第六章蛋白質(zhì)的分離純化

第六章蛋白質(zhì)的分離純化第1頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)中的功能團

末端α－NH2

末端α－COOH

側(cè)鏈基團

所以，蛋白質(zhì)的化學(xué)物理性質(zhì)＝AA第2頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月

A．蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，能和酸或堿發(fā)生作用。

B．蛋白質(zhì)分子的可解離基團來自側(cè)鏈上的功能團。

C．結(jié)合蛋白質(zhì)輔基成分包含可解離蛋白質(zhì)

D．末端α-COOH,α-NH2

E．蛋白質(zhì)分子中可解離基團的pK'和游離AA中相應(yīng)基團的pK'值完全不相同。

∵在蛋白質(zhì)分子中受到鄰近電荷的影響

F．蛋白質(zhì)可看作一個多價離子第3頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)等電點--在某一pH值，蛋白質(zhì)所帶的正電荷與負電荷恰好相等，凈電荷為零。這一pH稱為蛋白質(zhì)等電點第4頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月等離子點--沒有其他鹽類干擾時，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團界離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的pH稱等離子點。特征常數(shù)。第5頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月二．蛋白質(zhì)分子的大小與形狀

㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量

第6頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量蛋白質(zhì)在各種介質(zhì)中（PAGE）電泳時，它的遷移率

第7頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月這樣造成兩個后果：①SDS為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負電荷超過蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。

因此，所有SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時均以同樣的電荷/蛋白質(zhì)比向正極移動。

②改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。第8頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS-蛋白質(zhì)在水溶液中長橢圓棒，短軸直徑均為1.8nm,長軸長度則隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地變化。

電泳遷移率μ與多肽鏈分子量的對數(shù)有下列關(guān)系第9頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月(七)毛細管電泳測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量

毛細管電泳（CE）則可以在很大程度上克服常規(guī)方法時間長、靈敏芽低不利情況。用毛細管電泳測定蛋白質(zhì)分子量僅需要納克量蛋白質(zhì)，而且還可以用積分儀或電腦聯(lián)機精確定量。

第12頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月(八)質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子量

質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子量是近年來發(fā)展的一項新技術(shù)，其分辨率和精確度都較前幾項技術(shù)高。尤其近幾年發(fā)展起來的磁質(zhì)譜可精確測定分子質(zhì)量2000Da以下的多肽；而電噴霧質(zhì)譜（ESI）可以測5萬Da的蛋白質(zhì)，而且只需要皮摩爾（pmol）量的蛋白質(zhì)，精確度為0.01%。第13頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月三．蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀1．蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)溶液是分散系統(tǒng)：分散相是蛋白質(zhì)分子顆粒，分散介質(zhì)是水。

分散程度膠體系統(tǒng)

分散相質(zhì)點真溶液（質(zhì)點是分子，均相系統(tǒng)）第14頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月分散程度--以分散相質(zhì)點的直徑來衡量根據(jù)分散程度：

第15頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月分散相質(zhì)點在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定需三個條件：a．分散相質(zhì)點1-100nmb．分散相質(zhì)點帶有同種電荷，互相排斥不聚成顆粒而沉淀c．分散相的質(zhì)點能與溶劑形成溶劑化層第16頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)：a.膠體質(zhì)點的范圍c．丁達爾效應(yīng)

d．布朗運動

e．不能透過半透膜第17頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質(zhì)的沉淀

第18頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月沉淀蛋白質(zhì)的方法：

①鹽析法：

中性鹽（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→蛋白質(zhì)脫去水化層

優(yōu)點：不引起蛋白質(zhì)變性

②有機溶劑沉淀法：

極性有機溶劑（甲醇，乙醇，丙酮）－→脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點間的相互作用

條件：低溫操作

縮短時間

第19頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月③重金屬鹽沉淀法

當溶液pH>pI,蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷,易與重金屬離子(Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀

