在腸桿菌科細(xì)菌與不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌之間序列特征上的差異,探索blaNDM-1基因的跨種屬水平轉(zhuǎn)移機(jī)制,我們對(duì)一株來源于弗氏枸櫞酸桿菌的blaNDM-1質(zhì)粒進(jìn)行了研究。通過基因定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)blaNDM-1基因定位于50-78.2kb大小的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒上,質(zhì)粒型別IncX3型,全質(zhì)粒GC含量49.03%。該blaNDM-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)也由骨架區(qū)(40kb)及可變區(qū)(14kb)兩部分組成。質(zhì)粒的骨架區(qū)包括了諸如復(fù)制蛋白基因(repBgene)及鞭毛基因(pilXgenes)等編碼質(zhì)粒功能蛋白的基因。blaNDM-1基因定位于可變區(qū),該區(qū)同時(shí)含有另一個(gè)β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaSHV-12,位于blaNDM-1基因下游；可變區(qū)有許多與基因轉(zhuǎn)移相關(guān)的Is元件或轉(zhuǎn)座子,如IS26,ISAba125、IS26、IS5、tnpA和tnpF；blaNDM-1基因上游的ISAba125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)被ⅠS5轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)插入打斷。通過比對(duì)該質(zhì)粒序列與不動(dòng)桿菌屬Ⅰ型Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn)兩者均攜帶有與blaNDM-1基因親緣關(guān)系密切的一簇基因blaNDM-1-bleo-trpF-ds6C-cutA1-groEL-insE-tnpA,片段大小8321bp,該區(qū)域的GC含量為58%,命名為NCT(NDM-1compositetransposon,NDM-1復(fù)合轉(zhuǎn)座子)區(qū)；而pCFNDM-CN除NCT區(qū)以外的區(qū)域與肺炎克雷伯菌pIncX-SHV質(zhì)粒(序列號(hào)JN247852)很相似(覆蓋度96%,相似度99%)。因此,我們推測(cè)NCT區(qū)是外源性的,是由ISAba125轉(zhuǎn)座