用途：搶救誤服重金屬鹽的病人第20頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月④生物堿試劑和某些酸類沉淀法

生物堿試劑－－能引起生物堿沉淀的一類試劑

當溶液pH<pI時,蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷→易與生物堿試劑,酸根負離子反應(yīng)→沉淀

用途：臨床除去體液中干擾測定的蛋白質(zhì)第21頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月⑤加熱變性測定法原因：

a．加熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，損壞了水化層

b．蛋白質(zhì)處于等電點破壞了帶電狀態(tài)。

用途：制豆腐（加熱+少量鹽鹵）第22頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月四蛋白質(zhì)分離提純的一般原則

蛋白質(zhì)提純的總目標--增加制品純度或比活性、幾增加單位蛋白質(zhì)質(zhì)量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性。第23頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月①前處理：

第24頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月材料獲得：（一）天然材料：新鮮，含量豐富，易于提取，價格便宜。

e.g.鈣調(diào)素：動物的腦組織，植物花粉

胰蛋白酶抑制劑：大豆種子

溶菌酶：雞蛋清

抗體：血清（二）基因工程產(chǎn)物：對于天然不易得到的蛋白，通過工程菌或工程細胞表達而獲得。第25頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月②粗分離蛋白質(zhì)混合提取液

∣

∣鹽析法、等電沉淀、有機溶劑

↓

所要蛋白質(zhì)與其他雜蛋白質(zhì)分開

特點：簡便、處理量大、既能除去大量雜，又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。第26頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月粗分離（一）破細胞動物，植物細胞：勻漿，研磨大腸桿菌：凍融，超聲，溶菌酶第27頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）抽提

1.pH：選擇合適pH的緩沖液，如Tris，磷酸鹽，醋酸鹽，檸檬酸鹽緩沖體系，保證待分離蛋白在此pH條件下穩(wěn)定。一般緩沖液濃度為20－50mM。2.溫度：低溫如4－10℃，蛋白酶活性較低。3.離子強度：如0.1－0.2MNaCl或KCl.4.其他成分：還原劑如NaHSO4，維生素C；巰基保護劑DTT，巰基乙醇；金屬螯合劑EDTA，EGTA；蛋白酶抑制劑PMSF。第28頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）初步分離1.分離細胞器：離心，超離心2.除核酸：酶法DNase,RNase；超聲3.除脂肪：丙酮，脂肪酶（四）粗分蛋白

1.鹽析：NaCl，(NH4)2SO4沉淀2.有機溶劑抽提：甲醇，乙醇，丙酮3.等電點沉淀：除去雜蛋白4.熱變性：除去雜蛋白（五）除鹽

1.超濾2.凝膠過濾3.凍干

第29頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月③細分離第30頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月④結(jié)晶：本身伴隨著一定程度的提純

重結(jié)晶：可除去少量夾雜的蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)純度愈高、溶液愈濃就愈容易結(jié)晶第31頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月五蛋白質(zhì)混合物的分離方法

第32頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月(一）據(jù)分子大小不同的分離方法

1．透析和超過濾

利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機鹽、單糖、水等分開。第33頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月超過濾

利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上。第35頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月2密度梯度（區(qū)帶）離心原理第36頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月3凝膠過濾（凝膠過濾層析，分子排阻層析）（分子篩層析，凝膠滲透層析）

根據(jù)分子分離蛋白質(zhì)混合物

第37頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月⑴凝膠過濾的介質(zhì)常用介質(zhì)：(1)Sephadex:(交聯(lián)葡聚糖)G25,G50,G75,G100Bio-gel:(聚丙烯酰胺)P-6，P-30，P-60，P-100Sepharose:(瓊脂糖)2B,4B,6B(2)Sephacryl:S100,S200,S300(3)Superose:HPLC(4)superdex:HPLC第38頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月

凝膠珠--多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

交聯(lián)度or孔度（網(wǎng)孔大?。瓫Q定凝膠的分級范圍，即能被該凝膠分離開來的蛋白質(zhì)混合度的分子量范圍。

排阻極限－－表示分級范圍的上限，不能擴散進入凝膠珠微孔的最小分子量的分子量。第39頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠粒度--篩眼（目）數(shù)，珠直徑表示

∣

－－→與洗脫流速，分辨率有關(guān)第40頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月⑵凝膠過濾的原理

當不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外。隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠珠的內(nèi)外。第41頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月不同分子大小路徑不同

大分子--先洗脫出來

小分子--后洗脫出來第42頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月有關(guān)凝膠柱體積的術(shù)語

Vt為凝膠柱床的總體積（totalvolume），常稱柱床體積。它可以用水直接測量或按幾何形狀計算而得。

Ve為某一溶質(zhì)組分的洗脫體積（elutionvolume）。它是自加樣開始到該組分的洗脫峰或洗脫峰上升邊緣的半高點出現(xiàn)使所流出的體積。第44頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月V0為孔隙體積（voidvolume）或稱外體積（outervolume）或外水體積。測定不能被凝膠滯留的大分子溶質(zhì)如藍色葡聚糖（bluedextran，分子量約200000）的洗脫體積可以決定V0。直徑均勻的剛性球形顆粒的柱床V0約等于0.35Vt。

Vi為內(nèi)體積（innervolume）或稱水體積，它可由于膠克重乘其吸水值（以毫升/克表示）近似地表示，或直接測出凝膠柱小分子物質(zhì)（如T2O，tritiumoxide）通過的洗脫體積再減去外體積得來。第45頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月

Vm為凝膠基質(zhì)體積（matrixvolume）。

凝膠床內(nèi)各種體積之間的關(guān)系是：

Vt=V0+Vi+Vm

其中，（Vi+Vm）亦即（Vt-V0）是凝膠珠的總體積。

第46頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月

假定凝膠與待分離的溶質(zhì)之間不存在相互作用，那么凝膠過濾可以看成是一種液-液分配層析。凝膠珠內(nèi)的水相是固定相（Vi），凝膠珠外的水相是流動相（V0），溶質(zhì)在Vi和V0之間分配。能進入Vi的溶質(zhì)的量決定于它的大小和凝膠孔的大小。溶質(zhì)在柱中的移動速度取決與它在兩相之間的分配系數(shù)（Kd）：第47頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月Kd是溶質(zhì)分子大小的函數(shù)，而與凝膠床的幾何形狀無關(guān)。對于完全被排阻在凝膠珠內(nèi)外的大分子來說，它們將在同一洗脫峰出現(xiàn)，Ve=V0，Kd=0；對于完全能自由出入凝膠珠內(nèi)外的小分子，Ve=V0+Vi，Kd=1；對于在分級范圍內(nèi)的中等分子，凝膠珠內(nèi)部的有些微孔它們能擴散進去，有些則不能，因此一般情況下，Kd總是在0與1之間。

第48頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月但有時發(fā)現(xiàn)Kd＞1，這表明凝膠對溶質(zhì)有吸附作用。整理上式得：

Ve=V0+KdVi

從這個式子可以看出，某一溶質(zhì)的Kd就是該溶質(zhì)能擴散進入珠內(nèi)的空間部分占其總空間（Vi）的分數(shù)。

第49頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月由于實際測定Vi有困難，所以上述的公式很少使用。經(jīng)修正，用凝膠珠內(nèi)的總體積代替上式中的內(nèi)體積（Vi）來表示Kd，此時Kd改用Kav，稱可用分配系數(shù)（avaliablecoeffient）：

第50頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月只要測得Vt，V0和Ve，即可計算Kav值。

對于兩種不同分子量和不同Kav值（K‘a(chǎn)v和K’‘a(chǎn)v）的組分,它們的洗脫體積之差：Vs=V'e-V"e=（K'av-K"av）（Vt-V0）

因此,為了完全分開兩種組分,樣品的體積一定不能大于Vs。上面這個式子可以用來計算某一提純過程的最適柱床體積。第51頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月

處理介質(zhì)↓裝柱↓平衡↓上樣↓洗滌↓洗脫↓介質(zhì)再生層析的一般步驟第52頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)利用溶解度差別的分離方法等電點沉淀和pH控制

蛋白質(zhì)處于pI時，凈電荷為零。沉淀溶解度最低

pH>pI蛋白質(zhì)帶電，溶解度較大

pH<pI第53頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第54頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第55頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月1．

不同蛋白質(zhì)

∣

↓

等電點不同

∣

∣

pI時溶解度最低

↓

將蛋白質(zhì)彼此分開第56頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析中性鹽對球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響

低濃度時，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度鹽溶

作用機理：蛋白質(zhì)吸附鹽類離子，帶電表層使蛋白質(zhì)分子被此排斥，蛋白質(zhì)與水分子的作用加強，溶解度提高。

同樣濃度（摩爾數(shù)/升）的兩價離子的中性外，如MgCl2\（NH4）2SO4對蛋白質(zhì)溶解度的影響效果，要比單價離子的中性鹽如NaCl,NH4Cl大得多。第57頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月鹽析－－當離子強度增加到足夠高時，eg.飽和或半飽和程度，很多蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象叫鹽析。

原理－－大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來的溶液中的大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。降低蛋白質(zhì)極性基團與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。鹽析法－－分離、提純常用方法。保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。（NH4）2SO4第58頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月3.有機溶劑分級法第59頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月作用原理：

①.有機溶劑的加入改變了介質(zhì)的介電常數(shù)，增加了兩個相反電荷之間的吸引力，。蛋白質(zhì)的表面可離解基團的離子化程度減弱，水化程度降低，蛋白質(zhì)分子聚集沉淀。

②.有機溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體的形成并沉淀。第60頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月聚乙二醇（水溶性非離子聚合物）可致使蛋白質(zhì)沉淀。

原理：脫去蛋白質(zhì)的水化層；聚乙二醇與蛋白質(zhì)親水基團發(fā)生相互作用，并在空間上阻礙蛋白質(zhì)與水相接近。

蛋白質(zhì)在聚乙二醇中的溶解度與鹽濃度，pH，及絕對溶解度無關(guān)。其溶解度依賴于聚乙二醇的分子量。第61頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月4．溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響。0-40攝氏度大部分球狀蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增大

40-50攝氏度大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定,開始變性

大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定,蛋白質(zhì)的操作在0攝氏度或更低溫度下進行.

第62頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月糜蛋白酶,胰蛋白酶及其前體的制備

第63頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)根據(jù)電荷不同的分離方法根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。

1．電泳

在外電場的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子，將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱電泳(elecctropHoresis)或離子泳(ionpHoresis)。第64頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月

或從方法學(xué)的角度給電泳下定義，電泳是在外電場存在下，利用分子攜帶的凈電荷不同分離分子混合物的一種實驗技術(shù)。電泳技術(shù)可用于氨基酸、肽、蛋曰質(zhì)、核苷酸和核酸等生物分子的分離分析和制備。第65頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月

帶電顆粒在電場中的泳動速度主要決定于它所帶的凈電荷量以及顆粒的大小和形狀。顆粒在電場中發(fā)生泳動時，將受到兩種方向相反的力的作用：

F(電場力)=qE(=qU/s)

Ff(摩擦力)=fv

第66頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月這里，q＝顆粒所帶的電量

E＝電場強度或電勢梯度＝U/q

U＝兩電極間的電勢差(以伏特表示)

S=兩電板之間距離(以厘米表示)

f＝摩擦系數(shù)(與顆粒的形狀，大小和介質(zhì)的粘度有關(guān))

v＝顆粒泳動速度(以厘米／秒表示

第67頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月當顆粒以恒穩(wěn)速度移動時，則F-Ff=0，因此，qE=Fv，即，

v/E=q/f

在一定的介質(zhì)中對其一種蛋白質(zhì)禾說，q/F是一個定值，因而v/E月也是定值，它被稱為遷移率或泳動度：

u=v/E第68頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月

u值可以通過實驗測得，蛋白質(zhì)的u值為0.1*10-4--1.0*10-4厘米2·伏特-1·秒-1。蛋白質(zhì)的泳動度以及pH和離子強度對泳動度的影響都反映某一特定蛋白質(zhì)的特性。因此電泳不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純廈的重要手段而且也是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的一種物理化學(xué)方法。第69頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳基礎(chǔ)：自由電泳（移動界面電泳）

a.先在u-形管內(nèi)使蛋白質(zhì)溶液和緩沖液之間形成清晰的界面

b.加電場

c.由于界面處存在濃度梯度，因而產(chǎn)生折射率梯度。利用光學(xué)系統(tǒng)可以觀察到界面的移動。每個移動界面相當于一個特定蛋白質(zhì)。

第70頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月區(qū)帶電泳

是由于在支持物上電泳時各組分因遷移數(shù)度不同分布成區(qū)帶而得名。

按支持物介質(zhì)的物理性狀：四類區(qū)帶電泳：

1.濾紙電泳.薄膜電泳(醋酸纖維薄膜電泳,薄膜電泳)

2.粉末電泳:淀粉.纖維層.硅膠粉

3.細絲電泳:尼龍絲,人造絲

4.凝膠電泳:聚丙烯酰胺.瓊脂糖凝膠第71頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第72頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第73頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月盤狀電泳在區(qū)帶電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。

支持物－－聚丙烯酰胺凝膠第74頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月三種物理效應(yīng)：1。樣品的濃縮效應(yīng)

2。凝膠對分子的篩選效應(yīng)

3。電泳分離的電荷效應(yīng)樣品分離效果好、分辨率等。第75頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月

等電聚焦（電聚焦）蛋白質(zhì)混合物的分離是在具有pH梯度的介質(zhì)中進行的。

用聚丙烯酰胺代替蔗糖溶液

介質(zhì)固體化、操作方便、分離快

蛋白質(zhì)"聚焦"在等于其等電點的pH點處，形成一個很窄的區(qū)帶。第76頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月雙向電泳--AA混合物一次電泳不能完全分開,將第一次電泳分開的斑點通過支持介質(zhì)間的接觸吸印轉(zhuǎn)移到第二個支持介質(zhì)上,旋轉(zhuǎn)90℃進行第二次電泳,稱雙向電泳.

優(yōu)點:設(shè)備簡單.操作方便,樣品用量少第77頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第78頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月1975年，O’Farrell首先運用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分離出1100多個蛋白點。后來此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前，隨著蛋白組工程的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)越來越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。雙向電泳由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)組成，第一向使等電點不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。第79頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月2．離子交換層析原理：根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的差異將不同蛋白質(zhì)分開。離子交換介質(zhì)：

(1)離子交換樹脂(2)離子交換纖維素(3)SepharoseFastFlow:(4)SepharoseHighPerformance：分辨率較F.F.高(5)Mono:HPLC第80頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月I分類：陰離子交換強度功能基團

+DEAE中等－OCH2CH2NH(CH2CH3)2

+QAE強－OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3陽離子交換強度功能基團CM弱－OCH2COO-SP強－CH2CH2CH2SO3-II選擇：i根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點選擇介質(zhì)ii根據(jù)分離目的選擇介質(zhì)第81頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月例如：

離子交換纖維素――纖維素為交換基質(zhì)原理：具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，吸較大的表面積，大分子可以自由通過優(yōu)點：交換容量大

洗脫條件溫和

回收率高

品種多，選擇范圍廣第82頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月離子交換葡聚糖――基質(zhì)：交聯(lián)葡聚糖

優(yōu)點：交換容量比離子交換纖維素大3－4倍。

能根據(jù)凈電荷

分子大小分離第83頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第84頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第85頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)混合物的分離由

溶液中的鹽離子強度

pH來完成

結(jié)合力小蛋白質(zhì)先由層析柱中洗脫出來

洗脫時保持洗脫劑成分不改變

改變洗脫劑的鹽濃度、PH值第86頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月跳躍式分段改變（分段洗脫）漸進式連續(xù)改變（梯度洗脫）

梯度洗脫優(yōu)點：分離效果好

分辨率高

適合：交換容量小，對鹽敏感的離子交換劑第87頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月兩種混合器:簡單型混合器

復(fù)合型混合器第88頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第89頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月注意的問題：

(1)緩沖液的選擇：陽離子：Tris陰離子：磷酸鹽，檸檬酸鹽(2)介質(zhì)處理：陽離子：Na+型陰離子：Cl-型(3)洗脫：原理：i改變鹽濃度ii改變pH值方式：i分步洗脫ii梯度洗脫(4)介質(zhì)再生第90頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第91頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）蛋白質(zhì)的選擇吸附分離吸附層析--利用吸附力的強弱不同而達到分離的目的。

吸附劑--結(jié)晶磷酸鈣及羥基磷灰石

蛋白質(zhì)分子中帶負電荷的基團，與羥基磷灰石的鈣離子結(jié)合。用磷酸緩沖液

羥基磷灰石--分離核酸：病毒。

活性C硅酸AL2O3磷酸鈣--吸附層析第92頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）根據(jù)對配基的生物學(xué)特異性的分離方法--親和層析基礎(chǔ)：

基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。（它與另一種稱配基的分子能特異而非共價的結(jié)合）

配基：能被生物大分子所識別并于之結(jié)合的原子，原子團，和分子：酶--底物;激素--受體；抗原：抗體。第93頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月原理先把待提純的某一蛋白質(zhì)的特異配基，通過適當?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價的連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面的功能基上，在配基與多糖基質(zhì)間遷入一個連接臂使配基于凝膠之間保持足夠的距離，不改變載體表面的空間位阻妨礙等待分離的大分子與其配基的結(jié)合。

第94頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第95頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月待提純的蛋白質(zhì)樣品+多糖材料

↓

待提純的蛋白質(zhì)樣品與配體

結(jié)合，吸附，在瓊質(zhì)糖顆粒上

↙↘

結(jié)合在柱上的蛋白

其它蛋白

可以用自由配體的

分子溶液脫下來第96頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月1原理：利用蛋白質(zhì)特異性進行分離。2介質(zhì)準備：

載體選擇：Sepharose4BSepharoseCL4B,SepharoseFastFlow,SepharoseHighPerformance

空間臂：偶聯(lián)小分子時需要空間臂，常為雙功能基團，如己二氨或ε－氨基己酸。

第97頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月3配基選擇：

抗原――抗體，酶――抑制劑，酶――底物，激素――受體，金屬結(jié)合蛋白――螯和劑，含巰基蛋白――Hg或含巰基分子，凝集素――糖蛋白4偶聯(lián)：

I溴化氰法：與α－氨基或ε－氨基偶聯(lián)。效率高，反應(yīng)時間短，條件溫和，適于多種蛋白。

II環(huán)氧氯丙烷法：與－NH2,―OH,―SH偶聯(lián)偶聯(lián)時需強烈條件，如pH11，40－50℃，適于特別穩(wěn)定的蛋白第98頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月第99頁，課件共109頁，創(chuàng)作于2023年2月六．蛋白質(zhì)含量的測定與純度的鑒定分析工作：

（一）測定蛋白質(zhì)的總量；

（二）測定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的含量；

（三）鑒定最后制品